TOP2A FISH pharmdx kit Kode K5333

101752-001 / 20-01-03 TOP2A FISH pharmdx kit Kode K5333 3. udgave Til in vitro-diagnostisk brug Kittet indeholder reagenser til 20 analyser. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 1/35

Indhold Side Tilsigtet anvendelse...3 Resumé og forklaring...3 Procedurens princip...4 Reagenser...4 Medfølgende materialer...4 Nødvendige materialer, der ikke medfølger...5 Forholdsregler...6 Opbevaring...7 Klargøring af præparater...7 Paraffinindstøbte snit...7 BRUGSANVISNING...8 A. Klargøring af reagens...8 A.1 Pre-Treatment Solution...8 A.2 Stringent Wash Buffer...8 A.3 Wash Buffer...8 A.4 Ethanolserie...8 B. Farvningsprocedure...8 B.1 Bemærkninger til proceduren...8 B.2 Behandling af vævsprøver før farvning...9 B.3 Farvningsprotokol...9 Kvalitetskontrol...11 Fortolkning af farvning...11 Begrænsninger...13 Generelle begrænsninger...13 Produktegenskaber...13 Hybridiseringseffektivitet...13 Analysesensitivitet...13 Analysespecificitet...14 Analyse af normalt væv...14 Robusthedsundersøgelser...14 Repetérbarhed...14 Reproducérbarhed...15 Analyseportabilitet...16 Resultater...17 Klinisk anvendelighed...17 Pilotforsøg...18 Bekræftende forsøg - DBCG 89D/TOP2A...18 Forsøgsdesign...18 Statistiske metoder...19 Resultater...19 Diskussion og konklusion...26 Fejlfinding...27 Bilag 1...29 Bilag 2...30 Bilag 3...31 Referencer...32 Förklaring av symboler...35 (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 2/35

Tilsigtet anvendelse Til in vitro-diagnostisk brug TOP2A FISH pharmdx kittet er beregnet til detektering af amplifikation og deletion (ændringer i koncentration) af TOP2A-genet ved hjælp af fluorescens in situ hybridiseringsteknik (FISH) på formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver fra human brystkræft. Deletion og amplifikation af TOP2A-genet udgør en markør for en dårlig prognose for brystkræftpatienter i højrisikogruppen. TOP2A-genamplifikation, detekteret af TOP2A FISH pharmdx kittet, er ligeledes indiceret som en hjælp til at forudsige recidivfri overlevelse hos brystkræftpatienter i højrisikogruppen, der behandles med adjuverende epirubicin-baseret kemoterapi. Resultaterne fra TOP2A FISH pharmdx kittet er beregnet til brug som supplement til eksisterende klinisk og patologisk information. Resumé og forklaring TOP2A-genet koder for enzymet topoisomerase IIα (topo IIα), som katalyserer kløvning og samling af dobbeltstrenget DNA, hvilket fører til relaxering af DNA-supercoils. Type II topoisomeraser er essentielle enzymer, som omdanner topologiske former af DNA ved at lave forbigående dobbeltstrengede kløvninger i DNAs backbone (1). Disse enzymer spiller en vigtig rolle i en lang række grundlæggende, nukleære processer (2), herunder DNA-replikation, -transkription, -kromosomstruktur, -kondensering og -segregering (3). Topoisomerase IIα-genet, TOP2A, findes i 2 eksemplarer i alle normale diploide celler og er lokaliseret i kromosom 17q21 (4). TOP2A-genet rækker over et område på ca. 27,5 kb og indeholder 35 exoner, der koder et 170 kda-protein (5). Topo IIα proteinet er anerkendt som proliferationsmarkør, og ekspressionen af topo IIα varierer i løbet af cellecyklussen både i normale celler og i cancerceller (6). Ekspression af topo IIα i brysttumorer er korreleret med Ki-67-ekspression (7 10). Der er ikke fundet noget enkelt forhold for topo IIα på protein- og genniveau (7, 9, 10). Kun 20 % af tilfældene med overekspression af proteinet topo IIα har TOP2A-genamplifikation, men 93 % af tilfældene med TOP2Agenamplifikation har overekspression af topo IIα (11). Der er tilsyneladende flere faktorer, som bidrager til topo IIα overekspression, både den cancerspecifikke amplifikation og den forhøjede celleproliferationsrate. Proteinerne Ki-67 og topo IIα udtrykkes parallelt, hvilket kan fortolkes som en bekræftelse af celleproliferationsratens indflydelse på ekspression af topo IIα, selv i tilfælde med TOP2A-amplifikation (12). Type II topoisomeraser er mål for antracykliner, såsom doxorubicin og epirubicin, som også betegnes topoisomerasehæmmere (13 15). HER2-status som prædiktiv markør for antracykliner er et kontroversielt emne, og det har været påpeget, at den biologiske basis for denne sammenhæng mangler. Det har desuden været diskuteret, om man i stedet for skal se HER2 som en surrogatmarkør eller pseudomarkør for det reelle antracyklinmål, topoisomerase II (16 18). Det er påvist, at koncentrationen af TOP2A påvirker tumorens sensitivitet over for topoisomerasehæmmere (16 28). Dako TOP2A FISH pharmdx kittets kliniske effektivitet har været undersøgt i to forsøg, som blev gennemført af Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) i København (21, 29, 30). Det seneste forsøg (21, 30) rapporterer TOP2A-genamplifikation i ca. 10 % af brystcancertilfældene og deletion med samme hyppighed, når både de HER2-positive og - negative tumorer medtages i forsøgene. Oprindeligt antog man, at anormale TOP2Agenkoncentrationer (som resultat af amplifikation eller deletion) var begrænset til HER2- amplificerede tumorer (16, 31). For nylig har man detekteret ændringer af TOP2Agenkoncentrationen i tumorprøver med normal HER2-genstatus (21, 23, 29, 30, 32, 33). I DBCG-forsøget fandt man TOP2A-ændringer i næsten 60 % af HER2-amplificerede primære brysttumorer, mens 20 % af de TOP2A anormale tumorer havde normal HER2-status (21, 23, 29, 30, 32). Forsøget er blevet bekræftet af et canadisk forsøg, der viste, at TOP2A-genstatus (amplifikation eller deletion) er en signifikant prædiktiv faktor for responsen på behandling med (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 3/35

