Katalog Specialeprojektideer
Æg: Side Content and composition of xanthophylls and aroma compounds in organic eggs by feeding different roughage materials 4 Frisk frugt og grønt: Metaboliske forandringer i frisk frugt og grønt efter høst 5 Bioaktive naturstoffer: Identifikation af naturstoffer fra udvalgte medicinplanter med potentiel biologisk aktivitet overfor type 2 diabetes 6 Undersøgelse af forarbejdningens betydning for centrale bioaktive stoffer i Amerikansk ginseng (Panax quinquefolium) 6 Undersøgelse af indholdet og udbredelsen af bioaktive polyacetylener af falcarinoltypen i vegetabilske fødevarer 8 Isolering og identifikation af kontaktallergener fra sølvtråd (Calocephalus brownii) 9 Kød: Interaction between different proteolytic enzyme systems in meat 10 Changes in protein structures from meat as a consequence of protein oxidation 11 Kernemagnetiske resonansstudier i fødevareforskning 12 Intra litter variation in gene expression in primary muscle satellite cell cultures from pigs 13 How is muscle development affected by protein supply in pigs? 14 Karakterisering af mørhedsudvikling i kød fra grise med forskellig alder/vægt ved hjælp af måling af calpainer, proteasomer og cathepsiner i eksisterende biopsimateriale 15 Mælk: Bioaktive peptider fra mælkeproteiner med sårhelende effekt på celler i mave tarm kanalen 16 Kvalitetsforringende enzymer og proteolyse i mælk med forskelligt celletal 17 Klumper i mælk sammensætning og årsager 18 Reducering af lipolyse i rå mælk 19 2
Purification and characterisation of low abundance bioactive peptides in milk 20 Influence of milk derived peptides on the NF kb expression in cells 21 Characterisation of peptides in a simulated gastrointestinal digest of food 22 Generation of in house searchable database for milk derived proteins and peptides 23 Kinetics and mechanisms of selenomethionine oxidation in different milk related systems 24 Elucidation of factors affecting lactoperoxidase induced dityrosine formation in cows milk 25 Development of a quartz crystal microbalance biosensor for detection of bioactive components in foods 26 3
Content and composition of xanthophylls and aroma compounds in organic eggs by feeding different roughage materials A range of parameters such as hen genotype, hen age, feed, storage and various treatments affects the quality of hen eggs. In organic egg production, in contrast to other egg production systems, the hens are offered roughage material. This is usually given as fresh or silages of plant material such as maize, carrots, alfalfa, grass, clover etc. Previous studies have indicated that the roughage material can influence the quality of the eggs regarding sensory taste and appearance of the yolk. Therefore it is of interest to study if and how specific roughage materials given to hens in an organic egg production system 1) affect the transfer of xanthophylls from feed to egg yolk and 2) affect the content and composition of aroma compounds giving flavour to the egg. The red and yellow xanthophylls are deposited in the egg yolk and contribute to the yolk colour. Furthermore, some of the xanthophylls e.g. lutein is known to be important for the human health as antioxidant in the macula of the eye. The volatile aroma compounds in the egg contribute to the eggs sensory quality, which can be both as negative and positive factors. As example, fish meal and rapeseeds are known to give fishy odour and taste of eggs when fed to egg laying hens. The roughage material can, however, also contribute to egg taste by incorporating aroma compounds with positive sensory attributes. The present study is part of a project on organic egg production and quality, which is financed by the FØJOIII programme. The animal experiments are designed and take place at the Faculty s organic hen facilities including 48 hen houses with yards. Purpose: The purpose is to study how the hen egg contents and compositions of xanthophylls and aroma compounds are affected by feeding the hen different sources of roughage Phases in study: (changes can be discussed with the student) Establishment of method for xanthophylls analysis in egg yolk by HPLC Establishment of method for aroma compound analysis