BIZYMER ØVELSE 3 BEKÆMP DIN β-lactamase - TEST DIN EGEN MEDICIN! FAGLIG BAGGRUND For at få det maksimale udbytte af denne øvelse er det en forudsætning, at teorien bag enzymer, enzymkinetik og resistensmekanismer er bekendt. Hertil kan bl.a. henvises til kapitlet om antibiotika og resistens i Bioteknologiske Horisonter samt indlægget om enzymkinetik skrevet af Hans Christian Jensen, Ulla Christensen og Jakob Schiødt (tilgængeligt på www.emu.dk).
FRMÅL G BAGGRUND Formålet med øvelsen er at bestemme, hvilke stoffer eller betingelser, der kan hæmme enzymet β-lactamase, og dermed forhindre baterievækst, når der er antibiotika til stede. Dette gøres ved at teste aktiviteten af β-lactamasen på agarplader, der indeholder antibiotikaet ampicillin. Ampicillin er ofte brugt i forskning til at holde uønsket bakterievækst nede. Se faktaboks 1. Når man kloner gener ind i bakterier, kan man bruge resistens til at selektere bakterier. Hvis tilsætning af β-lactamasen tillader bakterievækst, er enzymet aktivt og uhæmmet. FAKTABKS 1 RESISTENS I FRSKNING I forskning kan det til tider være en fordel at gøre sine celler resistente, når man kloner. På denne måde kan man gro dem op i et medie, der indeholder antibiotikum og forhindre alle andre mikroorganismer, der ellers også ville gro under disse omstændigheder, fra at overleve. Figur 1: Grundstrukturen af penicilliner. R er den del af penicillinen, der kan variere. β-lactam-ringen er fremævet med rød. FAKTABKS 2 Β-LACTAMASE β-lactam-ringe er firledede ringe, der udgør kernen i størstedelen af antibiotika, der bliver brugt i dag, inklusiv penicilliner, figur 1. β-lactamase er et enzym der ødelægger denne firledede ring. Udtrykkelsen af dette enzym kan være med til at gøre bakterier resistente over for en bred vifte af forskellige antibiotika. Antibiotika bruges til at bekæmpe bakterielle infektioner. β-lactam antibiotika virker ved at hæmme enzymer, der er ansvarlige for dannelse af bakteriens cellevæg. Disse enzymer hedder transpeptidaser. Ved at hæmme disse enzymer stoppes celledeling, og bakterien dør. Som et forsvar mod β-lactam antibiotika har bakterier videreudviklet den klasse af enzymer, der hedder β-lactamaser. En β-lactamase katalyserer hydrolysen af β-lactam-ringe ved et nukleofilt angreb på carbonyl carbon (angivet med en stjerne i figur 1). Derved åbnes den firledede ring, figur 2. Når β-lactam-ringen er åbnet, har antibiotikaene mistet deres virkning og kan derfor ikke længere hæmme transpeptidaserne (se faktaboks 3 om hydrolse og hydrolaser). 2
FRMÅL G BAGGRUND R NH N S R Beta-lactamase H2 Det er ikke alle bakterier med β-lactamaser, der udgør en sygdomstrussel og derned er patogene. Derimod ved vi, at alle patogene bakterier har β-lactamaser. For at bekæmpe patogene bakterier, benyttes kombinationer af stoffer og/eller der udvikles ny antibiotika. De patogene bakterier er i stand til at forsvare sig mod sådanne tiltag ved at tilpasse det gen, der koder for β-lactamase og dermed det protein, der bliver udtrykt. Denne tilpasning sker enten ved hjælp af mutationer i den β-lactamase, bakterien allerede har, eller ved horisontal gen-overførsel fra en bakterie, der har genet, til en bakterie der ikke har. De nye β-lactamaser har aktivitet på andre substrater og tilpasser sig hurtigt nye miljøer. Bakteriernes primære forsvar mod antibiotika er derfor dannelsen af nye β-lactamaser. Evnen til hurtigt at danne nye β-lactamaser skyldes det evolutionære pres, der påhviler bakterierne for at overleve survival of the fittest bacterium! Det er smart for bakterien, men ikke smart for behandlingen af bakterielle infektioner. Ved at danne nye β-lactamaser bliver bakterierne resistente overfor antibiotika, der før kunne afhjælpe en infektion. Hvis bakterien bliver resistent overfor et bredt spektrum af antibiotika, siges den at være multiresistent. Multiresistente bakterier er et stort problem på bl.a. hospitaler. R NH H NH S R Figur 2: Reaktionen katalyseret af β-lactamase. β-lactamasen katalyserer hydrolosen af β-lactama-ringe. FAKTABKS 