Udvikling og validering af ELISA test til bestemmelse af Newcastle Disease antistoffer i serum og æg

Udvikling og validering af ELISA test til bestemmelse af Newcastle Disease antistoffer i serum og æg Rapport over forsøg finansieret af Fjerkræafgiftsfonden i projektåret 2007/2008 Forfattere: Lis Olesen, og Joan Klausen

ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG Deltagere Dyrlæge Lis Olesen, Dansk Landbrugsrådgivning, Landscentret Fjerkræ, Fjerkræklinikken. Sektionsleder Joan Klausen, Veterinærinstituttet, DTU. Laborant Henriette Vorsholt, Veterinærinstituttet, DTU. Baggrund Formålet med projektet har været at udvikle en ELISA test til påvisning af antistoffer mod Newcastle Disease (ND) i forbindelse med kontrol af vaccination mod ND. Kontrol af vaccination mod ND er hidtil foregået ved en hæmagglutinations inhibitions test (HI) på blodprøver fra vaccinerede høns. Hensigten har derfor været at finde en sammenhæng mellem måling af antistoffer ved HI test og måling af antistoffer ved den nyudviklede ELISA test. Desuden var det hensigten at finde en sammenhæng mellem antistoffer målt ved ELISA på blodprøver og antistoffer målt ved ELISA i æggeblommer. For nuværende måles antistoffer mod ND ved 23 ugers alderen på blodprøver. Ved at lade antistofmålingerne foregå på æggeblommer kan de æg, der alligevel indsendes til undersøgelse for antistoffer for Salmonella ved 25-27 ugers alderen hos konsumægsflokke, samtidig testes for antistoffer mod ND. Herved spares såvel arbejdskraft for landmanden samtidig med, at stress hos hønsene reduceres ved at kunne erstatte blodprøveudtagning med indsamling af æg. Forsøgsplan Der blev indsat 55 hønniker i enkeltbure hos en ægproducent. Heraf var 45 ( numrene 11-55) vaccineret efter det lovpligtige Newcastle Disease vaccinationsprogram: To gange med en levende vaccine via grov spray (Nobilis ND C2) ved 3 og 9 uger og herefter med en inaktiveret ND vaccine ved flytning til æglæggerstalden. Hønnikerne blev vaccineret af dyrlæge Lis Olesen. Injektions-vaccination blev foretaget i låret med vaccinen Nobilis RT- IB multi- ND G. Fem hønniker (Hønenumre 1-5) er vaccineret alene to gange med en levende vaccine (ND C2), og fem hønniker (hønenumre 6-10) er importeret fra Sverige og er helt uvaccinerede. Disse blev inden indsætning i burene testet negative for såvel Salmonella som for ND. Hønerne blev placeret i nummererede enkeltbure i enden af en række hos en burproducent. Inden indsamling af æg på prøveudtagningsdagene blev ægbåndet adskilt af papskiver, så man undgik, at et æg fra én forsøgshøne kunne bevæge sig væk fra det pågældende bur. Æggene blev indsamlet og nummereret, inden ægbåndet startede med at køre. Der blev samtidig taget blodprøver af de pågældende høns. Disse blev straks sendt til Veterinærinstituttet i København. Æggene blev kørt til Danæg i Christiansfeld og transporteret med de æg, der alligevel skulle undersøges for Salmonella på Veterinærinstituttet i København. 2

ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG Den første prøveudtagning på blod og æg er foretaget i uge 51, 2007, altså da hønsene var 23 uger gamle. Herefter er der hver 9. uge udtaget blod og æg i alt fem gange, indtil et tilstrækkeligt grundlag er fundet til at udvikle en ELISA test på blod og æg. Den beskrevne forsøgsplan blev fulgt, bortset fra at det sidst i indsamlingsperioden blev besluttet at vaccinere fem høns med halvdelen af normaldosis. De fem høns var en del af de negative høns, der var primede med vaccinen (hønenumre 1-5), og som var forblevet negative for antistoffer mod ND i perioden. Dette forsøg blev foretaget, da alle de indsamlede prøver fra vaccinerede høns gennem hele indsamlingsperioden viste meget høje antistofniveauer i ELISA og i HI testen, og der var brug for en sammenligning af lave antistofniveauer i HI testen og i ELISA testen til beregning af et cut-off i ELISA testen. Der blev udtaget blodprøver og indsamlet æg fra de fem høns efter en, to og tre uger. Selve vaccinationen, med 0,25 ml Nobilis RT- IB multi- ND- G, blev foretaget den 3. juni 2008. Prøveudtagningerne af blod og æg blev foretaget én uge efter vaccinationen samt i de næste to uger. Værdierne efter én uge var dog allerede så høje, at fastsættelse af en cut-off værdi på grundlag af vaccination af disse høns ikke var mulig. Resultaterne af målingerne ved henholdsvis HI test og ELISA ses i tabel 3. Den sidste ordinære prøveudtagning er udført i uge 35. Hønerne er aflivede og forsøget afsluttet. Laboratoriemetoder HI test HI test foretages på udtitrerede serum prøver, hvortil en kendt mængde virus antigen tilsættes, Efterfølgende tilsættes 1 % hønseerytrocyter, og resultaterne aflæses visuelt som en titer. ELISA ELISA testen blev udviklet med henblik på at kunne teste både serumprøver og prøver fra æggeblomme. ELISA plader coates med et oprenset virus antigen og serum eller æggeblomme tilsættes i fortyndingerne 1:1.600 og 1:3.200. Der tilsættes et konjugeret sekundært antistof, og der fremkaldes efterfølgende ved en farveudvikling. ELISA pladerne aflæses spektofotometrisk. Resultaterne af de enkelte prøver beregnes som en procent af en kendt positiv og negativ kontrol, og resultaterne vises som OD % (optical density %). Resultater Der blev indsamlet blod og æg hver 9. uge, i alt fem gange. I enkelte tilfælde blev der udtaget en blodprøve, uden der samtidig blev indsamlet et æg fra den pågældende høne. Dette skyldes, at der på udtagningstidspunktet endnu ikke var æg fra den pågældende høne. En enkelt høne (nr. 29) afgik ved døden to uger efter forsøgets start. Ud fra en række forsøg med både serum og æggeblomme i forskellige fortyndinger blev det bestemt, at alle prøverne til ELISA skulle testes i to fortyndinger, henholdsvis i 1:1.600 og i 1:3.200. 3

ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG Da HI testen ikke er anvendelig på æggeblommer, blev kun serumprøver testet i HI test. Tabel 1 viser resultaterne fra de 55 forsøgshøns i forsøgsperioden med fem prøveudtagningsdatoer og et interval på ni uger mellem prøveudtagningerne med test af serum og æggeblomme testet i de to valgte fortyndinger ved ELISA og resultaterne fra de samme serumprøver testet ved HI test. Prøve 1-5 er fra høns primede med vaccinen, mens prøve 6-10 er prøver fra ikke-vaccinerede høns. Prøverne 46-55 er fra høns vaccineret efter det lovpligtige vaccinationsprogram. Serum og æggeblomme fra hønerne 6-10, der ikke var vaccinerede, eller havde kontakt med høns vaccineret med en levende vaccine, var negative og forblev negative i hele forsøgsperioden både ved ELISA og ved HI test. Prøverne 1-5 er fra høner, der var primet med levende vaccine, og som den 3. juni 2008 er vaccineret med halv dosis af en inaktiveret ND vaccine. Dette ses på såvel HI værdier som på ELISA værdierne fra 25. juni og 26. august i tabellen. Separate værdier for disse høns ses i tabel 3. Allerede ved første prøvning viste de vaccinerede høns meget høje antistofniveauer. Dette var gældende for både serumprøver og prøver fra æg testet i ELISA og for serumprøver testet ved HI test. Hen over test perioden sås et fald i antistofniveauet ved HI test, mens antistofniveauet ved ELISA generelt holdt sig højt gennem hele perioden. Forsøget viste også, at der ikke er et fuldstændigt sammenfald mellem resultaterne fra ELISA og fra HI testen, således at høje antistofniveauer i ELISA ikke direkte er lig med høje antistofniveauer i HI testen. De høje antistofværdier for ELISA på serumprøver og æggeblommer igennem hele forsøgsperioden gjorde ikke muligt at lave en sammenligning mellem lave værdier i HI testen og lave værdier i ELISA. Antistofværdierne forbliver højest i æggeblommerne, mens der dog ses et svagt fald i serumprøverne. Derfor blev det efterfølgende bestemt, at de fem primede høns (høne nr. 1-5) blev vaccinerede med halv dosis inaktiveret ND vaccine (Nobilis RT-IBmulti-ND G), og blod og æg blev udtaget efter en, to og tre uger. Tabel 1 viser, at der en uge efter vaccinationen med den lave dosis vaccine kunne måles et lavt indhold af antistoffer ved ELISA i serumprøverne. Ved HI test ses et lidt højere antistofsvar. I prøver fra æggeblommer var det ikke muligt at måle antistoffer efter den første uge. Efter 14 dage ses et højt indhold af antistoffer ved både ELISA og HI test på serumprøverne. I æggeblommer blev der fundet et middelhøjt indhold af antistoffer. Tre uger efter vaccinationen blev der fundet et højt indhold af antistoffer i både serum og æggeblommer testet ved ELISA og serum ved HI test. For yderligere at sammenligne lave værdier mellem ELISA og HI testen blev der udvalgt fem sæt af serumprøver, indsendt til den almindelige vaccinations kontrol for ND. Tabel 2 viser resultater fra serum fra fire tilfældige flokke: A, B, C og D, der er indsendt til vaccinationskontrol til Veterinærinstituttet, ved fra hver besætning i leveuge 23 at indsende 30 blodprøver. Antistofværdierne i både ELISA og HI testen af disse prøver viser en del lavere 4