in whole egg by GCMS Participating in the animal feeding and egg collection in outdoor facilities together with data collection of egg production Analysis of egg yolks for xanthophylls content and relative composition together with yolk colour during a certain feeding period Analysis of whole egg content for characteristic volatile compounds contributing to the aroma of the eggs Correlating data of feed intake and content with the above described quality parameters of eggs. Study period: The main experiment with animals is taking place from 1 st April 1 st October 2008, so the practical part of the present study should be within this range. Place: Dept. of Food Science, Faculty of Agricultural Sciences, University of Aarhus, DK 8830 Tjele Contact: Senior scientist Marianne Hammershøj, 8999 1285, mah@agrsci.dk 4
Forslag til specialeprojekter af 1 års varighed inden for: Kvalitet af frisk frugt og grønt: Metaboliske forandringer i frisk frugt og grønt efter høst Den danske forbruger efterspørger i stigende grad frisk frugt og grønt og produkter heraf, der har en høj gastronomisk kvalitet og er spiseklare eller klar til direkte brug i sandwichs, salater og forskellige varme retter. Denne form for forarbejdning stiller meget store krav til fødevareindustrien og distributører af disse produkter. Frugt og grønt er levende, hvilket bevirker at produkterne gennemgår forskellige biologiske processer efter høst, der ændrer kvaliteten. Mange af disse processer er temperaturafhængige, men selv under optimale opbevaringsforhold er det vanskeligt at bevare en høj gastronomisk kvalitet i frisk frugt og grønt. Ved at pakke frisk frugt og grønt i folie er det muligt at bevare produkternes oprindelige kvalitet i længere tid end hvis de blev opbevaret uden folie ved samme temperatur. Dette skyldes, at folien og produktet i fællesskab ændrer på luftens indhold af ilt og kuldioxid som så nedsætter de biologiske aldringsprocesser. Men dette er kun tilfældet, hvis foliens fysiske egenskaber matcher produktets behov for ilt og kuldioxid. Hvis gennemtrængeligheden af ilt og kuldioxid i folien er for høj i forhold til produktets behov, mister produktet smag og sundhedsbetydende stoffer. Omvendt bliver produktet surt, hvis gennemtrængeligheden af ilt og kuldoxid er for lav i forhold til produktets behov. Formålet med dette speciale er at karakterisere flygtige indikatorstoffer i frisk frugt og grønt, som påvirkes af ændrede ilt og kuldioxidkoncentration at undersøge stoffernes betydning for gastronomisk kvalitet at udvikle en hurtigmetode til kvantificering af stofferne Vi kan tilbyde et speciale af et års varighed, hvor fokus er rettet på opsamling, identificering og kvantificering af potentielle flygtige stoffer fra frisk frugt og grønt opbevaret under forskellige iltog kuldioxidforhold. Danmarks JordbrugsForskning råder over metoder til dynamisk headspaceopsamling, termisk desorption samt analytisk og strukturopklarende kromatografiske metoder (GC FID, GC MS). Mere information om dette speciale fås ved henvendelse til seniorforsker Merete Edelenbos, Aarhus Universitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Institut for Råvarekvalitet, Forskningscenter Årslev, E mail: merete.edelenbos@agrsci.dk, tlf. 89 99 34 06. 5
Forslag til specialeprojekter af 1 års varighed inden for: Bioaktive naturstoffer Identifikation af naturstoffer fra udvalgte medicinplanter med potentiel biologisk aktivitet overfor type 2 diabetes Type 2 diabetes er en af nutidens hurtigst voksende livsstilssygdomme bl.a. pga. af den stigende fedme epidemi. I den medicinske behandling af type 2 diabetes anvendes hovedsagelig stoffer, der øger kroppens følsomhed overfor insulin. Disse syntetiske stoffer har dog flere uønskede bivirkninger, hvor en af de væsentligste er, at man bliver mere fed. Da fedme er en af de mest centrale årsager til type 2 diabetes bider behandlingen af gode grunde sig selv i halen. Derfor er der et stort behov for nye alternative medicinske præparater uden væsentlige bivirkninger. Planter indeholder sådanne anti diabetiske naturstoffer. Til at finde frem til planter og naturstoffer med en effekt på type 2 diabetes benyttes en række bioassays, hvor en positiv