3 HYDRLYSE G HYDRLASER Når et molekyle hydrolyseres, spaltes dette molekyle i to vha. et vandmolekyle (af latin, hydro - vand og lysere - spalte). Et enzym, der katalyserer en hydrolyse, hedder en hydrolase. Den tilfældige (spontane) hydrolyse af β-lactamer er meget langsom. For at have bedre chancer for at overleve antibiotika har visse bakterieceller altså udviklet enzymer, der kan øge tempoet hvormed β-lactam-stofferne hydrolyseres. Disse enzymer hedder β-lactamaser. β-lactamaser er altså en underklasse af hydrolaserne. I denne øvelse skal I afprøve aktiviteten af β-lactamasen, når den udsættes for forskellige behandlinger. Det betyder praktisk, at I skal undersøge om β-lactamasen er i stand til at katalysere åbningen af β-lactam-ringen under forskellige betingelser. Dette kan visualiseres ved at undersøge E. colis evne til at overleve på en agarplade, hvor der er tilsat en β-lactam antibiotika i vækstmediet. I skal først udsætte β-lactamasen for forskellige betingelser, der kan ødelægge dens tredimensionelle struktur, tilstoppe dets aktive site, eller på anden vis stresse proteinet kemisk. Efter I har udsat den for bl.a. opvarmning, reduktionsmiddel, denaturant eller proteaser, skal I påsætte små ringe af β-lactamasen (spotte) på pladen i forskellige koncentrationer. Bagefter skal I, ovenpå β-lactamase-spotten, sætte levende E. coli-celler. Hvis der, på trods af at der er væksthæmmer i form af antibiotika i agarmediet, alligevel vokser E. coli kolonier op, der hvor I har spottet β-lactamase, så er β-lactamasen aktiv og kan beskytte E. coli mod ampicillinen, se figur 3 på næste side. 3
FRMÅL G BAGGRUND Figur 3: Pladeassay. Pladeassayet virker som angivet på figuren ovenfor; en LB-agarplade med antibiotika spottes med den β-lactamase, I vil afprøve aktiviteten af. Hvis β- lactamasen er katalytisk aktiv, vil E. coli cellerne, der spottes ovenpå, overleve (øverst). Hvis β-lactamasen er inaktiv, vil I ikke se nogen bakterievækst (nederst). Et typisk resultat af pladeassayet kan se ud som på Figur 4. Her er der i de øvrige forsøg anvendt andre proteiner, der ikke er enzymer og derfor ikke kan angribe ampicillinen. Figur 4: Pladeassay med ikkeβ-lactamaser. Følgende proteiners evne til at katalysere åbningen af β-lactam-ringen blev undersøgt i de angivne koncentrationer (2 μg, 0,2 μg, 0,02 μg og 0,002 μg): β-lactamase (positiv kontrol); ovalbumin; lysozym; og β-lactoglobulin. Det ses af dette pladeassay, at kun β-lactamasen er i stand til at katalysere åbningen af β-lactam-ringen, symboliseret ved de hvide bakteriekolonier. 4
FRMÅL G BAGGRUND Som det kan ses af figur 4, vokser bakterierne gerne, når der tilsættes β-lactamasen (de hvide spots), hvorimod der ikke er nogen bakterier, der kan gro ved de tre andre proteinspots. I kan også bemærke, at der er lavet en serie af forsøg, hvor β-lactamasen er tilsat i forskellig koncentrationer. Hertil skal I bruge en fortyndingsrække. Denne fremstilles som vist i figur 5. Figur 5: Fremstilling af fortyndinger. 5
FREMGANGSMÅDE FREMSTILLING AF AGARPLADER Agaren opvarmes til ca. 60 C enten vha. mikroovn eller vandbad. Hvis mikroovn benyttes, skal I være forsigtige med at bruge for høj effekt over for lang tid, da agaren så vil stødkoge. Vi anbefaler, at I prøver jer frem ved en meget lav frekvens i korte tidsrum. Sæt en streg på jeres petriskåle, der markerer ca. 1 cm fra bunden. Når agaren er varmet op, hælder I det forsigtigt ned i en petriskål, til det når den markerede streg. Petriskålen vil have et låg. Det er den med den største omkreds. Sørg derfor for at hælde agar i bunden. For at undgå at der kommer alt for mange luftbobler i agaren, skal I hælde med en konstant hastighed. Agarpladen stilles til tørring med låget halvt på. Tørringen tager ca. 30 minutter. AKTIVITETSASSAY Mens agarpladerne tørrer, kan I gøre jeres β-lactamase opløsninger klar. Hvert hold undersøger en forudbestemt betingelse samt en bestemmelse efter eget ønske (jeres egen medicin ). Start med at opmærke 10 Eppendorfrør: fem til den forudbestemte