epirubicin-baseret kemoterapi (23). Ca. 35 % af patienterne i dette forsøg havde HER2- amplificerede tumorer, og man fandt en statistisk signifikant forbindelse mellem HER2-status og TOP2A-afvigelser (23, 34). Langt de fleste undersøgelser af TOP2A-genafvigelser har været samstemmende med hensyn til den prædiktive værdi af TOP2A-analyser (21 25, 30), i modsætning til de mere uoverensstemmende resultater med HER2-analyser (35). Selvom HER2- og TOP2A-genet sidder i den samme amplikon, og visse undersøgelser har fokuseret på genernes coamplifikation (22, 24, 25), har DBCG 89D og andre forsøg vist, at generne skal ses uafhængigt af hinanden og analyseres hver for sig (10, 20, 21, 26 30). Procedurens princip TOP2A FISH pharmdx kittet indeholder alle nøglereagenser, som er nødvendige for at udføre en FISH-procedure på rutinemæssigt behandlede, formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i Pre-Treatment Solution i 10 minutter. Næste trin er en proteolytisk nedbrydning med brugsklar Pepsin ved stuetemperatur i 5 15 minutter. Efter opvarmningen og den proteolytiske forbehandling anvender kittet en brugsklar FISH Probe Mix, baseret på en kombination af PNA (peptidnukleinsyre) (36) og DNAteknologi. Denne Probe Mix består af en blanding af Texas Red-mærket DNA kosmidkloner, der dækker i alt 228 kb af TOP2A-amplikonen, og en blanding af fluoresceinmærkede PNA-prober rettet mod den centromeriske region af kromosom 17. Den specifikke hybridisering til de to mål resulterer i dannelse af et markant rødt fluorescerende signal på hver TOP2A-amplikon og et markant grønt fluorescerende signal på hver centromerisk region af kromosom 17. Probe Mix en indeholder desuden umærkede PNA-blokeringsprober for at mindske baggrundsfarvning. Efter en stringensvask monteres præparaterne med fluorescerende monteringsmedium, der indeholder DAPI, og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et fluorescensmikroskop med egnede filtre (se Bilag 3). Cancercellerne lokaliseres og evalueres derefter med hensyn til TOP2A/CEN-17-signalforhold. Normale celler i det analyserede vævssnit tjener som en intern positiv kontrol af forbehandlingens og hybridiseringens effektivitet. Se yderligere oplysninger i afsnittet Fortolkning af farvning. TOP2A FISH pharmdx kit, kode K5333, kan anvendes til manuel farvning. Reagenser Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 250 µl pr. objektglas af flaske 2 (5 8 dråber), 10 µl pr. objektglas af flaske 3 og 15 µl pr. objektglas af flaske 5. Opløsningerne i flaske 3 og 5 er tyktflydende og skal muligvis centrifugeres kortvarigt i en mikrocentrifuge, så alt reagenset kan blive anvendt. Kittet indeholder materialer til 10 individuelle farvningskørsler. TOP2A FISH pharmdx kittet fremsendes på tøris. Som en kontrol af at kittets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af kittets komponenter muligvis ikke er frosne. Dette vil ikke indvirke på TOP2A FISH pharmdx kittets funktion. Flaske 1 Flaske 2 Pre-Treatment Solution (20x) 75 ml, koncentreret 20x MES (2-[N-morpholin]-ethansulfonsyre) buffer. Pepsin 5 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0. Indeholder stabilisator og et (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 4/35

Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Flaske 6 antimikrobielt stof. TOP2A/CEN-17 Probe Mix 0,2 ml, brugsklar Blanding af Texas Red-mærkede TOP2A DNA-prober og fluoresceinmærkede CEN-17 PNA-prober, leveret i hybridiseringsbuffer med 45 % formamid, stabilisator og umærkede PNA-blokerende prober. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, koncentreret 20x SSC (saltvand-natriumcitrat) buffer med vaskemiddel. Fluorescence Mounting Medium 0,3 ml, brugsklar Fluorescerende monteringsmedium med 100 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-phenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, koncentreret 20x Tris/HCl-buffer. Coverslip Sealant 1 tube, brugsklar Opløsning til aftagelig forsegling af dækglas. BEMÆRK: Alle reagenser, inkl. Pre-Treatment Solution, Stringent Wash Buffer og Fluorescence Mounting Medium, er fremstillet specifikt til brug med dette kit. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke udskiftes med andre. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96 % Xylen eller xylenerstatninger Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justérbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område: 37 100 C) Kalibreret overfladetermometer (område: 37 100 C) Dækglas (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (kode S2450/S2451)* Pincet Stinkskab Mikrocentrifuge (bordcentrifuge til centrifugering af probe og monteringsmedium) Objektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-l-lysin-coatede objektglas (se Klargøring af præparater) Farvningskar eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2 15 minutter) (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 5/35

Vandbad med låg (der kan holde en temperatur på 65 (±2) C til 99 C) * Der kan anvendes varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (82 (±2) C) og hybridisering (45 (±2) C) sammen med et fugtkammer til hybridisering. Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbelt filter eller FITC og Texas Red enkeltfiltre se yderligere oplysninger i Bilag 3. Fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære anbefales. Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende). Forholdsregler 1. Anvendes til in vitro-diagnostik. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), indeholder 1 <20 % 2-morpholin-ethansulfonsyre. Flaske 2, Pepsin, indeholder 5 10 % propan-2-ol. Flaske 4, Stringent Wash Buffer (20x), indeholder 1 <5 % octoxinol. Flaske 6, Wash Buffer (20x), indeholder 1 <20 % trometamol. Disse stoffer kræver ingen faremærkning ved de pågældende koncentrationer. Sikkerhedsdatablade (MSDS er) til professionelle brugere kan rekvireres. 4. Flaske 2, Pepsin, indeholder pepsin A, som kan medføre en allergisk reaktion. 5. Flaske 3, TOP2A/CEN-17 Probe Mix, indeholder 45 % formamid og er mærket: Giftigt. R61 Kan give fosterskader. S45 Ved uheld eller ved ildebefindende skal der straks søges lægehjælp (vis etiketten, hvis det er muligt). S53 Undgå enhver kontakt indhent særlige anvisninger inden brug. S60 Dette materiale og emballagen skal bortskaffes som farligt affald. Generelt gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i korrekt arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger iht. EUs direktiv 94/33/EF. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (MSDS). 6. Coverslip Sealant indeholder 60 100 % nafta (petroleum), hydrogenbehandlet lys, og er mærket: Yderst brandfarligt. Miljøfarligt. R11 Meget brandfarlig. R51/53 Giftig for organismer, der lever i vand; kan forårsage uønskede langtidsvirkninger i vandmiljøet. S9 Emballagen skal opbevares på et godt ventileret sted. S16 Holdes væk fra antændelseskilder Rygning forbudt. S35 Materialet og emballagen skal bortskaffes på sikker vis. S57 Skal indesluttes forsvarligt for at undgå miljøforurening. S 61 Undgå udledning til miljøet. Se særlig vejledning/sikkerhedsdatablad. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (MSDS). 7. Før og efter fiksering skal prøver og alle materialer, der kommer i berøring med disse, håndteres som værende i stand til at overføre smitte og bortskaffes med de korrekte foranstaltninger (37). Pipettér aldrig med munden, og undgå, at hud og mukøse membraner kommer i kontakt med reagenser og prøver. Hvis reagenser kommer i kontakt med følsomme områder, vaskes disse med rigelige mængder vand. 8. Minimér mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlagtige resultater. 9. Andre inkubationstider og -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 10. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på præparaterne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 6/35