effekt i disse testsystemer indikerer en mulig effekt overfor sygdommen. Ved hjælp af disse bioassays har vi allerede identificeret en række planter, herunder boghvede, rød solhat, hyldebær og vintersar, som indeholder naturstoffer med en potentiel effekt overfor type 2 diabetes. Vi kan derfor tilbyde specialer, hvor fokus er rettet på isolering og identifikation af potentielle antidiabetiske stoffer fra planter ved brug af bioassaystyret kromatografisk fraktionering. Ved isolering af bioaktive naturstoffer gøres brug af teknikker som kolonnekromatografi, TLC, analytisk og præparativ HPLC og til strukturopklaringen af de isolerede bioaktive stoffer anvendes teknikker som massespektrometri (GC MS, LC MS etc.) samt 1D og 2D NMR. Mere information om specialer indenfor type 2 diabetes kan fås ved henvendelse til Lars Porskjær Christensen, Adjungeret Professor, Aarhus Universitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Faktultet, Institut for Råvarekvalitet, Forskningscenter Årslev. E mail: larsp.christensen@agrsci.dk, tlf. 89 99 33 67. Undersøgelse af forarbejdningens betydning for centrale bioaktive stoffer i Amerikansk ginseng (Panax quinquefolium) Ginseng er kendt for sine mange medicinske effekter, herunder immunstimulerende og antidiabetiske effekt samt en forebyggende effekt mod udvikling af kræft. De mest centrale bioaktive stoffer i ginseng er ginsenosider (saponiner) og polyacetylener. Ginsengpræparater sælges ofte tørret i form af pulver/piller eller som tinkturer baseret på tørrede rødder. Der er lavet en del undersøgelser på forarbejdningens betydning på indholdet af bioaktive stoffer i ginseng og karakteristisk for disse undersøgelser er, at de kun fokuserer på indholdet af ginsenosider og ikke polyacetylener. Desuden er referencematerialet (friske rødder) i alle nuværende undersøgelser ikke identisk med de tørrede rødder. Da indholdet af bioaktive stoffer varierer mellem de enkelte rødder, er de nuværende undersøgelser derfor ikke særlig præcise. Ginseng rødder består af en stor hovedrod og flere mindre siderødder og vi har demonstreret, at indholdet i disse siderødder er repræsentativ for indholdet i hele roden. Ved at analysere en af siderødderne (frisk reference) for ginsenosider og polyacetylener og tørre resten af roden vil det være muligt præcist at bestemme tørringens betydning på indholdet af bioaktive stoffer. Vi kan derfor tilbyde et speciale, hvor effekten af tørringens betydning for indholdet af bioaktive stoffer i ginsengrødder bestemmes præcist og hvilke nedbrydningsprodukter, der evt. dannes under 6
forarbejdningen og om disse er bioaktive. Ginsenosider og polyacetylener bestemmes vha. analytisk HPLC. Isolering af eventuelle nedbrydningsprodukter af bioaktive stoffer foregår ved kolonnekromatografi, præparativ HPLC og identifikation ved 1D og 2D NMR samt massespektrometri. Mere information om dette speciale kan fås ved henvendelse til Lars Porskjær Christensen, Adjungeret Professor, Aarhus Universitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Institut for Råvarekvalitet, Forskningscenter Årslev. E mail: larsp.christensen@agrsci.dk, tlf. 89 99 33 67. 7
Undersøgelse af indholdet og udbredelsen af bioaktive polyacetylener af falcarinol typen i vegetabilske fødevarer Polyacetylener af falcarinol typen er meget interessante bioaktive stoffer i grøntsager, der tilhører skærmplantefamilien så som gulerødder, selleri, bladselleri og persille etc. Disse polyacetylener har vist immunstimulerende og anti inflammatorisk effekt og en forebyggende effekt mod udvikling af hjerte karsygdomme og ikke mindst kræft. Disse stoffer anses derfor som vigtige i forhold til at kunne forklare nogle af de sundhedsgavnlige effekter af grøntsager fra skærmplantefamilien. Der er kun lavet meget få undersøgelser om udbredelsen af polyacetylener af falcarinol typen i grøntsager og det er derfor vigtigt at få bestemt indholdet og variationen af disse stoffer i de nævnte grøntsager for at kunne bestemme det daglige indtag af disse forbindelser. Endelig vil det være yderst interessant om nogle af disse grøntsager indeholder nye polyacetylener med endnu ikke klarlagt biologisk aktivitet. Vi kan derfor tilbyde et speciale, hvor en lang række grøntsager fra skærmplantefamilien undersøges for indhold af bioaktive polyacetylener samt evt. isolering og identifikation af nye polyacetylener. Polyacetylener kvantificeres i planteekstrakter vha. analytisk HPLC og isoleres ved kolonnekromatografi og præparativ HPLC og identificeres ved 1D og 2D NMR og massespektrometri. Mere information om dette speciale kan fås ved henvendelse til Lars Porskjær Christensen, Adjungeret Professor, Aarhus Universitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Institut for Råvarekvalitet, Forskningscenter Årslev. E mail: larsp.christensen@agrsci.dk, tlf. 89 99 33 67. 8