betingelse og fem til jeres eget forslag. Fra en udleveret stamopløsning af β- lactamase laves en fortyndingsserie som vist overfor i de fem opmærkede Eppendorfrør. På den måde får I et indtryk af, hvor meget enzym der skal til for, at bakterien vil overleve tilstedeværelsen af antibiotika. BETINGELSER Når I har fremstillet jeres 10 rør, er I klar til at undersøge om β-lactamase kan give vækstbetingelse til bakterierne. I skal derfor undersøge under hvilke betingelser β-lactamasen er katalytisk aktiv, det vil sige kan hydrolysere en β-lactam-ring. Som nævnt tidligere skal dette undersøges ved at teste E. colis overlevelsesevne på β-lactamase spots. Når I har udsat β-lactamasen for den ønskede behandling (se forslagsliste nedenfor), skal I forsigtigt afsætte 5 μl β-lactamase på en agarplade fra hver fortynding, helst så det danner en cirkel. Lad spotten tørre i 5-10 minutter, enten på bordet eller ved at sætte det ind ved 37 C. Efter tørring påsættes 5 μl levende E. coli-celler ovenpå β-lactamase-spotten. Lad igen spotten tørre. Stil (inkuber) pladen ved 37 C natten over eller 48 timer ved stuetemperatur. Efter inkubationen vil det være tydeligt at se, om der er vækst eller ej, og dermed om β-lactamase har bevaret sin katalytiske aktivitet. Der, hvor β-lactamasen ikke er slået ud, men fortsat er aktiv, vil der gro bakterier, så der dannes et tæppe af cellekolonier. Der, hvor β-lactamase er katalytisk inaktiv, vil bakterierne ikke kunne gro. Når man laver forsøg som dette, er det vigtigt at have en positiv og en negativ kontrol. Dette er henholdsvis et forsøg, hvor man er sikker på, at dét stof man bruger virker og sikker på, at det stof man bruger ikke virker. Udtænk, hvordan disse forsøg skal sættes op? DET SKAL I BRUGE: BUFFERE G PLØSNINGER 2 mg/ml β-lactamase opløst i 50 mm fosfatbuffer ph 7 (kan enten købes som frysetørret pulver eller oprenses) 50 mm Tris-HCl ph 7 1 l LB-agar med 100 µg/ml ampicillin tilsat (nok til ca. 20 agarplader) 8 M urea Gentamycin Ampicillin opløst i milli-q vand til 100 mg/ml 1 M β-mercaptoethanol 1 M dithioreitol 0.25 M EDTA Din egen ubekendte faktor/ medicin kun fantasien sætter grænser (kaffe, cola, vaskepulver, sulfo etc) MATERIALE G APPARATUR Petriskåle afhænger af antallet af grupper og antallet af betingelser man ønsker undersøgt 10 µl pipetter, 1 ml pipetter per hold og pipettespidser Eppendorfrør til blandinger E. coli stamme uden B-lactamase aktivitet (f.eks. DH5a ) 37 C varmeskab Evt. varmeblok Mikrobølgeovn Handsker, kitler og sikkerhedsbriller 6
FREMGANGSMÅDE MULIGE BEHANDLINGER AF β-lactamasen TIL AKTIVITETSASSAYET: Hvert hold får én af betingelserne 1-9 samt en valgfri mulighed: 1. Native forhold det vil sige, at β-lactamasen er korrekt foldet og ved ph 7 2. Efter inkubation i 6 M urea i 5 minutter 3. Efter opvarmning til 95 C i fem minutter 4. Efter opvarmning til 95 C i fem minutter tilsat 5 mm β-mercaptoethanol eller DTT (dithiotreitol) 5. β-lactam antibiotika som ampicillin, carbenicillin, spectomycin, gentamycin, kanamycin, etc. 6. Tilsæt en protease, eksempelvis trypsin 7. Tilsæt spyt 8. Din egen medicin (cola, kaffe, opløst vaskepulver, gødning, etc) NEDENSTÅENDE SKEMA UDFYLDES EFTER FRSØGET: BETINGELSE FRTYNDING 1 FRTYNDING 2 FRTYNDING 3 FRTYNDING 4 FRTYNDING 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7
SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN 1. Spørgsmål Var der nogen 1 betingelser der tillod bakterievækst? Hvilke? 2. Spørgsmål Var der nogen 2 betingelser der ikke tillod bakterievækst? Hvilke? 3. Spørgsmål Hvad var begrundelsen 3 for jeres valg af betingelse? 4. Spørgsmål Hvilket forsøg 4 ville du lave for at sikre, at dit forsøg virker? (den postive og den negative kontrol) 5. Spørgsmål Hvad er en 5protease, og hvordan virker den? 6. Spørgsmål Hvorfor tilsætter 6 man ampicillin til agaren? 7. Spørgsmål Hvorledes vil 7 I formode, at ampicillin og gentamycin adskiller sig fra hinanden? 8. Spørgsmål Hvorfor er kun 8 nogle bakterier patogene og andre ikke? 9. Hvordan virker gentamycin? 8
NTER 9