Biofilmdannelse i ledningsnet populationssammensætning i vand- og biofilmprøver

Transkript

1 Biofilmdannelse i ledningsnet populationssammensætning i vand- og biofilmprøver Hans-Jørgen Albrechtsen, Adam C. Martiny*, Erik Arvin & Søren Molin* Institut for Miljø og Ressourcer, *BioCentrum, DTU, hja@er.dtu.dk Indledning Når en drikkevandsforsyning udsættes for en mikrobiel forurening, rejser en række spørgsmål sig, fx: Er der reelt tale om en forurening? Hvor mange mikroorganismer er der? Er der nogen, der er farlige? Hvad laver de? og Hvem er de? Når man så vil svare på disse spørgsmål, må man erkende, at de værktøjer der er til rådighed inden for mikrobiologien, hver især har nogle styrker og nogle svagheder, at ingen af dem giver hele svaret, men at de tilsammen kan bidrage til at give et mere samlet billede af størrelsen og sammensætningen af den mikrobielle population. Til sammenligning kan man fx studere Krøyers maleri Hip Hip Hurra, hvor man jo uden problemer kan tælle antallet af personer på billedet svarende til at tælle antallet af bakterier direkte i mikroskopet. Med en rimelig antagelse om vægten af hver enkelt person kan den samlede biomasse estimeres, men det svarer jo ikke rigtigt på spørgsmålene om, hvad der foregår på billedet, eller om nogen af personerne er farlige eller hvad de laver ikke engang om de er aktive, eller om de overhovedet er levende. Ydermere må man erkende, at den mest anvendte metode til at tælle og isolere bakterier pladespredning er særdeles selektiv, så selv om denne metode har den fordel, at den kun detekterer levende bakterier, så vil kun ca. 1% af alle bakterierne blive talt på denne måde. 35

2 Ønsker man at vide, hvem der er til stede i den mikrobielle population, kan en tilgang være at identificere de enkelte organismer. Svarende til analogien med maleriet vil det være væsentlig information, at en af kvinderne er Anna Ancher, og at Michael Ancher og P.S. Krøyer er blandt mændene. Med baggrundskendskab til disse personer giver deres navne straks indikation af, at her er der tale om et selskab af kunstmalere og med et rimeligt personkendskab kan man ydermere også få en fornemmelse af, hvad de kunne finde på om de er farlige. På samme måde vil identifikation af de væsentligste arter i en population kunne give en indikation af, hvor vidt de er farlige (fx vil påvisning af Legionella straks vække bekymring). Dette er jo naturligvis under forudsætning af, at arten er velbeskrevet og velafgrænset fx ville det i malerianalogien ikke have hjulpet stort at få at vide, at N. Hansen var til stede. Isolering og identifikation klassiske og nye tilgange Den klassiske tilgang til at identificere bakterier har forudsat en isolering (dvs. at man sikrer sig, at man kun har én slags bakterier) og efterfølgende en undersøgelse af, hvilke substrater organismen kunne vokse på, dens størrelse, form osv. Denne isolering vil som regel være stærkt selektiv og afhænge af fx dyrkningstemperatur, substrat og substratkoncentration, ph og inkuberingstid. Dette indikerer, at de organismer vi kender fra drikkevand, kun udgør et ganske lille udsnit af populationen, og at de sandsynligvis ikke er repræsentative. Med udvikling af moderne DNA-teknikker kan man lave en direkte ekstraktion af DNA et (dvs. det genetiske arvemateriale) fra en vandeller biofilmprøve, og dermed fra alle bakterierne i prøven, og på denne måde undgå at være selektiv. For at undersøge, hvilke arter der er til stede i denne DNA-blanding, kan en del af DNA et populært sagt klip- 36

3 pes i stykker med forskellig længde ved hjælp af et restriktionsenzym. Disse stykker klones eller splejses ind i hver sin E. coli, det vil sige at DNA-stykket sættes ind i E. coli-bakteriens DNA. Disse E. coli udspredes på en agarplade og opformeres, så man får opformeret hvert enkelt DNA-stykke. Hver enkelt E. coli-koloni analyseres så for de indsplejsede DNA- (eller mere præcist 16S rrna-) sekvenser, der er markeret med en markør, dette kaldes et klonbibliotek. Sekvenserne sammenlignes med tilsvarende sekvenser i en database, og et match med en sekvens i databasen fører til identifikation. Denne DNA-teknik vil imidlertid først og fremmest vise de dominerende arter, da det naturligvis vil være DNA fra de bakterier der er flest af, der hyppigst vil blive klonet ind i E. coli. Denne metode er således ikke egnet til at søge efter forekomst af patogener, (sygdomsfremkaldende) mikroorganismer, da de som regel kun vil udgøre en meget lille fraktion af populationen. Undersøgelse i modelledningsnet Undersøgelserne (Martiny et al., 2003, 2004) blev udført i et modelledningsnet på DTU (Boe-Hansen et al., 2002, 2003) opbygget i rustfrit stål og med tilledning af kommunalt drikkevand. Ledningsnettet var opbygget i firkantede rør med 72 testpropper, der kan udtages og undersøges for biofilm. Nogle af disse testpropper har siddet i systemet i over 1000 døgn og repræsenterer således en rimeligt gammel biofilm. Påvisning af bakterier ikke tidligere observeret i drikkevand Direkte DNA-ekstraktion af prøver fra dette modelledningsnet påviste 37