Isolering og identifikation af kontaktallergener fra sølvtråd (Calocephalus brownii) Kontaktallergi eller kontakteksem fra planter, herunder vegetabilske fødevarer, er i omfang ikke særlig udbredt, men det er et problem for dem det går udover. Årsagen til kontaktallergi skyldes, at nogle planter indeholder naturstoffer, der i stand til at reagere med hudens proteiner og dermed fremkalde en allergisk reaktion. En af de planter, der er blevet introduceret på det Europæiske marked som prydplante, er sølvtråd, som har vist sig at forårsage kontakteksem. Et af de stoffer, der forårsager denne allergiske reaktion, er blevet identificeret som en sesquiterpenlakton, calocephalin. Planten indeholder dog flere sesquiterpenlaktoner, hvis kemiske struktur og allergifremkaldende effekt endnu ikke er klarlagt. Vi kan derfor tilbyde et speciale, hvor de resterende sesquiterpenlaktoner isoleres og karakteriseres samt. Samtidig skal der udvikles en HPLC metode til hurtig kvantificering af disse stoffer i planten og endelig skal de isolerede stoffer eventuelt testes for allergifremkaldende aktivitet på patienter. Sesquiterpenlaktoner isoleres ved kolonnekromatografi og præparativ HPLC og identificeres ved 1D og 2D NMR samt massespektrometri. Mere information om dette speciale kan fås ved henvendelse til Lars Porskjær Christensen, Adjungeret Professor, Aarhus Universitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Institut for Råvarekvalitet, Forskningscenter Årslev. E mail: larsp.christensen@agrsci.dk, tlf. 89 99 33 67. 9
Interaction between different proteolytic enzyme systems in meat a hypothesis generating study Natural occuring proteases in muscles are important for the tenderization process in meat, even though their original function are in the regulation of protein turnover in the living muscle. The Ca 2+ dependent calpain system is suggested to initiate the protein degradation in vivo and post mortem tenderisation, but also other proteases seems to be involved in the degradation of muscle proteins post mortem, such as the lysosomal cathepsins and the proteasome complex. Recently we presented results that indicate a sequential degradation of the structural proteins post mortem, where the calpains initiates the disruption and destabilisation of the myofibrillar structure, and thereby allows the proteasome complex to act. However, the interaction between the proteolytic enzyme systems is not described in detail. The different enzymes has very different ph optima, which is very decisive for the post mortem protease activities in meat, and the interaction between the calpain system, the proteasome complex and the cathepsins should therefore be characterised with ph as one of the variables. Purpose: Characterisation of the hydrolysates formed after enzymatic hydrolysis of muscle proteins by the calpains found in meat Characterisation of the hydrolysates formed after enzymatic hydrolysis of muscle proteins by the proteasome complex Characterisation of the hydrolysates formed after enzymatic hydrolysis of muscle proteins by the cathepsins Quantification of the release of peptides from o the calpain digest o the protasome digest o the cathepsins digest o the calpains + the proteasome + the cathepsins digest Generate hypothesis for possible interactions between proteolytic enzymes involved in post mortem tenderisation of meat Methods: Characterisation/quantification of the hydrolysates is performed by: LC MS (ES) MALDI TOF TOF SDS page Western blotting N terminal (fluorescamin/opa) Place: Dept. of Food Science, The Faculty of Agricultural Science, University of Aarhus Contact: Project Senior scientist Margrethe Therkilsen, 8999 1240, Margrethe.Therkildsen@agrsci.dk Ph.D. student Trine Kastrup Dalsgaard, 8999 1104, Trine.Dalsgaard@agrsci.dk 10