11. Undgå fordampning af TOP2A/CEN-17 Probe Mix under hybridisering ved at sikre en tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 12. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan medføre tab af effektivitet. 13. Anvend hensigtsmæssigt personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (MSDS). Opbevaring Opbevar reagenser mørkt ved 2 8 C. Alle reagenser tåler nedfrysning. Nedfrysning og optøning af kittet for hver analyse påvirker ikke effektiviteten. Den brugsklare pepsin, TOP2A/CEN-17 Probe Mix og Fluorescence Mounting Medium (flaske 2, 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for varme. Disse komponenter må ikke opbevares ved stuetemperatur. TOP2A/CEN-17 Probe Mix og Fluorescence Mounting Medium (flaske 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Disse komponenter må ikke opbevares, og analysen må ikke udføres, i stærkt lys såsom direkte sollys. Kittet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt uden på pakningen. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end angivet på denne indlægsseddel, skal brugeren vurdere reagenseffektiviteten (38). Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med forskelle i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med TOP2A FISH pharmdx kittet, skal Dako Technical Service straks kontaktes. Klargøring af præparater Biopsiprøver skal behandles, så vævet bevares til FISH-analyse. Der skal anvendes standardmetoder til vævsbehandling med henblik på immunhistokemisk farvning ved alle prøver (39). Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutralbufferet formalin og er paraffinindstøbt, egner sig. Biopsiprøver skal f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 4 mm og fikseres i 18 24 timer i neutralbufferet formalin. Vævssnittene skal derefter dehydreres gradvist i ethanol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvis temperatur ikke må overstige 60 C. Korrekt fikseret og indstøbt væv kan holde sig uendeligt inden udskæring og montering på objektglas, hvis det opbevares køligt (15 25 C) (39, 40). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævspræparater skal skæres i snit på 4 6 µm. Objektglas, der er påkrævet til TOP2A-genafvigelsesanalyse og verificering af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Mindst 3 serielle snit anbefales, 1 snit til tilstedeværelse af tumorer farvet med hæmatoxylen og eosin (H&E-farve), 1 snit til TOP2A-genafvigelsesanalyse og 1 snit som reserve. Det anbefales at montere vævssnittene på Dako Silanized Slides, kode S3003, SuperFrost Plus eller poly-l-lysin objektglas. Præparaterne skal analyseres inden for 4 6 måneder efter udskæring ved opbevaring i stuetemperatur (20 25 C) eller inden for 2 år ved opbevaring ved 2 8 C. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 7/35

BRUGSANVISNING A. Klargøring af reagens Det anbefales at klargøre nedenstående reagenser inden farvning: A.1 Pre-Treatment Solution Der kan være krystaller i flaske 1, men disse opløses ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde fra flaske 1 (Pre-Treatment Solution 20x) i forholdet 1:20 med destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i én måned. Kassér bufferen, hvis den er uklar. A.2 Stringent Wash Buffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra flaske 4 (Stringent Wash Buffer 20x) i forholdet 1:20 med destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér bufferen, hvis den er uklar. A.3 Wash Buffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra flaske 6 (Wash Buffer 20x) i forholdet 1:20 med destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i én måned. Kassér fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Ethanolserie Klargør 3 kar med hhv. 70 %, 85 % og 96 % ethanol ud fra en 96 % ethanolopløsning. Opbevar de lukkede kar ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kassér opløsningen, hvis den er uklar. B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se Forholdsregler). Hvis komponenterne i kittet opbevares frosne, anbefales det at flytte reagenserne til 2 8 C dagen inden analysen skal udføres for at sikre en korrekt temperatur. Alle reagenser skal have den relevante temperatur inden brug, som angivet herunder. Flaske 1, temperaturen på den fortyndede Pre-Treatment Solution skal udlignes til 95 99 C. Flaske 2, Pepsin skal anvendes ved 2 8 C og skal holdes konstant kølig. Flaske 3, TOP2A/CEN-17 Probe Mix kan anvendes ved temperaturer mellem 2 25 C. Flaske 4, fortyndet Stringent Wash Buffer: Det ene kar skal have stuetemperatur, det andet skal have en temperatur på 65 (±2) C inden brug. Flaske 5, Fluorescence Mounting Medium kan anvendes ved temperaturer mellem 2 25 C. Flaske 6, den fortyndede Wash Buffer skal have stuetemperatur på 20 25 C. Coverslip Sealant kan anvendes ved temperaturer mellem 2 25 C. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren omfatter en række dehydreringer efterfulgt af tørring af vævssnittene. Sørg for, at vævssnittene er helt tørre, inden der fortsættes til næste trin. Vævssnittene må ikke tørre under de andre proceduretrin. Hvis det er nødvendigt at afbryde farvningen, kan objektglassene opbevares i Wash Buffer i maks. 1 time ved stuetemperatur (20 25 C) efter afparaffineringstrinnet, uden at resultatet påvirkes. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 8/35

B.2 Behandling af vævsprøver før farvning Afparaffinering og rehydrering: Forud for analysen skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og derefter skal de rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Anbring objektglassene i et xylenbad, og inkubér i 5 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 96 % ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 70 % ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badet, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i fortyndet Wash Buffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.3) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningen som beskrevet i afsnit B.3, trin 1, Forbehandling. Xylen- og alkoholopløsningerne skal som minimum udskiftes efter 200 objektglas. Xylenerstatninger kan anvendes. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette kit er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af reagenserne eller ændring af inkubationstemperaturen kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. B.3 Farvningsprotokol DAG 1 Trin 1: Forbehandling Fyld et farvningskar med den fortyndede Pre-Treatment Solution (se BRUGSANVISNING, afsnit A.1). Anbring farvningskarret med Pre-Treatment Solution i et vandbad. Opvarm vandbadet og Pre-Treatment Solution til 95 99 C. Mål temperaturen i karret med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede Pre-Treatment Solution i farvningskarret. Kontroller igen temperaturen, og inkuber i 10 (±1) minutter ved 95 99 C. Tag hele karret med objektglassene op af vandbadet. Tag låget af, og lad objektglassene køle af i Pre-Treatment Solution i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til et kar med fortyndet Wash Buffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i bufferen i 3 minutter mere. BEMÆRK: Pre-Treatment Solution er kun beregnet til engangsbrug. Må ikke genbruges. Trin 2: Pepsin, brugsklar Bank overskydende buffer af. Brug en fnugfri klud (f.eks. en absorberende serviet eller gaze), og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Påfør 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) Pepsin (flaske 2), så præparatet er dækket. Pepsin skal altid opbevares ved 2 8 C. Inkuber i 5 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 10 minutter er tilstrækkelig for de fleste præparater, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller præparatets tykkelse. Dette skal afgøres af brugeren. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 9/35

