ISO/IDF- Metoder i det Mikrobiologiske Laboratorium Susanne Nielsen www.eurofins.com
MEJERITEKNISK SELSKAB D. 28. MAJ 2015 Hvad er IDF Standardisering af Mikrobiologiske Metoder Udvikling af en Analyse Standard Igangværende og måske kommende projekter Hvorfor Standardisering Source presentation EDR: Source modification date: 09/06/2009 2
MEJERITEKNISK SELSKAB D. 28. MAJ 2015 FIL-IDF: Federation Internationale de Laiterie- International Dairy Federation Uafhængig, non-profit, non- politisk Forening Grundlagt i 1903 i Bruxelles i forbindelse med den første Internationale Mejeri Kongres Arbejdsområder: Animal health and welfare Dairy Science and Technology Economics, Policies and Marketing Environment Farm Management Food Standards Hygiene and Safety Methods of Analysis and Sampling Nutrition Source presentation EDR: Source modification date: 09/06/2009 3
IDF er organiseret i National Kommitéer Den Danske National Komité s formål er omdrejningspunktet for nationale input til IDF viderebringer resultatet af arbejdet i FIL-IDF Danmark nominerer repræsentanter til IDF's stående komitéer virker til at fremme IDF inden for mejeriindustrien er ansvarlig for at formidle det nationale bidrag til IDF's finansiering (via Mejeriforeningen) Sekræter for den danske kommitè: Sanne Bastholm Rasmussen sba@lf.dk PT er 46 lande medlemmer og repræsenteret ved en National Komité F.eks. Zimbabwe, Mongoliet og Norge Under National Komitéen er en række arbejdsgrupper 4
IDF s organisation Science and Programme Coordination Committee SPCC Methods Standards Steering Group MSSG Food Standards Steering Group FSSG SCHMM Harmonization of Microbiological Methods SCAMDM Analytical Methods for Dairy Microorganisms PG D07 Lb casei/paracasei PG D06 QUA LAB Flowcytometri 5
Standardisering og harmonisering af Mikrobiologiske Metoder FIL-IDF ISO CEN 6
Udvikling af en Analyse Standard Stage 0: Undersøgelse af et emne, f.eks en ny analyse teknik, som endnu ikke er klar til de næste trin Stage 1: New Work Item (NWI) Forslag til ny metode sendes typisk fra en National komité til IDF Forslaget skal indeholde en Working Draft eller min. en klar beskrivelse OG forslag til Projektleder NWI accepteres efter afstemning Krav: Min. 50% af medlemslandene skal svare på afstemningen og min. 50% af svarene skal være positive Stage 2: Udabejdelse af Committee Draft (CD) og fremsendelse til kommentering bland Projektgruppens medlemmer og SC Bearbejdning af kommentarer, udarbejdelse af rapport med indkomne kommentarer og PL s svar på kommentarer, planlægning af et Interlaboratory study til fastlæggelse af præcisionsdata Stage 2 slutter når resultaterne fra dette studie er godkendt af PG og SC 7
Interlaboratory Study 2007 ISO 22964 Detection of Cronobacter spp. ESIA CSB mdfi ESPM ESIA 67 prøver CB- 44 C CB- 41,5 C mdfi ESPM ESIA mdfi 804 resultater x 12 laboratorier 9648 resultater! ESPM mlst ESIA mdfi ESPM 8
I 2013 ny ILS med Standardens endelige media Milk based Infant Formula Soy based Infant Formula Lactose Starch Environmental Samples 9
Stage 3: EN Draft International Standard (DIS) udarbejdes på engelsk og evt. fransk DIS sendes til National Komitéer for godkendelse IDF og ISO udarbejder rapporter der inkluderer alle indkomne kommentarer Stage 3 afsluttes med at PL sender den godkendte og afsluttede DIS (nu FDIS) sammen med kommentarer og svar til IDF s og ISO s sekretariat Stage 4: Iht. ISO procedurer skal FDIS til afstemning internt i ISO før udgivelse Der afgives ja/nej stemme og kun stavefejl/trykfejl kan rettes IDF godkender DIS versioner til direkte udgivelse Stage 5: Standarden gennemgåes en sidste gang for trykfejl etc. hvorefter den udgives. Projektgruppen nedlægges herefter Review: Senest 3 år efter udgivelse skal Standarden revurderes og herefter hvert 5. år 10