4 tilstedeværelse af bakterier fra 12 forskellige phyla (dvs. rækker inden for bakteriesystematikken), bl.a. Acidobacteria, Nitrospirae, Planctomycetes og Verrucomicrobia. Mellem 11 og 23% af bakterierne tilhørte disse phyla, hvoraf nogle ikke tidligere er blevet påvist i drikkevand (Tabel 1). Andre bakteriegrupper, som fx Pseudomonas, udgjorde kun en lille andel, 1-6%. Dette er, i modsætning til tidligere undersøgelser af sammensætning af bakteriepopulationer i danske vandforsyninger, baseret på traditionelle dyrknings-, isolerings- og identifikationsmetoder, der fandt, at Pseudomonas udgjorde 34-66% (Bonde & Beck, 1983). Aquabacterium, som dominerede den mikrobielle population i Berlins vandforsyning (Manz et al., 1993), udgjorde 2-11% i vores undersøgelse, men forekom kun i nogle af prøverne. En anden interessant observation var, at størstedelen af bakterierne, der hører til Acidobacteria-gruppen (14% i den gamle biofilm), havde størst lighed i databasen med en række andre uidentificerede bakterier isoleret fra jordprøver. Sådanne informationer kan måske bruges til at fortolke, hvor bakterierne i ledningsnettet kommer fra, og i hvert fald indikerer det ikke umiddelbart, at bakterierne i ledningsnettet er fuldstændig forskellige fra bakterier i andre, omgivende miljøer. Den mest dominerende bakteriesekvens fra ældre biofilm (5-27%) og vandfasen (30-40%) var knyttet til Nitrospira gruppe II, om end de organismer der er isoleret fra dette system, udgjorde deres egen selvstændige line, som ikke fandtes i databaserne. Nitrospira-gruppen omfatter nitrifikanter, det vil sige, at de oxiderer nitrit til nitrat som energikilde (autotrofe), og vil derfor ikke normalt vokse på pladespredningssubstrater, da de primært udgøres af organiske substrater. Med andre ord vil denne væsentlige population ikke detekteres med de sædvanlige metoder og vil derfor være usynlig. 38

5 % af sekvenser fra Direkte ekstraktion R2A agar Phylum Biofilm Vand Slægt Biofilm (n=97) Vand (n=74) Ung (n=56) Gammel (n=87) (n=85) Proteobacteria Brevundimonas - 6, Devosia/Rhodobium 75, ,2 Hydrogenophaga - 18, Aquabacterium - 10,8 1,8 - - Luteimonas 24, Legionella ,5 Methylomonas ,4 Pseudomonas - 1,4 3,6 5,7 1,2 Thiobacillus ,1 2,4 Acidobacteria Acidobacterium ,8 5,9 Planctomycetes Planctomyces - - 5,4 9,2 4,7 Nitrospirae Nitrospira ,0 25,3 38,8 Ukendt ,3 3,4 - Verrucomicrobia Verrucomicrobium - - 5,4 - - Ikke identificeret 1,0 47, Genera ikke listet 0 14,8 19,5 41,5 39,9 Tabel 1. Relativ forekomst af bakterier isoleret på R2A-agar og fra klonbibliotek. I parentes angiver n det totale antal af isolater eller kloner fra hver kilde. Ung biofilm: døgn, og gammel biofilm: døgn (Martiny et al., 2005). 39

6 Nitrifikation For at undersøge om der reelt forekom en nitrifikation i systemet, blev omsætning af nitrit fulgt i vandprøver fra indløb og udløb fra modelledningsnettet, i biofilm afskrabet fra modelledningsnettet og suspenderet i vand fra udløbet (Biofilm), samt i en autoklaveret kontrol (Figur 1). Forsøget blev sat op ved realistiske lave nitritkoncentrationer 10 µm (~ 0,46 mg/l), dvs. lidt højere end grænseværdien (0,1 mg/l), og forsøget viste, at der var en tydelig omsætning af nitrit, og at det var en biologisk proces. Det er imidlertid ikke afklaret, hvor nitritten kommer fra, men den kunne udvaskes fra det nitrificerende sandfilter eller måske været resultat af en reduktion af nitrat til nitrit i forbindelse med korrosion af jernrør. Figur 1. Omsætning af nitrit i vandprøver fra indløb (Inlet) og udløb (Outlet) fra modelledningsnettet, i biofilm afskrabet fra modelledningsnettet og suspenderet i vand fra udløbet (Biofilm) samt i en autoklaveret kontrol (Martiny et al., 2005). 40