Changes in protein structures from meat as a consequence of protein oxidation Oxidation of proteins in meat is a major issue due to the high impact on tenderness and capacity to contain water. The post mortem processes where the well ordered protein structures of the myofibrils are being degraded are very important for these quality traits. This degradation is to some extend dependent on the thiol proteases calpain and m calpain. These enzymes are calcium regulated by and m molar concentrations of calcium, respectively. Properties of both the enzyme and the substrate is critical and model proteins could comprise both an enzyme and a substrate protein. The model enzyme could be either of the calpains, since it is well known that the activity of these enzymes are compromised upon oxidation, while the actual structural and oxidative characteristics responsible for this is poorly investigated. A substrate protein could be one of the proteins that link adjacent myofibrils e.g. desmin. Proteins oxidise when exposed to e.g. oxygen, which is inherent in the meat tissue and further accelerated upon exposure to the atmosphere during retail, but also light exposure at retail and heat exposure during cooking induce oxidative changes. The protein oxidation can be described by measuring discrete parameters such as dityrosine formation and carbonyl groups supported by describing the changes in the overall protein structures (secondary, tertiary and quaternary). Purpose: The purpose of the project is to obtain knowledge about how oxidation of meat proteins influence the protein structures. Phases, which can be changed according to wishes from the student: Purification of protein(s) from meat Effects of protein oxidation on protein structural modifications, investigated in model system with model proteins representing different proteins Protein oxidation of meat proteins in their natural matrix Methods that can be applied in the study: Fluorescence spectroscopy: tryptophan excitation and surface hydrophobicity by different probes (ANS, CPA, PRODAN) Circular dichroism: secondary structure FPLC is applied for gelfiltration, cross linking LC MS: carbonyls HPLC reverse phase: dityrosine, specific cross linking MALDI TOF TOF (MS): changes in digestibility GC/GC MS: Volatile off flavours Spectrofotometry: Disulfide/Thiol interchange Differential Scanning Calorimetri: denaturation enthalpy and point Tensiometry: surface activity Place: Dept. of Food Science, The Faculty of Agriculture, University of Aarhus Contact: Senior scientist Jette Young, 8999 1168, JetteF.Young@agrsci.dk Ph.D. student Trine Kastrup Dalsgaard, 8999 1104, Trine.Dalsgaard@agrsci.dk 11
Kernemagnetiske resonansstudier i fødevareforskning Kernemagnetisk resonans (NMR) er en spektroskopisk metode, hvor kernernes magnetiske egenskaber udnyttes til at opnå information om fysiske og kemiske karakteristika. Således kan NMR for eksempel anvendes til at kigge på vandfordeling eller til at studere fedtkrystallisation i fødevarer. Stofsammensætningen i blod og urin kan også analyseres ved hjælp ad NMR, og således kan NMR også bruges til at undersøge hvordan kroppen reagerer på indtagelse af forskellige fødevarer. Der er mange anvendelsesmuligheder af NMR, og alt afhængig af din interesse, kan vi skrue et projekt sammen der passer til dig. Det kan for eksempel dreje sig om at undersøge vandfordeling i kød under frysning med henblik på at kortlægge hvordan man ved salttilsætning kan manipulere med vandet i kødets frysepunkt. Det kan også være at undersøge hvordan tilsætning af forskellige komponenter påvirker ved hvilken temperatur at krystallisationen af mælkefedt sætter ind. Eller det kan være at undersøge de biokemiske effekter når man fodrer grise med gulerødder. Contact: Senior scientist Hanne C. Bertram, 8999 1506, HanneC.Bertram@agrsci.dk 12