Bank den brugsklare Pepsin af, og lad snittene ligge i den fortyndede Wash Buffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift Wash Buffer, og lad snittene ligge i bufferen i 3 minutter mere. Dehydrér vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70 % ethanol, 2 minutter i 85 % ethanol og 2 minutter i 96 % ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Trin 3: TOP2A/CEN-17 Probe Mix Følgende trin skal udføres i et stinkskab. Påfør 10 µl TOP2A/CEN-17 Probe Mix (flaske 3) midt på vævssnittet. Anbring straks et 22 mm x 22 mm dækglas over Probe Mix, og lad stoffet fordele sig jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk fra vævet med en pincet. Forsegl dækglasset med Coverslip Sealant ved at trykke den ud rundt om dækglassets periferi. Lad Coverslip Sealant overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at Coverslip Sealant forsegler dækglassets kant hele vejen rundt. Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450/S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er våde og optimale til anvendelsen. Start Hybridizer, og vælg et program, der denaturerer ved 82 C i 5 minutter, og hybridisér natten over (14 20 timer) ved 45 C (se yderligere oplysninger i brugervejledningen til Dako Hybridizer). Anbring objektglassene i Hybridizer, og sørg for at låget er lukket korrekt. Start programmet. *Instrumenter, der giver betingelser, som svarer til det ovenfor beskrevne, kan anvendes til denaturering og hybridisering, f.eks. som beskrevet herunder: Anbring objektglassene på en flad metal- eller stenoverflade (varmeblok eller en blok i en hybridiseringsovn), der er forvarmet til 82 (±1) C. Denaturér probe og mål-dna i 5 minutter, og sørg for at blokkens temperatur ikke på noget tidspunkt falder til under 80 C. Anbring objektglassene i et forvarmet hybridiseringsfugtkammer. Dæk kammeret med et låg, og inkubér natten over (14 20 timer) ved 45 (±2) C. Bemærk, at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke er egnet til proberne i dette kit. DAG 2 Trin 4: Stringensvask Fyld to farvningskar med den fortyndede Stringet Wash Buffer (se BRUGSANVISNING, afsnit A.2). En mængde på mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hvert kar anbefales. Anbring det ene af farvningskarrene med fortyndet Stringent Wash Buffer med stuetemperatur i et stinkskab og det andet i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede Stringent Wash Buffer til 65 (±2) C. Sørg for, at temperaturen har stabiliseret sig. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen i vandbadskarret med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Stringent Wash Buffer indeholder et vaskemiddel og kan blive uklar ved 65 C. Dette påvirker ikke effektiviteten. Brug en pincet eller handsker, og tag objektglassene ud af hybridiseringskammeret. Fjern forsigtigt Coverslip Sealant og dækglasset, og anbring objektglassene i forvaskkarret med stuetemperatur ét ad gangen. Objektglassene må ikke anbringes i Stringent Wash Buffer, før objektglassene er fjernet. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskkarret med stuetemperatur til karret i vandbadet med 65 (±2) C. Udfør en stringensvask i nøjagtig 10 minutter ved 65 (±2) C. Tag glassene op af den fortyndede Stringent Wash Buffer, og lad snittene ligge i fortyndet Wash Buffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer, og lad snittene ligge i bufferen i yderligere 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70 % ethanol, 2 minutter i 85 % ethanol og 2 minutter i 96 % ethanol. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 10/35

Lad vævssnittene tørre helt. Trin 5: Montering Påfør 15 µl Fluorescence Mounting Medium med DAPI (flaske 5) på objektglassets målområde, og sæt et dækglas på. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Farven kan dog falme, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. Dette kan minimeres ved at opbevare objektglassene mørkt ved 2 8 C. Kvalitetskontrol 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler giver mulighed for at udføre en intern kontrol af farvningskørslen. Normale celler skal udvise 1 2 tydelige grønne signaler, hvilket indikerer, at CEN-17 PNAproben er hybridiseret til den centromeriske region i kromosom 17. Normale celler skal ligeledes udvise 1 2 tydelige røde signaler, hvilket indikerer, at TOP2A DNA-proben er hybridiseret til TOP2A-målregionen. Nogle normale celler vil have mindre end de forventede 2 signaler for hver farve på grund af vævsudskæringen. Normale celler, der er i færd med at dele sig, kan udvise mere end de normale 1 2 signaler for hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en fejlagtig analyse, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI-filter. Talrige spøgelsesagtige celler og en generelt dårlig nukleær morfologi indikerer overnedbrydning af prøven, hvilket medfører tab eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning Vurdérbart væv Kun præparater fra patienter med invasivt karcinom bør analyseres. I tilfælde hvor der findes karcinom in situ og invasivt karcinom i samme præparat, skal kun det invasive område bedømmes. Undgå områder med nekrose og områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Spring kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrundsfarvning over. Brug DAPI-filteret til at kontrollere for ujævn kernefarvning. Signaltælling: Lokalisér tumoren i relation til det H&E-farvede objektglas, og evaluér det samme område på det FISH-farvede objektglas. Scan flere områder af tumorceller for at tage højde for eventuel heterogenitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område, og tæl antallet af signaler inden for hver evalueret kernes grænse, idet der scannes fra venstre mod højre, i henhold til retningslinjerne herunder (se også Bilag 3). Fokusér op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. Tæl to signaler som ét signal, hvis de har samme størrelse og ligger i en afstand fra hinanden, der svarer til eller er mindre end ét signals diameter. I kerner med et højt niveau af TOP2A-genamplifikation kan TOP2A-signalerne ligge meget tæt ved hinanden og danne en klynge af signaler. I disse tilfælde kan antallet af TOP2A-signaler ikke tælles og skal derfor anslås. Man skal være særlig opmærksom på de grønne signaler, idet klynger af TOP2A-signaler kan dække de grønne signaler, så de er umulige at se. I tvivlstilfælde skal de grønne signaler kontrolleres med et specifikt FITC-filter. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 11/35

Bedøm ikke kerner uden grønne signaler. Bedøm kun kerner med et eller flere grønne referencesignaler. Notér tællingerne i et skema som vist i Bilag 2. Vejledning til signaltælling 1 Skal ikke tælles. Kernerne overlapper hinanden, og ikke alle områderne af kernerne kan ses 2 Tælles som to grønne signaler 3 To røde signaler. Kerner med kun røde signaler må ikke bedømmes 4 Tæl som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeanslåelse) 5 Tæl som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der har samme størrelse, og som ligger i en afstand fra hinanden, der svarer til eller er mindre end ét signals diameter, tælles som ét signal. 6 eller Skal ikke tælles (over- eller underfordøjede kerner). Manglende signaler midt i kernerne (donut-formede kerner). 7 Tæl som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der har samme størrelse, og som ligger i en afstand fra hinanden, der svarer til eller er mindre end ét signals diameter, tælles som ét signal. 8 Tæl som 1 grønt og 5 røde signaler 9 Tæl som 3 grønne (1 grønt uskarpt) og 3 røde signaler 10 Klynge med røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontrollér de grønne signaler med et specifikt FITC-filter, eller undlad at tælle Signalerne kan enten bedømmes med den konventionelle metode (41) eller med en alternativ tidsog arbejdsbesparende metode (21, 29). I stedet for den konventionelle metode til tælling af signaler i 60 kerner, bedømmes der i alt 60 hændelser, hvor én hændelse er et rødt gensignal. Med denne alternative tællemetode bedømmer man et varierende antal kerner, indtil man når op på 60 røde TOP2A-signaler. De tilsvarende grønne CEN-17-signaler i de samme kerner registreres. Der skal mindst bedømmes 6 kerner. I normale prøver vil gennemsnitligt 35 kerner være tilstrækkeligt til at opnå 60 røde signaler. I amplificerede tilfælde medtages der 6 35 kerner. Selv i tilfælde med deletioner vil mindre end 60 kerner ofte være tilstrækkeligt. Om muligt tælles kernerne fra 3 markante tumorområder (42). Beregn TOP2A/CEN-17-forholdet ved at dividere det samlede antal røde TOP2A-signaler med det samlede antale grønne CEN-17- signaler. Præparater med et TOP2A/CEN-17-forhold over eller lig med 2 skal betragtes som havende TOP2A-amplifikation, og præparater med et TOP2A/CEN-17-forhold mindre end 0,8 skal betragtes som havende TOP2A-deletion (18, 21, 29). (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 12/35

