MeDIS Exam 2015 Titel på kursus: Uddannelse: Semester: Videregående biokemi og medicinudvikling Bachelor i Medis 5. semester Eksamensdato: 26-01-2015 Tid: kl. 09.00-11.00 Bedømmelsesform 7-trin Vigtige oplysninger: Husk at medbringe dit studiekort til eksamen Husk at opgive studienummer ikke navn og cpr.nr. på alle ark, der skal medtages i bedømmelsen Husk at aflevere besvarelsen, også hvis du forlader eksamen, før den er slut Hele eller dele af opgaven kan være formuleret på engelsk (NB! der vil ikke blive stillet ordbøger til rådighed) Der vil blive udleveret lommeregner (Texas Ti-30XB). Øvrige hjælpemidler er ikke tilladt Det er tilladt at skrive besvarelsen på dansk eller engelsk Anvend den tildelte skriveplads i eksamenssættet. Ingen former for kommunikation er tilladt Tabeller og figurer i Appendix kan benyttes til at løse opgaverne. Summen af points er 100 for en optimal opgave besvarelse. Husk at uddybe svar og beregninger hvor det er muligt idet korte ja/nej svar er utilstrækkeligt. Side 1 af 10.
Bakterier er kilder til bioaktive molekyler hvor proteiner med specifik enzym aktiviteter kan være lægemiddelkandidater, herunder ved interaktion med andre proteiner eller ligander. Penicillium nalgiovense PNA9 udskiller en ekstracellulær alkalisk protease som blev oprenset gennem flere trin og karakteriseret biokemisk. 1. (15) Forskerne høstede vækstmediet fra kulturen og oprensede proteinet ved en kombineret anvendelse af gel filtrering (A) og omvendt-fase kromatografi (B). - Vækst mediet indeholder mange salte og uønskede små biomolekyler som skal fjernes inden gel filtrering. Forklar princippet bag to mulige metoder hertil. - Skitser og forklar de grund liggende fysisk kemiske forskelle mellem de to kromatografiske metoder (A, B). - Proteinet blev isoleret med reducerende gel elektroforese (C). Forklar denne grundliggende separations mekanisme og redegør for formlen for migrations hastighed ved elektroforese v = Ez/f 2. (15) Den kromatografiske separation blev monitoreret ved uv-vis-spektroskopi A280nm - Hvilke aminosyrer bidrager signifikant til denne absorption og skitser deres struktur - Aminosyren cystein har ioniserbar sidekæde og pka lig 8.3. Forklar konsekvensen heraf ved ph 2.7 hvor den kromatografiske separation (B) fandt sted. - Identifikation af proteinet blev foretaget ved Edman N-terminal sekventering. Forklar kort denne teknik. (C) Protein Side 2 af 10.
Side 3 af 10. Studienummer:
3. (15) Den biokemiske evaluering påviste en serin protease aktivitet og effekten af temperatur, ph og NaCl koncentration blev undersøgt. Den intakte masse blev bestemt til 45.2 kda ved elektrospray masse spektrometri og identitet udfra N-terminal sekventering og BLAST søgning af sekvens: MGFLKLLKGSLAT - Fremstil en mrna sekvens som vil afkodes i ribosomet til ovenstående protein sekvens. - Ved variation af temperatur og ph (se grafer nedenfor) blev iagttaget en variation. Begrund med udgangspunkt i grafer denne variation på basis af protein struktur egenskaber. - Ved tilsætning af hhv. CaCl 2, MnSO 4, MgCl 2 eller ZnSO 4 i koncentrationer på 5mM fandt forskerne en variation i protease aktivitet mellem 132% til 25%. Begrund hvordan disse salte kan have indflydelse på enzym aktiviteten Side 4 af 10.
4. (15) Bestemmelse af K m og V max blev udført under anvendelse azocasein som substrat. Enzymet blev inkuberet med forskellige koncentrationer af azocasein (0,25-4,0 mg) og blev analyseret under anvendelse af standardmetode. De kinetiske parametre K m, V max, og k cat blev beregnet ved Lineweaver- Burk dobbelt reciprok plots. - Redegør med egne ord for betydningen af K m og V max. Beregn disse udfra aflæsning på nedenstående figur i hhv mg/ml og mg/ml/min. - Beregn hastighedskonstanten k cat. - Proteasen kan inhiberes ved tilsætning af kompetitiv inhibitor. Skitser reaktions hastigheden v som funktion af [S] ved en stigende inhibitor koncentration. Vil V max for enzymet ændres? Side 5 af 10.
Side 6 af 10. Studienummer:
5. (20) Antithrombin (AT3) er en serpin peptidase inhibitor og blev anvendt som test substrat ved den biokemiske udredning af den alkaliske protease. AT3 blev først oprenset fra plasma ved heparin affinitetskromatografi. 10 ml plasma sattes på en kolonne. Efter oprensningen (elueringen) fandtes AT i 3 fraktioner (a,b,c), hver med et volumen på 5 ml. AT- koncentrationen i plasma og fraktioner bestemtes ved hjælp af standardopløsninger ved følgende reaktioner: a. AT + Thrombin (overskud) ---> AT/Thrombin + Thrombin (rest) b. Polypeptid-pNA + H2O ---> Polypeptid + pna Hydrolysen af polypeptidet er katalyseret af frit Thrombin. Det frisatte pna absorberer lys af bølgelængden 405 nm. Standard Prøve A405 AT: 0,000 U/ml 0,500 AT: 0,050 U/ml 0,400 AT: 0,100 U/ml 0,300 AT: 0,150 U/ml 0,220 AT: 0,200 U/ml 0,125 Fraktion a 0,450 Fraktion b 0,250 Fraktion c 0,350 Plasma 0,200 De 3 fraktioner og plasma var fortyndet 100 gange 1. Beregn koncentrationen af Antithrombin i plasma og i de 3 fraktioner. 2. Beregn udbyttet efter oprensningen. Proteinkoncentrationen i plasma bestemtes til 65 mg/ml og i fraktion b til 0,25 mg/ml. 3. Beregn oprensningsgraden i fraktion b. Side 7 af 10.
Side 8 af 10. Studienummer:
Allround spørgsmål (20) - kort & præsis besvarelse ønskes 1. (2) Hvilken information får man ved analyse af molekyler med teknikken NMR? 2. (2) Bestemmelse af protein strukturer ved røntgenkrystallografi sker ud fra protein krystaller. Hvorfor? 3. (2) Hvilke to typer protein glykosylering ses ofte hos eukaryote? 4. (2) Enzym katalyse ved approximation betyder? 5. (2) ABC transportere har to funktionelle domæner. Hvilken rolle har disse domæner i transport processen? 6. (2) Energien som er påkrævet for at transportere neutrale molekyler mod en koncentrations gradient over en membran kan bestemmes ved G = RT ln (c1/c2). Hvilken andre faktorer skal tages højde for hvis transporten sker for ladede ioner imod et membran potentiale? 7. (2) Hvad er fælles for camp, Ca2+ og IP3? 8. (2) mrna hos Eukaryote påføres often en polya hale efter transkribtion. Hvilken funktion har denne? 10. (2) Hvordan inducerer stereocilier i det indre øre en lyd til en signal transduktion? Side 9 af 10.
Appendix: Genetisk kode tabel (mrna til Protein): Side 10 af 10.