11
Igangværende projekter 2 Stående komitéer: SCAMDM: Analytical Methods for Dairy Microorganisms- de gode bakterier SCHMM: Harmonization of Microbiological Methods- de onde bakterier 12
SCAMDM Igangværende Projekter Project D06 PL : S Casani (DK) Quantification of Lactic acid bacteria by Flow Cytometry Project D07 PL : G Fischer (DE) and A Galat (FR) Enumeration of Lactobacillus casei/paracasei in fermented milks and starter cultures NWI Project D08 PL : TBD PL Report Quantification of LAB (Lactic acid bacteria) by use of qpcr or v-qpcr Project D09 PL : T Odamaki (JP) PL Report Revision of ISO 29981 IDF 220 Enumeration of bifidobacteria 13
Forslag til revision af ISO 22981/IDF 220 Enumeration of presumptive Bifidobacteria Our results suggested that the suspension conditions including diluents, retention time and shaking had much impact on enumeration of bifidobacteria. We found that in comparison to ISO 29981 IDF 220 method, lower temperature for suspension without retention and shaking with a rotary blender using Mitsuoka s buffer, a diluent devised and reported by Professor Mitsuoka who received IDF Elie Metchnikoff Prize 2007, could provide stable and adequate counts for enumeration of bifidobacteria. - Brug Mitsuoka s buffer i stedet for Ringers - Temperatur under opløsning skal være 35 C - Brug blender til opløsning Til næste gang : - Lav sammenligning mellem Mitsuoka s buffer og MRD istedet for Ringers (som ingen bruger) - Start med -2 fortynding for at få bedre opløsning istedet for at bruge en blender 14
SCHMM Igangværende Projekter Project H03 IDF representative: H Joosten (CH) ISO/TS 22964 IDF/RM 210. (revision to horizontal IS) New title: Detection of Cronobacter spp.) CEN TC275 WG6 TAG 14 (Revision of EN ISO 22964) Ny standard senest Oktober 2016 Project H17 IDF representative & PG co-convenor: B Gerten ISO/TC 34/SC 9-WG 16 - Yeasts and moulds (Revision of EN ISO 21527-1/-2) Ask SC5/IDF delegates about the possible change in ISO 6611 of YGC to DRBC Decide to perform the revision with these recommendations: Base the revision on previous ISO 7954 from SC9 or ISO 6611 from SC5, and update all parts such media performance, if we take ISO 6611 we can harmonize with SC5. choose between DRBC or YGC, choose between surface inoculation or pour plate, maintain a general assay with YGC/DRBC and put an annex for DG18 and products for aw between 0.95 and 0.6 For product below aw<0.6, Management? No real media For WG3, data of validation are enough or not to establish this standard. 15
Project new (tbd) IDF representative: TBD ISO/TC 34/SC 9-WG 20 Confirmation of Bacillus cereus (Revision of EN ISO 7932) Project new (tbd) IDF representative: TBD ISO/TC 34/SC 9-WG 26 Detection of Clostridium botulinum toxins Den selektive opformering udgår 16
Does ISO/TC34/SC9 agree with following WG 20 proposal: - To not include additional tests for differentiation of Bacillus thuringiensis from presumptive B. cereus in the revision of ISO 7932; - To not include additional tests for confirmation of B. cereus sensu stricto; - To investigate possible additional tests to identify pathogenicity of presumptive B. cereus colonies. Proposed recommendations to be approved by ISO/TC 34/SC 9 To revise EN ISO 7932:2004 by adding in the confirmation stage PCR detection of 2 specific genes, as optional tests on isolated colonies: - Cytk1, specific of the new B. cytotoxicus species, an emerging and virulent pathogen from the B. cereus group; - Cereulide genes, harboured by emetic toxin producing strains of B. cereus (sensu lato). Benefits and limitations of such additional tests should be added in the standard. 17