Resultater, der ligger på eller tæt på grænseværdien (1,8 2,2 for amplifikationer og 0,7 0,9 for deletioner), skal fortolkes med forsigtighed. Det anbefales at kontrollere, om bedømmelserne ikke omfatter en høj procentdel af normale kerner. Hvis forholdet ligger i en af de to tvivlsomme zoner, eller i tilfælde af usikkerhed, anbefales det, at bedømmelsen af præparatet verificeres med en ny bedømmelse, der udføres af en anden person. Her tælles kernerne fra yderligere 3 tumorområder og/eller i alt 60 kerner. Et kriterium for accept på ±10 % CV anbefales. Det endelige forhold skal beregnes på ny på baggrund af alle bedømmelser. Ved grænsetilfælde skal patologen og den behandlende læge fortolke præparatet i fællesskab. Begrænsninger Generelle begrænsninger 1. FISH er en proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser samt udvælgelse, fiksering og behandling af væv, klargøring af FISH-objektglaset samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. FISH-resultaterne afhænger af håndtering og behandling af vævsprøverne inden farvning. Ukorrekt fiksering, vask, tørring, opvarmning, udskæring eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For at opnå optimale og reproducérbare resultater skal objektglassene med væv afparrafineres fuldstændigt. Paraffinen skal fjernes i begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSANVISNING, afsnit B.2). 4. Der bør kun anvendes temperaturkalibreret vandbad, opvarmningsblok og hybridiseringsovn. Anvendelse af andre typer udstyr kan føre til fordampning af TOP2A/CEN-17 Probe Mix under hybridisering og skal valideres af brugeren. Produktegenskaber Hybridiseringseffektivitet Hybridiseringseffektiviteten af TOP2A FISH pharmdx kittet blev undersøgt på et almindeligt patologisk laboratorium. I alt 126 formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit blev analyseret med den anbefalede procedure. Ud af de 126 præparater kunne 124 bedømmes i henhold til produktvejledningen, mens 2 præparater ikke kunne bedømmes af tekniske årsager. Hybridiseringseffektiviteten var derfor 124/126 = 98 % (29). Analysesensitivitet Sensitiviteten af TOP2A/CEN-17 Probe Mix blev undersøgt med én TOP2A-deleteret, én TOP2Anormal og én TOP2A-grænseamplificeret cellelinje. Forholdet mellem antallet af TOP2A-signaler og CEN-17-signaler blev beregnet på baggrund af tælling af 60 kerner pr. cellelinje. Den deleterede cellelinje blev bedømt som deleteret med et gennemsnitligt forhold på 0,31, den normale cellelinje blev bedømt som normal med et gennemsnit på 1,02, mens den grænseamplificerede cellelinje blev bedømt som grænseamplificeret med et gennemsnitligt forhold på 1,99. Desuden blev TOP2A/CEN-17-forholdene for 5 ikke-amplificerede TOP2A-genvævssnit fastslået med TOP2A FISH pharmdx kittet. Hvert vævssnit blev bedømt af 3 uafhængige teknikere. Tabel 1 viser resultaterne. Tabel 1. TOP2A/CEN-17-forhold i 5 ikke-amplificerede vævssnit, bedømt af 3 uafhængige teknikere Væv 1 Væv 2 Væv 3 Væv 4 Væv 5 Tekniker 1 0,95 0,94 0,92 1,03 0,99 Tekniker 2 1,05 0,94 0,97 1,01 1,04 Tekniker 3 1,03 0,99 0,96 1,05 1,04 (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 13/35

Gennemsnitligt forhold 1,01 0,96 0,95 1,03 1,02 CV % 5 3 3 2 3 CV: variationskoefficient Forsøget bekræftede, at alle 5 vævssnit var ikke-amplificeret med et gennemsnitligt TOP2A/CEN- 17-forhold tæt på 1,0. Analysespecificitet TOP2A-DNA-proberne i TOP2A/CEN-17 Probe Mix er slutsekvenseret og mappet til at bekræfte en samlet dækning på 228 kb, herunder TOP2A-genet. CEN-17-PNA-proberne i TOP2A/CEN-17 Probe Mix er blevet testet hver for sig og sammen for at bekræfte deres specifikke hybridisering til den centromeriske region i kromosom 17. Der blev gennemført forsøg på metafase-spreads i henhold til Dakos QC-procedurer for at udelukke krydshybridisering til andre kromosomer end kromosom 17. I alt 250 metafase-spreads blev evalueret for specifik hybridisering af probeblandingerne TOP2A-DNA og CEN-17-PNA. I alle 250 tilfælde var hybridiseringen specifik for kromosom 17. Der blev ikke observeret krydshybridisering til loci på andre kromosomer i nogen af de 250 tilfælde. Analyse af normalt væv For at oprette en række resultater for normalt væv blev der udført et forsøg, som målte fordelingen af TOP2A/CEN-17-forholdene i prøver fra normalt brystvæv. I et prøvesæt på 21 præparater fra normalt brystvæv var det gennemsnitlige TOP2A/CEN-17-forhold 1,10 med et 95 % konfidensinterval på 1,07 1,13. Standardafvigelsen var 0,07. Robusthedsundersøgelser TOP2A FISH pharmdx kittets robusthed blev afprøvet med varierende forbehandlingstid og -temperatur, pepsininkubationstid, denatureringstemperatur, hybridiseringstid og -temperatur og stringensvasktid og -temperatur. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i resultaterne ved følgende forsøgstilstande: Forbehandling i 7, 10 og 13 minutter ved en temperatur på 92 og 95 99 C (89 C blev også afprøvet men medførte svagere signaler i nogle af de analyserede snit). Pepsininkubationstider på 2, 5, 10, 15 og 18 minutter. Denatureringstemperaturer på 72, 82 og 92 C. Hybridiseringstid på 17 timer i kombination med en temperatur på 40, 45 og 50 C. Hybridiseringstider på 10, 12, 14, 17 og 20 timer ved en temperatur på 45 C. Stringensvasken blev afprøvet i 10 minutter ved 60, 63, 65, 67 og 70 C. Derudover blev stringensvasken afprøvet i 5, 10 og 15 minutter ved 65 C. Stringensvask i 10 minutter ved 70 C medførte tab af signaler, mens der ikke blev observeret nogen signifikant forskel i resultaterne ved andre tids-/temperaturkombinationer. Desuden blev følgende fortyndinger af Stringent Wash Buffer afprøvet: 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 og 1:40. Fortyndingen af Stringent Wash Buffer på 1:40 medførte tab af signaler, mens der ikke blev observeret nogen signifikant forskel i signalintensitet med de andre fortyndinger. Lignende resultater blev observeret, da de samme fortyndinger af Pre-Treatment Solution blev afprøvet. Fortyndingen af Pre-Treatment Solution på 1:40 medførte også her tab af signaler, mens der ikke blev observeret nogen signifikant forskel i signalintensitet med de andre fortyndinger. Repetérbarhed Repetérbarheden af TOP2A/CEN-17-forholdet blev undersøgt med TOP2A FISH pharmdx kittet ved anvendelse af konsekutive snit fra normalt brystvæv og brystkarcinomer. Det blev konstateret, at variationskoefficienten var 5 % både for normalt brystvæv og brystkarcinomer. I alt 10 konsekutive snit fra brystkræftvæv med forskellig tykkelse (duplikater på 3, 4, 5, 6 og 7 µm) blev analyseret med TOP2A FISH pharmdx kittet. TOP2A/CEN-17-forholdene lå i området mellem 1,02 og 1,10 med en variationskoefficient på 3 %. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 14/35

