Test'af'EML4.ALK'fusion'i'lungeadenokarcinom.

Transkript

1 Test'af'EML4.ALK'fusion'i'lungeadenokarcinom. Anbefalingerne udarbejdede af: Overlæge,Dr.Med.BirgitGuldhammerSkov.BispebjergHospital,PatologiskAfdeling. Professor,overlægeMogensVyberg.AalborgUniversitetshospital,PatologiskInstitut. Overlæge ph.d. Henrik Hager. Aarhus Universitetshospital, Patologisk Institut. Tovholder UMP. Lagt på DPAS hjemmesiden og vil løbende blive revideret hvis der tilkommer ny viden vedr. analyserne. Protokoller til farvemaskiner oploades snarest. Molekylær'basis'for'behandling:' ReHarrangement af ALK (Anaplastisk Lymfom Kinase) blev først beskrevet i anaplastiske storcelledelymfomer(1).senereerdetbeskrevetiandretumorer,herunderiikkesmåcellede lungecancere,heltovervejendeadenocarcinomer(2).ilungecancerbestårreharrangementeti enmindreinversionpåkromosom2inv(2)(p21p23).dettemedførerhyppigst,atendelaf ALKHgenet fusionerer med EML4Hgenet (Echinoderm MicrotubulusHassocieret lignende protein 4) (3). Andre fusionspartnere er dog mulige, herunder TFG og KIF5B (3). Fusionsproteinet har transformerende egenskaber og regnes som et afgørende oncogen (driver mutation) i udviklingen af 3H6 af lungeadenokarcinomer (4). En nyligt udviklet kinase-inhibitor(pf ,crizotinib,xalkori,pfizer)hardokumenteretkliniskeffektpå patienter med EML4HALKHfusion, hvilket har ført til FDAHgodkendelse i august 2011 samt godkendelseefteråret2012afeuropeanmedicinesagency(ema)ogdermedidanmarksom 2.linieHbehandlingaflungeadenokarcinomer.Dehyppigstekliniskekarakteristikaassocieret medelm4halkfusioneryngrepatienteroglavt/intetcigaretforbrug.dissekarakteristikases dogikkehosallepatienter(5).eml4halkhfusionenerisærbeskrevetiadenokarcinomermed solidtvækstmønsterogindholdafsignetringscellersamtiadenokarcinomermedkribriformt vækstmønster og mucinproduktion, men kan ses i alle histologiske subtyper (6). Det er såledesvigtigtatkunnedetekterefusionenvedspecifikkemetoder. Hvornår'skal'testen'udføres?' Crizotinib er i Danmark (endnu) ikke godkendt til 1. liniehbehandling, og undersøgelse for ALKHstatus skal således ikke$ nødvendigvis laves uphfront, når diagnosen pulmonalt adenocarcinom stilles (dette i modsætning til undersøgelse for EGFR status, hvor ikkeh operable patienter skal testes uphfront). Af logistiske årsager og da behandlingsrespons på CrizotinibafALKpositivetumorersermegetoverbevisende,erdetmesthensigtsmæssigt,at analysenlavesalleredepådiagnosetidspunktet.principieltbørderværekontrolsnitpåhvert glas.hvispositivtkontrolmaterialeervanskeligtatskaffe,kandetdogovervejes,atanalysen ikke køres dagligt, men at der samles et antal prøver, før ALK IHC iværksættes med ét kontrolsnit. I denne sammenhæng skal det anføres, at ufarvede snit, der opbevares ved 5 C ikkemisterderesalkhantigenicitet. Side1af6