Intra litter variation in gene expression in primary muscle satellite cell cultures from pigs. Within litter variation in postnatal muscle growth is large. This variation in muscle growth can be explained by variation in both the number of muscle fibres developing during foetal life and the growth rate of the individual muscle fibres postnatal. The growth rate of the fibres postnatal is dependent on the activity of myogenic satellite cells to proliferate and fuse with existing muscle fibres, thereby adding additional DNA to the fibres. This process is a crucial step during muscle growth, because DNA provides the machinery for protein synthesis in the muscle. Also the protein turnover within fibres is of great importance for muscle growth. In this study, gene expression of factors which control proliferation, differentiation and protein turnover will be studied by real time RT PCR in cultures of primary satellite cells isolated from small, average and large pigs within litters. Within litter variation in the ability of these satellite cells to proliferate and differentiate in cultures has been found, and this study will focus on differences in gene expression which can help explain this variation. Master thesis Contact person: Pia M. Nissen, e mail: piam.nissen@agrsci.dk 13
How is muscle development affected by protein supply in pigs? Growth retardation during foetal life and low birth weight is known to increase the risk of developing welfare diseases like obesity, type 2 diabetes and coronary heart disease. Studies of animal models have shown that also muscle development is impaired in low birth weight animals. Muscle development and growth is affected by nutrient supply and growth factors throughout both foetal development and postnatal growth. Protein supply is of great importance for muscle growth, as protein is the source of amino acids for muscle protein synthesis, and decreased protein supply during foetal life has also revealed a negative effect on muscle development in pigs. In this study, muscle development will be studies in 150 d old pigs which has been subjected to a low or average protein supply during foetal and postnatal growth. The main objective will be to estimate the number of muscle fibres formed during foetal muscle development, as well as the growth rate of individual muscle fibres during postnatal growth. Master thesis Contact person: Pia M. Nissen, e mail: piam.nissen@agrsci.dk 14
Er ungt kød mere attraktivt? Nogle vil svare klart ja men hvordan ser det ud, når vi snakker svinekød? Det vil vi belyse i nedenstående projekt. Karakterisering af mørhedsudvikling i kød fra grise med forskellig alder/vægt ved hjælp af måling af calpainer, proteasomer og cathepsiner i biopsimateriale I projektet vil vi belyse, hvordan mørheden ændrer sig med stigende vægt/alder af grisen. Mørhedsudvikling i kød er et resultat af proteolyse efter slagtning. De samme enzymer regulerer proteinomsætningen i det levende dyr. En undersøgelse af forskellige proteolytiske enzymer (calpainer, proteasomer og cathepsiner) ved stigende vægt/alder vil derfor give et udtryk for, hvorfor kvaliteten af kød ændrer sig med stigende alder/vægt. Allerede nu ved vi, at mrnaekspressionen af calpain ændrer sig med stigende alder, men hvordan ser det ud for proteinekspressionen og aktiviteten af enzymerne? En forståelse af, hvordan protein turnover ændrer sig i muskulaturen med stigende alder, er interessant ikke blot for kødproduktionen men også for den animalske og humane sundhed. Der er foretaget følgende dataindsamling og målinger på grise i alderen 28 til 180 dage: Muskelbiopsiprøver på tidspunktet for grisens stikning: 1. biopsi til måling af calpainsystemet m.m. (mørhedsudvikling), 2. biopsi til RT PCR og 3. biopsi glycogen metabolisme. Der blev målt ph og temperatur ved følgende tider ph1min, ph45min, ph2t og ph24t og temp1min. Der blev indsat temperaturlogger efter skoldning til måling af temperaturprofil. Dagen efter slagtning blev der udtaget prøver til konsistens måling (mørhed), sensorik, dryptab, farve, intramuskulært fedt og NMR. Konsistensmålingerne er allerede gennemført og viser forskelle i mørhed over tid. Derimod mangler en beskrivelse af mørhedsudviklingen ved hjælp af måling af calpainer, proteasomer og cathepsiner. Mål: Beskrivelse af mørhedsudviklingen i kød fra grise med