Reproducérbarhed TOP2A FISH pharmdx kittet blev afprøvet med henblik på reproducérbarhed lot-til-lot, dag-til-dag og observatør-til-observatør med anvendelse af 4 forskellige formalinfikserede og paraffinindstøbte cellelinjer (den ikke-amplificerede MDA-231 og MDA-175, den grænseamplificerede SKBR3 og den deleterede MDA-361). Der blev talt 30 kerner pr. præparat i disse 3 undersøgelser. Den største variation i TOP2A/CEN-17-forholdet (10 %) blev fundet i observatør-til-observatør forsøget på den grænseamplificerede cellelinje. Dette kan være at forvente og afspejler muligvis en vis subjektivitet i signalfortolkning og -tælling. Tabel 2 4 viser resultaterne som gennemsnitligt forhold, standardafvigelse og variationskoefficienter. Tabel 2. Reproducérbarhed lot-til-lot. TOP2A/CEN-17-forhold målt for 3 forskellige lot af TOP2A FISH pharmdx kittet Tabel 3. Reproducérbarhed dag-til-dag. TOP2A/CEN-17-forhold målt på 4 forskellige dage Cellelinje TOP2A/CEN-17- Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 I alt forhold MDA-231 Gennemsnit 1,02 1,01 1,05 1,03 SD 0,04 0,04 0,05 0,04 CV % 4 4 5 4 N 5 5 5 15 MDA-175 Gennemsnit 1,28 1,30 1,28 1,28 SD 0,09 0,11 0,05 0,08 CV % 7 8 4 6 N 5 5 5 15 SKBR3 Gennemsnit 2,03 2,08 1,98 2,03 SD 0,12 0,11 0,12 0,12 CV % 6 5 6 6 N 5 5 5 15 MDA-361 Gennemsnit 0,33 0,33 0,33 0,33 SD 0,01 0,01 0,01 0,01 CV % 4 3 2 3 N 5 5 5 15 SD: Standardafvigelse CV: Variationskoefficient N: antal objektglas Cellelinje TOP2A/CEN-17- Dag 1 Dag 2 Dag 3 Dag 4 I alt forhold MDA-231 Gennemsnit 1,04 1,03 1,03 1,02 1,03 SD 0,04 0,05 0,02 0,02 0,03 CV % 4 5 2 2 3 N 5 5 5 5 20 MDA-175 Gennemsnit 1,24 1,26 1,18 1,19 1,22 SD 0,06 0,09 0,03 0,05 0,06 CV % 5 7 2 4 5 N 5 5 5 5 20 SKBR3 Gennemsnit 2,01 1,94 2,08 2,00 2,01 SD 0,17 0,14 0,14 0,08 0,14 CV % 9 7 7 4 7 N 5 5 5 5 20 MDA-361 Gennemsnit 0,33 0,32 0,34 0,33 0,33 SD 0,01 0,02 0,00 0,01 0,01 CV % 2 6 1 3 4 N 5 5 5 5 20 SD: Standardafvigelse CV: Variationskoefficient N: Antal objektglas (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 15/35

Tabel 4. Reproducérbarhed observatør-til-observatør. TOP2A/CEN-17-forhold målt af 3 forskellige observatører Cellelinje MDA-231 MDA-175 SKBR3 MDA-361 TOP2A/CEN-17-forhold Obs. 1 Obs. 2 Obs. 3 I alt Gennemsnit 1,03 1,05 1,08 1,05 SD 0,02 0,05 0,05 0,04 CV % 2 5 5 4 N 5 5 5 15 Gennemsnit 1,23 1,18 1,11 1,18 SD 0,08 0,12 0,05 0,09 CV % 7 10 5 8 N 5 5 5 15 Gennemsnit 1,92 1,63 1,67 1,74 SD 0,19 0,09 0,06 0,18 CV % 10 5 4 10 N 5 5 5 15 Gennemsnit 0,31 0,34 0,36 0,34 SD 0,01 0,01 0,03 0,03 CV % 4 3 8 8 N 5 5 5 15 SD: Standardafvigelse CV: Variationskoefficient N. Antal objektglas Der blev gennemført endnu en observatør-til-observatør undersøgelse på opbevarede brystkræftvævsprøver, som var udvalgt med henblik på at afspejle et udvalg af TOP2Aamplifikationsniveauer. Tre observatører talte hændelser i 20 kerner for hvert af de 26 præparater. Overensstemmelsen mellem observatørerne med hensyn til amplifikations-/ikkeamplifikationsstatus (se Fortolkning af farvning) lå over 96 % i alle tilfælde og 100 % mellem 2 ud af 3 observatører (1 observatør bedømte, at en prøve havde et forhold på 2,00, mens de 2 andre observatører fandt prøven normal). Analyseportabilitet Der blev udført et blindet, randomiseret, komparativt forsøg på tre centre med anvendelse af formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) præparater fra humane brystkræftkarcinomer med forskellige niveauer af TOP2A-genstatus (deletion, normal og amplifikation) med henblik på at vurdere reproducérbarhed mellem laboratorier (analyseportabilitet). Forsøget omfattede 3 centre. Hvert center farvede og fortolkede 6 FFPE-præparater i 3 separate kørsler (i alt 30 objektglas). Hver kørsel omfattede en leveret kontrol. Tabel 5. Forsøgsdesign og -sammenligning Sammenligning Inden for samme analyse (reproducérbarhed inden for procedure) Mellem analyser (sammenligning af farvning fra to tidligere farvningskørsler) Teknikere imellem (sammenligning af farvningsresultater blandt teknikere) Laboratorier imellem (parvise sammenligninger af farvningsresultater blandt laboratorier) Procedure 18 objektglas fra 6 præparater + 1 kontrolobjektglas 6 objektglas + 1 kontrolobjektglas 6 objektglas + 1 kontrolobjektglas Sammenligning af resultater fra dag 1 blandt laboratoriepar (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 16/35