2 Detektion'af'ALK.gen're.arrangement:' Denne vil oftest foregå på(sparsomt) biopsimateriale sammen med morfologisk diagnostik, incl. immunhistologiske undersøgelser til subklassifikation af ikkesmåcellet lungecancer, og identifikationafandremolekylæretargets(f.eks.egfr).metoder,derkananvendes,er:fish (Fluorescens InHSitu Hybridisering), der påviser brud af ALKHgenet uafhængigt af fusionspartner,ihc(immunhistokemi)derpåviseralkhdelenaffusionsproteinet,ogrthpcr (Revers Transcriptase Polymerase kæde reaktion) der påviser fusionshmrna. Såvel vævsbiopsier som cytologisk materiale i form af udstrygninger/smears og koagelmateriale kan anvendes. I det efterfølgende vil disse metoder kort gennemgås afsluttende med en anbefaling. FISH:' De fleste kliniske studier omkring ALKHfusioner har anvendt breakhapart FISH probesæt for ALKHgenet.IUSAerbehandlingmedXalkoribetingetafanvendelseafVysisBreakApartFISH ProbeKit(AbbotMolecularInc.).Andrekitserimidlertidtilgængelige(f.eks.fraZytoVision, Zyto Light og TriCheck). De fleste af disse kits indeholder indlægssedler med såvel laboratoriemæssige som analytiske anbefalinger. I en større sammenlignende test er to probesæt(vysis(fish)ogzytovision(cish))sammenlignetogudvistefuldkonkordans(7). Såvel histologisk som cytologisk materiale, incl. koagler fra det aspirerede materiale, kan anvendes, herunder udstrygninger/smears, der oprindeligt er MGG farvet. Smears, der er PAPHfarvet, kan derimod ikke anvendes. Udstrygninger har den fordel, at de indeholder intakte kerner i modsætning til parafinsnit, der kunindeholder overskårne. For histologisk materialesognålekoaglersvedkommendebørstandardfixeringi10neutralbuffetformalin (3.6 neutralbuffet formaldehyd) anvendes. Erfaring med hurtigprocederingsmaskiner er endnuikkebeskrevetilitteraturen,hvorforstandardhvævsprocederingbørforetrækkes.3h5 µm tykke snit bør anvendes. Det er beskrevet i enkelte publikationer, at ufarvede snit fra paraffinblokkemedbiopsimaterialeognålekoaglerikkebørværeældreend1h6mdr. FISHHresultatetbørvurderesafenpatolog.50intaktetumorcellekernermedtydeligesignaler skal vurderes under anvendelse af fluorescencemikroskop med de rette filtre. Triple filter meddapisamtrødoggrønfluorescenceeratforetrække. EncellekerneerALKHpositiv(1)hvisafstandenmellemetrødtogengrøntsignalermereend svarendetil2diametreafdetkraftigstesignal(afstandenizhaksensretningskalmedregnes, hvis det er muligt), (2) hvis der kun ses et rødt signal, hvilket indikerer, at inversionen er kombineret med en deletion(kaldes red dot only). Tumor er ALKHnegativ, hvis <10 af de malignecellekernererpositive(<5celler)ogpositiv,hvis>50afdemalignecellerskerner erpositive(>25celler).hvisresultatetermellem10og50(5-25malignecellerskerner) bør præparatet revurderes af en anden patolog. Hvis gennemsnittet af de 2 vurderinger er >15,ertumorpositiv. Side2af6