Problem: Tilstedeværelsen af visse Mælkesyrebakterier og Bifidobakterier hæmmer væksten af Enterobacteriaceae, Cronobacter spp., Salmonella spp Improvement of enrichment procedure for Enterobacteriaceae (incl. Salmonella and Cronobacter). Previous work with an alternative buffer (tricine) addition of iron citrate and application of a higher initial ph was unsuccessful. Poor recovery was associated with strong acidification (final ph often below <5) A new pre-enrichment broth is proposed based on BPW with a six-fold increased phosphate buffer strength ( xsbpw ) Study of growth kinetics of Salmonella and Cronobacter in xsbpw shows major improvement. LOD50 values below 1 cell per 25 g sample were obtained with the most demanding matrices Cost xsbpw similar to that of double strength BPW Variability of growth potential among different Enterobacteriaceae raises concern about current validation requirements 18
Revideret standard forventes ved udgang 2016 Væsentligste ændringer: Inkubationstider, herunder mulighed for inkubation af hel Fraser i 24 timer i stedet for 48, såfremt fokus er Listeria monocytogenes Konfirmerings og identifikations trin Præcisionsdata fra ILS fremgår af standarden 19
Hvorfor er standardiserede analysemetoder en god idé? - Et analyseresultat er en funktion af forekomst og fordeling af den givne parameter, den anvendte metode og metodens usikkerhed - Et mikrobiologisk kriterie bør altid bestå af en fastsat værdi og en analysemetode BEK om mælkeprodukter m.v. Nr. 2 af 04/01/2013 20
Case: Bestemmelse af L. delbrueckii subsp. bulgaricus i fermenteret produkt. Metode: ISO 7889/IDF 117:2003 Problem: Udover L. delbrueckii subsp. bulgaricus indeholdt produkt også L. acidophilus L. acidophilus vokser udmærket i substratet og kolonier ligner Løsning: Udfør MALDI-TOF identifikation på 5-10 kolonier Resultat: Alle kolonier (20 ialt) blev identificeret som L. rhamnosus! MALDI-TOF resultat blev efterfølgende konfirmeret ved 16S seq 21
Case: E. coli 22
Case: Aerobe sporedannere Problem: Kunde hævder vi finder væsentligt færre sporedannere end de selv og deres kunde gør i udvalgte produkter 3 metoder: Metode FVST 2007 NMKL 189 Forbehandling Tyskmetode 80 C/ 10 min 80 C/ 10 min 80 C/ 10 min Udsæd Substrat Inkubations tid overflade Blodagar 6 døgn 30 overflade Blodagar 8 døgn 30 overflade TSA 3 døgn 30 Inkubations temp. 23
Analyseresultater metode sammenligning Aerobe mesofile sporedannere/g Prøve FVST 2007 NMKL 189 Tysk metode 1 270 230 420 2 270 300 390 3 370 520 530 4 380 150 560 5 200 220 310 6 440 370 770 24
Tilsyneladende overensstemmende resultater- men stadigvæk for lavt- nu på alle metoder Prøve ph i 10% opl. Aerobe sporer cfu/g, FVST 2007 10 g prøve 1a + 90 g SPO 4,36 310 10 g prøve 1a + 90 g BPW 6,66 4600 10 g prøve 1b + 90 g SPO 4,36 190 10 g prøve 1b + 90 g BPW 6,66 3600 10 g prøve 1c + 90 g SPO 4,36 150 10 g prøve 1c + 90 g BPW 6,66 3800 10 g prøve 2 + 90 g SPO 5,36 7400 10 g prøve 2 + 90 g BPW 6,56 6300 25
26
ISO-IDF metoder er referencemetoder Brug kun alternative metoder der er valideret iht. ISO 16140 eller tilsvarende overfor referencemetoden Når du udarbejder specifikationer for dine produkter: Referer til analysestandard Vær specifik vedr. - Prøveudtagning- repræsentativ, kun overflade, kun indre etc. - Prøveforberedelse Vær bevidst om de kritiske step i metoden 27
TAK FOR OPMÆRKSOMHEDEN 28