Resultater TOP2A/CEN-17-forholdet for hvert analyseret objektglas blev rapporteret vha. randomiseringsnummer og center med tællinger fra 60 kerner. Hvert center udpegede 1 primær tekniker, 1 sekundær tekniker og 1 patolog til hhv. farvning og evaluering. Dag og tekniker blev specificeret for hvert af præparaterne og anvendt i den statistiske analyse for evalueringer mellem dag og tekniker. På den første farvningsdag blev i alt 54 objektglas farvet. Tre replikater af hvert væv blev farvet på hvert laboratorium. Resultaterne rapporteres som TOP2A/CEN-17-forhold ud fra tælling af signaler i 60 kerner. Tabe 6 viser fordelingen af forholdene. Tabel 6. Rapporterede forhold opnået på første farvningsdag TOP2A/CEN-17-forhold (præparater med denne score) Center I alt <0,80 0,80<2,0 2,00 1 18 3 9 6 2 18 2 10 6 3 18 3 9 6 I alt 54 8 28 18 Tabel 7: Forhold rapporteret for alle præparater Generelt forhold (tælling af præparater med denne score) Center I alt <0,80 0,80<2,0 2,00 1 30 5 15 10 2 30 6 14 10 3 30 5 15 10 I alt 90 16 44 30 Reproducérbarheden var markant for alle analysesammenligninger på tværs af de 3 centre. Ét væv forårsagede størstedelen af forskellen mellem deleteret og normal status. Der var 2 evalueringer af et præparat med deletionsstatus, som indikerede normal genkoncentrationsstatus. På tværs af de 90 udførte analyser (tabel 7) var der forskelle i forholdet for 2 væv. 13 ud af 15 analyser var overensstemmende for 1 væv, og 12 ud af 15 analyser var overensstemmende for et andet væv. Genkoncentrationsstatus forblev overensstemmende på tværs af alle analyser af de andre 4 væv. Evalueringen af amplificeret versus ikke-amplificeret status på tværs af alle præparater var fuldt ud overensstemmende på tværs af alle forsøgscentre og alle præparater. Når den alternative tællemetode (se Fortolkning af farvning) blev anvendt, var der en meget stor overensstemmelse mellem de 2 tællemetoder. Klinisk anvendelighed Doxorubicin og epirubicin er antracykliner, som er nogle af de mest anvendte antitumorlægemidler, og det er påvist, at topoisomerase IIα er det molekulære mål for disse stoffers farmakologiske virkning (14, 15). Doxorubicin og epirubicin har vist sig at være effektive ved en lang række forskellige maligniteter, herunder brystkræft, hvor de både anvendes til metastatisk og adjuverende behandling (15). Ved adjuverende behandling af brystkræft har kliniske data vist, at kemoterapibehandling, der omfatter doxorubicin eller epirubicin, medfører en statistisk signifikant længere overlevelse sammenlignet med behandlinger uden antracyklin (43, 44). Antracykliners terapeutiske indeks er lavt, og den øgede virkning fås på bekostning af en større toksicitet sammenlignet med andre kemoterapibehandlinger, f.eks. CMF (cyclophosphamid/methotrexat/5-fluorouracil) (19, 45). Udover den akutte toksicitet kan behandling med doxorubicin eller epirubicin medføre længerevarende bivirkninger med kardiotoksicitet og sekundær akut myeloid leukæmi (AML) (6, 15). Den behandlingsinducerede kardiomyopati er ofte varig og kan udvikle sig til kongestiv hjerteinsufficiens flere måneder eller år efter afslutningen af behandlingen. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 17/35

Det er vigtigt, at lægerne har tilgængeligt værktøj til identifikation af patienter, som sandsynligvis kan hjælpes med en behandling med doxorubicin og epirubicin, for at optimere den medicinske behandling med disse lægemidler. Dako TOP2A FISH pharmdx kittets kliniske effektivitet har været undersøgt i to forsøg, der blev gennemført af Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) i København (21, 29, 30, 46). Pilotforsøg TOP2A FISH pharmdx kittets kliniske effektivitet er blevet evalueret i et pilotforsøg med præparater fra 120 brystkræftpatienter (29) i samarbejde med DBCG. Der var ændringer af TOP2A-koncentrationen i i alt 20 tumorer, næsten ligeligt fordelt mellem amplifikationer (n=11) og deletioner (n=9). TOP2A-ændringerne blev ikke udelukkende fundet i HER2-positive tumorer, idet 4 tumorer (20 % af de TOP2A-anormale tilfælde) var HER2-negative. Et forhold (røde signaler/grønne signaler) større end eller lig med 2 adskiller amplificerede fra normale tilfælde, mens et forhold under 0,8 er forbundet med gendeletion. Pilotforsøget viste, at 2 forskellige tællemetoder gav identiske resultater: Signalerne blev enten talt i 60 kerner, eller i alt 60 røde signaler blev talt sammen med de grønne signaler i den samme kerne. Sidstnævnte metode har den fordel, at det største antal celler vil blive talt i de deleterede og normale tilfælde, mens det laveste antal celler vil blive talt i de amplificerede tilfælde. Det er ofte nemt at identificere amplificerede tilfælde ved bare at se i mikroskopet, men det er mere tidskrævende at evaluere, hvis 60 kerner skal bedømmes. Bekræftende forsøg - DBCG 89D/TOP2A TOP2A FISH pharmdx kittets kliniske effektivitet blev evalueret i et større perspektiv på baggrund af tumorprøver, som blev indsamlet prospektivt fra det sideløbende forsøg DBCG 89D (21, 30, 46, 47) Forsøgsdesign Det primære formål med DBCG 89D/TOP2A-forsøget var at undersøge, om TOP2A-genafvigelser (amplifikation eller deletion) kunne fungere som prædiktiv markør for recidivfri og generel overlevelse hos brystkræftpatienter i højrisikogruppen, som man har til hensigt at behandle med adjuverende epirubicin-baseret kemoterapi. De prognostiske egenskaber ved TOP2A-genafvigelser og sammenhængen mellem TOP2A og HER2 blev undersøgt som sekundære formål. DBCG 89D-forsøget var designet som et åbent, prospektivt, randomiseret forsøg. Efter operationen blev 980 præ- og postmenopausale kvinder med invasiv brystkræft i højrisikogruppen randomiseret til CMF eller CEF (cyclophosphamid/epirubicin/5-fluorouracil). Det primære effektresultat var RFS (recidivfri overlevelse) med OS (generel overlevelse) som sekundært endpoint. Vævsblokke fra de patienter, som havde deltaget i DBCG 89D-forsøget, blev indsamlet fra forsøgscentrene til det biologiske underforsøg DBCG 89D/TOP2A, og analyseret retrospektivt for TOP2A- og HER2- genafvigelser (Dako HER2 FISH pharmdx kittet) samt HER2-overekspression (Dako HercepTest ) på et centralt laboratorium. Vævsblokke fra 806 ud af de 980 patienter fra DBCG 89D-forsøget var til rådighed. Med henblik på TOP2A- og HER2-genafvigelser blev forholdet beregnet som antallet af signaler for genproberne delt med antallet af signaler for centromer 17. Tilfældene blev bedømt som HER2- eller TOP2A FISH-amplificeret, når forholdet var 2. Et forhold på < 0,8 blev betragtet som ensbetydende med TOP2A-deletion. TOP2A-status blev kategoriseret i følgende grupper: Deleteret: TOP2A/CEN-17-forhold < 0,8 Normal: 0,8 TOP2A/CEN-17-forhold < 2,0 Amplificeret: TOP2A/CEN-17-forhold 2,0 (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 18/35