ELISA TEST TIL PÅVISNING AF ANTISTOFFER MOD NEWCASTLE DISEASE I SERUM OG ÆG værdier end i det udførte vaccinations forsøg. Forsøget viste dog også, at lave antistofværdier i ELISA ikke er klart sammenfaldende med lave antistofværdier i HI testen. Fremtid Da udviklingen af antistoffer i serum og æggeblomme umiddelbart ser ud til at følges nogenlunde ad, bør fokus måske rettes mod sammenhængen mellem antistoffer i serum ved HI test og serum ved ELISA. Et forslag ville være at teste alle rutineprøver i både HI test og ELISA over en periode for at få et større grundlag til at fastlægge en cut-off værdi. En cut-off værdi kan ikke fastlægges på enkelte dyr, men kunne muligvis fastlægges for alle indsendte blodprøver fra samme flok, evt. med en gennemsnitsværdi (OD %) for den samlede indsendelse sammen med en nedre grænseværdi for enkelte prøver. Alternativt eller i sammenhæng med ovenstående kunne der også vaccineres ti høns med 1/10 dosis vaccine og derefter følge udviklingen af antistoffer efter en uge, med ugentlige indsamlinger af både blodprøver og æg i op til ti uger. Det vil yderligere give et godt beregningsgrundlag for sammenhængen mellem lave antistof værdier for de to test, og et bredere grundlag for fastlæggelse af en cut-off værdi for test på æggeblommer. Konklusion Der er udviklet en ELISA, der er i stand til at detektere antistoffer mod ND i både blodprøver og i æggeblommer. ELISA testen viser en god specificitet; Alle negative høns forblev negative gennem hele testperioden, og hos de vaccinerede høns kunne der gennem hele testperioden detekteres antistoffer mod ND. Der ses en høj grad af sammenhæng mellem udviklingen af antistoffer i blodprøver og udviklingen af antistoffer i æg. Dog ses en forsinkelse i måling af antistofferne i æggeblomme i forhold til i blodprøverne, men antistofferne i begge materialer holder sig højt gennem hele forsøgsperioden. Desværre har det høje antistofniveau gennem næsten hele forsøgsperioden gjort det svært at finde en sammenhæng mellem lave antistofmålinger ved HI test og ved ELISA, hvilket vil være nødvendigt, hvis HI testen skal erstattes med ELISA. I øjeblikket foretages der, på initiativ af Veterinærinstituttet, sortering og frysning af blodprøver, indsendt til normal vaccinationskontrol, der ikke opfylder lovens krav om en titer på over 64 eller med titer under 16 eller mellem 16 og 64. Prøverne testes via HI og via ELISA. Dette sker for at kunne finde en gyldig cut-off værdi, der kan danne grundlag for at kunne benytte en ELI- SA test som alternativ til en HI test. Der vil i foråret 2010 blive ansøgt om midler til validering af testen. 5