3 IHC:' Erenhurtig,billigoglettilgængeligmådeatpåviseALKHdelenaffusionsproteinetuafhængigt affusionspartneren.metodenpåvisersåledesbehandlingstarget(proteinet)direkte.metoden erbaseretpå,atinversionenogfusionenafalkhgenetmedførerenoverexpressionafendel af ALKHproteinet. ALKHmolekylet er under normale omstændigheder ikke udtrykt efter fødslen,ogmankansåledesslutte,atalkhpositivitetvurderetvedihcermarkørforeml4h ALK fusion. Såvel histologiske biopsier som nålekoagler fra cytologisk materiale kan anvendes.dererikkedatapå,hvormangetumorcellermaterialetskalindeholde. Konsekvensen af forskellig fiksering og anden forbehandling med hensyn til ALK IHC er dårligt belyst, men man må antage, at såvel overh som underfixering kan give anledning til falsk negative resultater. Der er ikke literatur omkring anvendelse af hurtigprocederingsh maskiner. De metoder, der bliver anvendt til påvisning af ALK i lymfomer, er ikke anvendelige, idet mængdenafalkilungeadenokarcinomerervæsentligmindreendilymfomer.derfindes3 ALKHantistoffer,beskrevetilitteraturen:5A4(Novocastra),D5F3(Ventana)ogALK1(Dako). 5A4 giver de bedste farveresultater. ALK1 kan ikke anvendes til lungecancer. Detektionssystemer med stor følsomhed bør anvendes f. eks. Refine (Novocastra), Flex+ (Dako) og Optiview (Ventana). Effektiv varmeinduceret epitopdemaskering (HIER) er afgørendeforetgodtihcresultat,enalkaliskkogebufferanbefales. Positiv ALKHfarvning er cytoplasmatisk og granulær. I større præparater (primært resektater) er der beskrevet variation i intensiteten, dette kan meget vel skyldes fixeringsartefakter. Der er forskellige anvisninger på gradering af farvning. HHscore (histoscore), der anvender tre grader af positivitet og ogsåtagerhensyntilantalceller,har været foreslået. Gradering af farvningsintensitet kan imidlertid være subjektiv (9). En modificeret HHscore i lighed med HERH2 gradering i mamma er derfor blevet foreslået. (9). Kraftigfarvning(3+)kansesix2ellerx4objektivet,moderatfarvning(2+)behøverx10eller x20objektivet,menssvagfarvning(1+)kunkansesix40objektivet.dettevilsandsynligvis blivemodificeret/simplificeret,idetpositivetumoreroftestvilsesmedkraftigreaktion.ved vurderingenskalværevarsommedfalskpositivfarvningisærimakrofager,mucinogstroma. PositivkontrolbøranvendesenteniformafcelleliniemedverificeretALKHtranslokationeller verificeretalktranslokeretpulmonaltadenocarcinom.viforeslår,atpatologiafdelinger,der modtager operatiionsmeteriale (tumorektomier, lobektomier og pulmonektomier) er behjælpeligmedalkpositivtmaterialetilpositivkontrologindkøringafmetoder. Konkordans'mellem'IHC'og'FISH:' Itrestørrestudiererdetvist,atderer100koncordansmellemIHCogFISHnegativitet(9, 10og11).DissestudierviserogsågodkonkordansmellemIHC3+ogFISHpositivitet.Idisse arbejder er klon 5A4 (Novocastra) anvendt. Der er desuden kasuistiske meddelelser om tumorer,dererihcpositiveogfishnegative,somrespondererpåcrizotinib. ' RT.PCR:'' RTHPCRerenmegetsensitivmetodetilspecifikpåvisningafmRNA.ImodsætningtilIHC,der kun påviser tilstedeværelsen af ALKHprotein, og FISH, der kun påviser split af ALKHdelen, påviser RTHPCR EML4HALK fusion. Imidlertid er der en del problemer ved anvendelsen af FFPEHvæv,dergør,atmetodennæppevinderindpasidagligdiagnostik.Fordetførstekræver metoden, for at vise alle varianter, at der findes intakt RNA på optil 1000 basehpar (bp). I Side3af6

4 FFPEHmateriale vil der ofte være degradering af RNA, og 300 bp er det maximale, man kan oprensefradisseprøver.fordetandetkrævesmultiplexing,idetdersombeskrevetkanses mangevarianter,ogfordettredjevildetikkekunnepåvises,hvisderopstårnyevarianterfor brudstedet.derfindesenkeltekommerciellekits,mendererikkereferencerpå,atdevirkeri kliniskematerialer. Algoritme'for'testning:' Som ved andre tests anbefalesdet, atallefaseraftestningen (prehanalytisk,analytisk og postanalytiskfase)varetages/kontrolleresafenpatolog(isamarbejdemedbioanalytikerog evt. molekylærpatologisk uddannet medarbejder) og at testen udføres på et så rigeligt materialesommuligt. Følgendediagnostiskalgoritmeertraditioneltanvendt(Fig1): Fig. 1 Adenokarcinom ALK test IHC Positive (1+-3+) modificeret H-score FISH Positiv ALK positiv ALK negativ mandag den 13. maj 13 Side4af6