7 Sammenligning mellem vandfase og biofilm Ved hjælp af klonbiblioteker blev prøver fra modelledningsnettet analyseret for sammensætning af den mikrobielle population i biofilm og vandfase. Der blev dels analyseret DNA ekstraheret fra bakterier isoleret med klassiske pladespredningsteknik på R2A-agar og dels analyseret DNA-prøver ekstraheret direkte fra vandprøver (bulk) eller fra biofilm. Det første resultat fra denne undersøgelse var, at sammensætningen af de populationer, der fremkommer ved isolering ved hjælp af vækst på agarplader (R2A) er helt anderledes, end hvad der fremkommer ved direkte ekstraktion (Figur 2 og Tabel 1). Med andre ord er de bakterier, der fremkommer på agarplader, kun i meget begrænset omfang repræsentative for den virkelige population. Bakterierne isoleret fra agarplader repræsenterer stort set kun en enkelt systematisk underklasse: Proteobacteria, hvorimod en lang række andre underklasser, som dominerer populationen, slet ikke er repræsenteret. Det andet resultat af undersøgelsen var, at der var markant forskel i sammensætningen af populationen i vandfasen og i biofilmen. Dette betyder, at bakterierne i biofilmen altså ikke bare er bakterier fra vandfasen, der har sat sig fast på rørvæggen. Analyser af vandprøver repræsenterer således ikke hele ledningsnettes population, og der kan være bakterier i systemet, som udfører væsentlige processer, men som ikke registreres med en vandprøve. 41

8 Figur 2. Den relative forekomst af bakteriegrupper (phyla) i bakterier isoleret på agarplader (R2A) og fra klonbibliotek baseret på 16S rrna sekvensanalyse. Nogle isolater kunne ikke identificeres, hvorfor nogle søjler udgør mindre end 100%. Ung (young) biofilm: døgn, og gammel (old) biofilm: døgn (Martiny et al., 2005). Konklusioner Bakterieisolater fra traditionelle metoder som agarplader afspejler kun i ringe grad den mikrobielle diversitet og sammensætning De mikrobielle populationer i vandforsyningssystemer er komplekse med mange hidtil ukendte arter, og med andre arter som dominerende, end hvad vi hidtil har troet Nitrospira (autotrof nitrit-oxiderende) udgør en væsentlig del af populationen 42

9 Der er tydelig forskel i sammensætning af mikrobielle populationer i vandfase og biofilm Referencer Boe-Hansen, R, Martiny, A.C., Arvin, E., & Albrechtsen, H.-J., 2003: Monitoring biofilm formation and activity in drinking water distribution networks under oligotrophic conditions. Water Science & Technology, 47 (5) Boe-Hansen, R., Albrechtsen, H.-J., Arvin, E. & Jørgensen, C. 2002: Bakterievækst i drikkevand Undersøgelser i et modelledningsnet (Bacterial growth in drinking water - Experiments in a model distribution system, In Danish). Vandforsyningsteknik, 51, Dansk Vand- og spildevandsforening, Århus. Bonde, G.J., & J. Beck,1983: Delrapport 4: Bakteriologiske undersøgelser af prøver fra pilotanlæg i: Beck J. Organiske forbindelser i drikkevand. Teknisk Forlag as. Manz, W., U. Szewzyk, P. Ericsson, R. Amann, K.-H. Schleifer & T.-A. Stenstrom. 1993: In situ identification of bacteria in drinking water and adjoining biofilms by hybridization with 16S and 23S rrna- directed fluorescent oligonucleotide probes. Applied and Environmental Microbiology 59: Martiny, A.C., H.-J. Albrechtsen, E. Arvin & S. Molin, 2005: Identification of bacteria in biofilm and bulk water samples from a nonchlorinated model drinking water distribution system: Detection of a large nitriteoxidizing population associated with Nitrospira spp. Applied and Environmental Microbiology, 71 (12) Martiny, A.C. T.M. Jørgensen, H.-J. Albrechtsen, E. Arvin & S. Molin, 2003: Long-term succession in structure and diversity of a biofilm formed in a model drinking water distribution system. Applied and Environmental Microbiology (11) p