Tabel 1. Resultater af forsøgshøns (1-55) indsat i enkeltbure. ELISA-test HI Titer Høne nr. sera 1:1600 sera 1:3200 æg 1:1600 æg 1:3200 Prøvedato 17/12-07 20/2-08 22/4-08 25/6-08 26/8-08 17/12-07 20/2-08 22/4-08 25/6-08 26/8-08 17/12-07 20/2-08 22/4-08 25/6-08 26/8-08 17/12-07 20/2-08 22/4-08 25/6-08 26/8-08 17/12-07 20/2-08 22/4-08 25/6-08 26/8-08 1-1 1 5 111 0 1 2 109 4 4 0 99 2 2 0 97 0 0 0 4.096 2-2 1 4 105 0 0 2 96-1 2-1 99-1 2-1 97 0 4 0 4.096 3 1 2 10 111 101 2 1 5 103 95 7 4 1 108 91 3 2 0 103 83 0 4 0 4.096 512 4-2 0 3 97 118-1 0 1 91 117-1 0-1 94 109-1 0-1 97 105 0 4 0 1.024 1.024 5 0 64 62 1 46 41-1 53 40-1 36 23 0 128 128 6 0 8-1 5 0 4-1 2 3 4 2 1 2 2 1 0 4 0 0 0 7-2 3 3-1 1 1-3 0-2 -1 0-2 0 0 0 8 0 15 1 15 0 8 0 8 3 6 0 0 1 2-1 -1 4 0 0 0 9-1 0 7 3 3 0 0 4 1 1-3 1 0-3 -2-1 0 0-2 -2 0 4 0 0 0 10-3 -1 1 0-1 -1 0 0 0-1 -3 0-2 -3-3 -2 0-1 -2-2 0 4 0 0 0 11 93 45 85 43 81 104 38 65 41 76 92 89 85 84 84 99 84 79 76 80 4.096 2.048 512 1.024 256 12 90 38 63 42 81 96 22 50 27 80 86 94 75 77 82 77 91 64 70 75 4.096 4.096 512 256 128 13 59 66 66 92 51 48 52 93 93 91 95 89 83 88 83 79 2.048 4.096 512 256 14 38 29 61 33 62 33 16 46 17 59 88 83 75 86 73 85 78 73 77 70 4.096 1.024 512 256 128 15 52 47 59 52 73 50 31 47 41 66 77 81 81 86 73 76 69 69 76 63 4.096 4.096 1.024 512 512 16 72 61 77 55 53 77 99 87 88 79 91 87 85 71 4.096 2.048 512 17 56 82 81 45 75 72 92 83 99 83 93 85 88 80 4.096 1.024 512 18 33 33 63 23 62 25 22 55 14 47 71 80 88 83 66 64 71 77 66 54 4.096 4.096 1.024 256 256 19 78 45 82 55 83 77 31 73 36 73 103 87 95 85 108 71 97 85 4.096 4.096 2.048 1.024 512 20 66 40 79 45 86 54 28 72 26 86 107 97 99 80 107 87 94 74 2.048 4.096 2.048 1.024 512 21 47 41 75 51 73 39 31 64 44 66 97 71 94 91 79 97 55 88 85 77 4.096 4.096 1.024 512 256 22 38 31 80 36 68 25 20 66 31 52 77 66 81 88 72 73 48 64 81 64 2.048 2.048 1.024 512 512 23 29 82 20 73 72 70 74 54 55 61 2.048 512 24 48 58 99 52 37 42 98 34 87 87 91 90 87 80 86 80 4.096 4.096 2.048 512 25-1 0 11 75 0 0 8 54 1 2 3 1 1 1 32 8 0 1.024 26 64 55 98 77 97 63 42 107 57 97 95 93 104 105 101 104 94 105 104 100 4.096 4.096 4.096 2.048 2.048 27 74 67 81 85 70 70 64 86 71 70 87 99 88 109 84 97 91 92 102 86 4.096 4.096 4.096 1.024 512 28 88 73 89 81 64 93 91 97 93 98 92 101 4.096 4.096 4.096 29 30 59 34 81 42 40 46 22 77 27 28 93 89 85 89 69 98 83 80 77 61 4.096 4.096 1.024 512 512 31 71 34 78 40 57 23 72 27-4 81 85 77-2 61 79 66 1.024 1.024 256 128 32 33 76 63 88 67 58 52 90 57 101 97 97 85 95 83 93 82 4.096 4.096 2.048 512 34 72 31 77 79 62 75 23 77 67 51 80 90 85 91 72 83 74 83 82 76 2.048 4.096 1.024 512 256 35-3 0 0-2 -1-1 0 0-2 -1-3 -1-1 4-2 -2 0-1 1-2 0 8 0 0 0 36 35 33 44 26 28 28 82 85 82 77 71 65 2.048 512 128 37 79 91 40 50 58 78 89 29 33 41 89 86 90 90 86 89 81 79 74 78 4.096 4.096 1.024 1.024 512 38 74 85 69 74 67 87 51 66 85 95 97 80 85 90 90 78 1.024 4.096 512 256 39 93 93 53 103 87 95 84 39 88 87 91 95 98 90 87 92 91 87 81 84 4.096 2.048 1.024 1.024 512 40 78 33 84 73 72 25 70 68 79 65 76 70 72 48 57 70 1.024 512 128 128 41 64 75 46 92 95 61 66 39 80 77 83 82 81 85 83 81 74 57 63 65 2.048 4.096 1.024 512 256 42 86 92 56 105 90 97 43 96 96 92 93 94 95 98 86 88 4.096 4.096 2.048 2.048 43 90 79 48 101 90 100 77 37 90 89 88 88 96 93 92 96 85 82 70 77 4.096 4.096 1.024 1.024 512 44 86 86 40 95 88 89 77 32 81 75-3 90 94 90 92-1 