5 SombeskrevetovenforerderilitteraturensetgodkonkordansmellemIHCogFISH.Dadet må forudsættes, at IHC er sat korrekt op, og der anvendes positiv kontrol, anbefales algoritmen i Fig.2. Algoritmerne forudsætter at der anvendes histologisk materiale eller koagelmaterialefrafinnål.anvendescytologi(udstrygninger)børfishanvendesprimært.: Fig. 2 Adenokarcinom ALK test IHC Positiv Usikkerhed i tolkning af IHC FISH Positiv ALK positiv ALK negativ mandag den 13. maj 13 Hvordan'skal'resultatet'af'testen'rapporteres:' Mest hensigtsmæssigt skal svaret anføres som supplement til det rekvisitionsnumer, som analysenerlavetpå. AnalysenskalkodesiSNOMEDsomfølger: F29211ALKpositiv F29215ALKnegativ MedanførelseafkodeforIHCog/ellerFISH: P38003immunhistokemiskundersøgelse,paraffinsnit P33765fluorescensinsituhybridisering(FISH) Referencer: 1. MorrisSW,KirsteinMN,ValentineMB,DittmerKG,ShapiroDN,SaltmanDL,LookAT (1994)Fusionofakinasegene,ALK,toanucleolarproteingene,NPM,innonH Side5af6

6 Hodgkin'slymphoma.SciHence263: SodaM,ChoiYL,EnomotoM,TakadaS,YamashitaY,IshikawaS,FujiwaraS,Watanabe H,KurashinaK,HatanakaH,BandoM,OhnoS,IshikawaY,AburataniH,NikiT,Sohara Y,SugiyamaY,ManoH(2007)IdentificationofthetransformingEML4HALKfusion geneinnonhsmallhcelllungcancer.nature448: SasakiT,RodigSJ,ChirieacLR,JannePA(2010)ThebiologyandtreatmentofEML4H ALKnonHsmallcelllungcancer.EurJCancer46: TakeuchiK,ChoiYL,SodaM,InamuraK,TogashiY,HatanoS,EnomotoM,TakadaS, YamashitaY,SatohY,OkumuraS,NakagawaK,IshikawaY,ManoH(2008)Multiplex reversetranscriptionhpcrscreeningforeml4halkfusiontranscripts.clincancerres 14: RodigSJ,MinoHKenudsonM,DacicS,YeapBY,ShawA,BarlettaJA,StubbsH,LawK, LindemanN,MarkE,JannePA,LynchT,JohnsonBE,IafrateAJ,ChirieacLR(2009) UniqueclinicopathologicfeaturescharacterizeALKHrearrangedlungadenocarcinoma inthewesternpopulation.clincancerres15: YoshidaA,TsutaK,NakamuraH,KohnoT,TakahashiF,AsamuraH,SekineI, FukayamaM,ShibataT,FurutaK,TsudaH(2011)Comprehensivehistologicanalysis ofalkhrearrangedlungcarcihnomas.amjsurgpathol35: Schildhaus HU, Deml KF, Schmitz K, Meiboom M, Binot E, Hauke S, Merkelbach-Bruse S, Büttner R. Chromogenic in situ hybridization is a reliable assay for detection of ALK rearrangements in adenocarcinomas of the lung. Mod Pathol Jun 7. doi: /modpathol [Epub ahead of print] 8. RuschoffJ,DietelM,BarettonG,ArbogastS,WalchA,MongesG,ChenardMP,PenaultH LlorcaF,NagelmeierI,SchlakeW,HoflerH,KreipeHH(2010)HER2diagnosticsin gastriccancerhguidelinevalidationanddevelopmentofstandardizedimmunohish tochemicaltesting.virchowsarch457: YiES,BolandJM,MaleszewskiJJ,RodenAC,OliveiraAM,AubryMC,EricksonHJohnson MR,CaronBL,LiY,TangH,StoddardS,WampflerJ,KuligK,YangP(2011)Correlation ofihcandfishforalkgenerearrangementinnonhsmallcelllungcarcinoma:ihc scorealgorithmforfish.jthoraconcol6: PaikJH,ChoeG,KimH,ChoeJY,LeeHJ,LeeCT,LeeJS,JheonS,ChungJH(2011) Screeningofanaplasticlymphomakinaserearrangementbyimmunohistochemistryin nonhsmallcelllungcancer:correlationwithfluorescenceinsituhybridization.jthorac Oncol6: YangP(2011)Anaplasticlymphomakinase(ALK)statusandclinicaloutcomesbyIHC andfish:areterospectivestudyofneverhsmoker,adenocarcinomalungcancercases. LungCanHcer71:S26 S28. Side6af6