HER2 FISH-analysen blev udført på alle 1+, 2+ og 3+ positive prøver i HercepTest. Bedømmelsen af HER2-positivitet (48) i forsøget var følgende: Positiv: HercepTest=3+, eller HercepTest=2+ og FISH HER2-forhold 2,0 Negativ: HercepTest=0,1+, eller HercepTest=2+ og FISH HER2-forhold < 2,0 Det kliniske forsøg (DBCG 89D) og det biologiske underforsøg (DBCG 89D/TOP2A) blev gennemført i henhold til Helsinki-deklarationen og godkendt af de lokale etiske komitéer. Statistiske metoder Det primære endpoint for forsøget var RFS, defineret som tiden fra randomisering til en hændelse eller censurering. Det sekundære endpoint var OS, defineret som tiden fra randomisering til død eller censurering. Virkningen af behandlingen med CEF i forhold til CMF på RFS og OS blev kvantificeret med hensyn til risiko for død, hvilket blev anslået ved hjælp af den proportionelle Cox-risikomodel. Den proportionelle Cox-risikomodel blev tilpasset i henhold til resultatet af goodness-of-fit - procedurer og undersøgelse af interaktion, hvilket definerede den grundlæggende multivariat-coxmodel for analyse af RFS og OS. Risiko for død (HR), 95 % konfidensinterval og p-værdien fra Wald-testen blev givet for hver kovariat og interaktionsterm i Cox-modellen. HR for behandling med CEF vs. behandling med CMF i hver TOP2A-undergruppe (og HER2-undergruppe) blev udledt fra resultaterne og vist med et Forrest-plot. Efter at den proportionelle Cox-risikomodel for RFS og OS var blevet tilpasset i henhold til resultaterne fra goodness-of-fit -procedurerne og interaktionsundersøgelserne, blev der udført 3 typer af sekundære analyser. Multivariatestimering i de 3 TOP2A-undergrupper: Deleteret, normal, amplificeret. Multivariatestimering i de 2 HER2-undergrupper: Negativ, positiv. Samlet multivariatestimering for alle patienter, inklusive TOP2A- og HER2-interaktion. Sammenhængene mellem TOP2A-status og de kliniske og patologiske variabler, inklusive HER2- status, blev testet med χ2-test. Opfølgningstiden blev kvantificeret med en Kaplan-Meier-estimering af potentiel opfølgning. Der blev udført analyser for eventuel udvælgelsesbias med anvendelse af χ2-testen og logrank-testen. Patienter med manglende værdier (med undtagelse af receptorstatus) blev ekskluderet fra multivariatanalyserne i den proportionelle Cox-risikomodel. Resultater TOP2A FISH-analysen var vellykket på 773 af de 806 (96 %) brystkræftprøver. Tabel 8 viser den generelle fordeling af TOP2A-status blandt de egnede patienter. Der var amplifikation af TOP2A i 92 (11,9 %) af de 773 egnede patienter og deletion i 87 (11,3 %). Tabel 8. Fordeling af TOP2A-status TOP2A-status n (%) Deleteret Normal Amplificeret 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) I alt 773 (100) Tabel 9 viser fordelingen af TOP2A-amplifikationer og -deletioner i forhold til HER2-status. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 19/35

Tabel 9. Fordeling af HER2-status i forhold til TOP2A-status HER2- status TOP2A N n (%) Deleteret n (%) Normal n (%) Amplificeret n (%) Negativ 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) 14 (2,7) Positiv 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) 78 (31,7) I alt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) p-værdi χ 2 p < 0,0001 Hvis man ser på HER2-status, blev der fundet flere TOP2A-afvigelser blandt de HER2- positive tumorer. TOP2A-afvigelser blev set i 139 (56,5 %) af de 246 HER2-positive tumorer og i 40 (7,6 %) af de 527 HER2-negative tumorer. 40 (22,3 %) patienter med TOP2A-afvigelser ville derfor være blevet overset, hvis man kun havde analyseret de HER2-positive prøver. Tabel 10 viser fordelingen af TOP2A-afvigelser i forhold til HER2 FISH-status. Lige som med HER2-status blev der fundet en signifikant sammenhæng med TOP2A-status. Tabel 10. Fordeling af HER2 FISH-status i forhold til TOP2A-status HER2 FISH TOP2A N Deleteret Normal Amplificeret n (%) n (%) n (%) n (%) Normal 539 (100) 31 (5,8) 493 (91,5) 15 (2,8) Amplificere t 234 (100) 56 (23,9) 101 (43,2) 77(32,9) I alt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) p-værdi χ 2 p < 0,0001 Tabel 11 viser fordelingen af TOP2A-afvigelser i forhold til HercepTest bedømmelsen. Ligesom med HER2-status blev der fundet en signifikant sammenhæng med TOP2A-status. Tabel 11. Fordeling af HercepTest bedømmelse i forhold til TOP2A-status HercepTest TOP2A N n (%) Deleteret n (%) Normal n (%) Amplificeret n (%) 0 209 (100) 11 (5,3) 192 (91,9) 6 (2,9) 1+ 257 (100) 13 (5,1) 238 (92,6) 6 (2,3) 2+ 78 (100) 3 (3,9) 65 (83,3) 10 (12,8) 3+ 229 (100) 60 (26,2) 99 (43,3) 70 (30,6) Total 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) p-værdi χ 2 p< 0,0001 Seks af de 773 patienter med tilgængelige TOP2A-data manglede kliniske data, hvilket udelukkede dem fra de multivariate analyser. For patienterne med tilgængelige TOP2A-testresultater var den potentielle opfølgningstid for RFS 9,4 år, og det tilsvarende antal hændelser var 371. Den gennemsnitlige, potentielle opfølgningstid for OS var 11,1 år, og antallet af hændelser var 336. Figur 1 3 viser Kaplan-Meier plottene for RFS med hensyn til de 2 behandlingsgrupper i hver af de 3 TOP2A-grupper. (115084-002) K5333/DK/KVN/24.05.07 p. 20/35