84 74 68 75 512 4.096 1.024 256 128 45 85 90 58 103 102 92 90 47 85 96 92 95 106 96 101 92 91 92 77 85 4.096 4.096 2.048 1.024 1.024 46 84 80 42 90 83 87 68 28 75 67 85 80 83 90 81 86 71 75 64 72 2.048 4.096 512 512 512 47 89 71 58 101 88 57 49 95 95 106 100 101 92 102 92 83 4.096 1.024 512 512 48 50 55 100 87 51 42 85 74 81 86 92 95 81 87 75 82 4.096 1.024 1.024 512 49 63 61 56 105 103 50 48 45 92 93 88 90 88 101 101 93 98 88 84 90 4.096 4.096 2.048 2.048 1.024 50 58 69 61 39 76 38 50 48 27 58 90 95 86 80 85 78 96 83 70 71 1.024 4.096 512 256 256 51 84 63 64 61 91 76 47 53 52 87 93 86 80 79 100 99 92 79 79 90 4.096 4.096 4.096 2.048 1.024 52 72 70 78 57 70 57 59 65 46 57 89 94 93 89 85 103 96 90 85 90 4.096 4.096 4.096 1.024 1.024 53 60 36 77 35 65 43 23 65 27 45 93 87 93 89 89 94 93 84 82 78 4.096 4.096 512 1.024 512 54 65 60 92 42 82 51 50 82 31 66 92 83 97 84 89 100 81 96 82 87 4.096 4.096 2.048 1.024 512 55 82 85 88 68 90 75 79 81 61 93 98 86 94 90 93 104 92 92 88 83 4.096 4.096 4.096 2.048 1.024

Tabel 2. Resultater af fire tilfældigt indsendte flokke til vaccinationskontrol. ELISA 1:1600 1:3200 Floknr./prøvenr. A B C D A B C D A B C D 1-1 2 11 13 0 1 6 8 4096 2 16 64 2 37 24 16 28 23 16 9 20 2048 256 32 1024 3 20 11 17 17 12 7 10 10 2048 32 64 64 4 1 38 5 6 1 30 3 4 16 256 32 128 5-1 12 8 31 0 8 5 21 4 64 64 512 6 5 7 6 36 3 3 3 25 128 16 64 512 7 19 12 13 14 12 7 7 9 2048 128 64 64 8 60 4 38 17 49 2 27 10 4096 16 512 64 9 1 23 10 17 0 13 5 10 16 64 32 64 10 39 9 14 12 22 5 8 7 4096 16 64 16 11 38 0 29 6 28 0 14 3 512 4 64 64 12 16 14 16-1 9 8 8-1 512 64 16 1024 13 70 51 20 6 62 43 11 3 4096 256 32 64 14 41 2 24 13 29 1 13 7 4096 8 64 256 15-1 40 44 20 0 27 27 12 8 256 64 512 16 3 2 65 15 2 1 41 8 8 32 256 512 17 5 13 52 3 3 7 35 1 256 64 128 64 18 49 5 19 11 37 3 10 6 4096 16 16 256 19-1 24 47 6 0 16 29 3 4 256 64 64 20 20 8 56 42 13 5 33 26 256 32 32 512 21 9 0 17 5 6 0 10 3 256 4 16 64 22 0 5 10 18 0 3 6 12 4 8 32 512 23 83 3 18 5 75 1 11 3 4096 16 128 64 24 11 5 20 4 7 3 13 3 256 64 64 32 25 0 26 29 2 1 15 16 1 4 256 64 16 26-1 0 14 2 0 0 8 1 1024 8 128 32 27 0 17 14 2 0 9 10 1 2 128 16 64 28 16 31 15 4 11 18 9 3 64 256 64 64 29 15 4 26 14 10 2 16 9 128 16 32 512 30-1 36 10 4 0 23 6 3 4096 512 64 64 Hi-titer

Tabel 3. Resultater af målinger på seronegative forsøgshøns 1-5, vaccineret med halv dosis af en inaktiveret NDvaccine og testet efter én, to og tre uger. ELISA Høne nr. sera 1:1600 sera 1:3200 sera 1:8000 æg 1:1600 æg 1:3200 æg 1:8000 Prøvedato 11/6-08 18/6-08 25/6-08 11/6-08 18/6-08 25/6-08 11/6-08 18/6-08 25/6-08 11/6-08 18/6-08 25/6-08 11/6-08 18/6-08 25/6-08 11/6-08 18/6-08 25/6-08 11/6-08 18/6-08 25/6-08 1 15 93 111 9 85 109 0 25 86 0 63 99-1 51 97 1 28 93 256 2048 4096 2 17 100 105 12 96 96 0 28 76-1 79 99-1 64 97 0 31 82 512 2048 4096 3 32 102 111 22 95 103 87 108 103 94 1024 2048 4096 4 28 77 97 18 68 91 0 43 62 0 90 94-1 85 97 0 47 67 256 1024 1024 5 2 15 64 1 9 46 0 2 25 13 9 53 4 4 36 0 3 28 16 512 128 HI Titer