forskellig alder/vægt ved hjælp af måling af calpainer, proteasomer og cathepsiner i biopsimateriale og beskriv disse resultater i forhold til konsistensmålingerne og øvrige allerede målte kød og spisekvalitetsegenskaber. Metode Analyse af proteinekspression og aktivitet af calpainer, proteasomer og cathepsiner i muskelvæv, herunder bl.a. opsætning af aktivitets assay for proteasom. Sted: Det Jordbrugsvidenkabelige Fakultet Forskningscenter Foulum Råvarekvalitet Blichers Allé 20, Postboks 50 8830 Tjele Kontaktperson: Forskningsprofessor Niels Oksbjerg, tlf. nr. 89991557 e mail: Niels.Oksbjerg@agrsci.dk eller Laurits Lydehøj Hansen tlf. nr. 89991255, e mail: LauritsLydehoj.Hansen@agrsci.dk 15
Bioaktive peptider fra mælkeproteiner med sårhelende effekt på celler i mave tarm kanalen. Formål: At identificere peptider fra hydrolyserede mælkeproteiner med sårhelende effekt på celler i mave tarm systemet. Målet er på længere sigt at udvikle et kosttilskud baseret på mælk til patienter med mavesår, ulcerativ colitis og morbus Crohn (Crohn s syge). Baggrund: Sår i mave tarm kanalen ses ofte i forbindelse med ikke kun mavesår med også ved kronisk inflammatorisk tarmbetændelse som ulcerøs colitis og morbus Crohn. Begge typer af kronisk inflammatorisk tarmbetændelse er i kraftig vækst i de vestlige lande, og ikke mindst morbus Crohn rammer et stigende antal unge personer, der på grund af sygdommen kan opleve en væsentlig forringet livskvalitet som følge af sygdommen og dens følgevirkninger. Der er i litteraturen rapporteret om komponenter i både kolostrum (råmælk) og i hydrolysater fra fiskeprotein med sårhelende effekter på celler fra mave tarm kanalen. Indhold: Projektet omfatter fremstilling af forskellige hydrolysater af proteiner fra forskellige typer af mælk. Disse hydrolysater testes for bioaktivitet i sårhelingsassays. De biologiske tests udføres af samarbejdspartnere i en af DJF s andre afdelinger. De fremstillede hydrolysater karakteriseres ved hjælp af proteinkemiske teknikker som 1 og 2 dimensionel gel elektroforese, HPLC mv., og hydrolysater med potentiel bioaktivitet fraktioneres videre med henblik på fremstilling af berigede fraktioner, samt, om muligt, identifikation af de specifikke bioaktive peptider ved brug af HPLC metoder og MALDI TOF massespektrometri. Projektet er en del af et større projekt, der involverer både interne og eksterne samarbejdspartnere, med flader til den medicinske verden og til patientforeningen for Colitis Crohn (CCF). Sted: Institut for Råvarekvalitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet, Forskningscenter Foulum. Henvendelse: Seniorforsker Lotte Bach Larsen, Institut for Råvarekvalitet, tlf. 89 99 11 71, lottebach.larsen@agrsci.dk eller seniorforsker Stig Purup, Institut for Husdyrsundhed, Velfærd og Ernæring, tlf. 89 99 15 56, stig.purup@agrsci.dk. 16
Kvalitetsforringende enzymer og proteolyse i mælk med forskelligt celletal Formål: At identificere kvalitetsforringende enzymer og proteolyseprodukter i mælk med forskelligt celletal. Baggrund: Der findes en række proteolytiske enzymer i mælk, der kan nedbryde mælkens proteiner. Det er en ønsket proces under f.eks. ostemodning, mens det er uønsket i den rå mælk og i ostemælk, da det kan medføre en forringet holdbarhed af mælk, lavere osteudbytte og påvirke produktkvaliteten. Man kender en del af disse kvalitetsforringende enzymer, men ikke alle er identificeret. For en del af disse ved man, at indholdet og aktiviteten af enzymerne stiger i mælken ved stigende celletal, og dermed er associeret med yversundheden. På koniveau kan der mellem forskellige kirtler være stor forskel på både celletallet og sammensætningen af de celler, som celletallet dækker over. Ved at karakterisere hvilke nedbrydningsprodukter, der er dannet i mælken fra forskellige kirtler, kan man pege på hvilke enzymer, der har været ansvarlige, og dermed vurdere sammenhæng mellem celletal, yversundhed, specifikke enzymer og mælkekvalitet. Indhold: Proteolyseprodukter karakteriseres i mælk med forskelligt celletal ved brug af LC MALDI spotting. Ved brug af kapillar HPLC fraktioneres peptider fra mælk og spottes direkte på target til MALDI TOF massespektrometri. Ved MS kan disse peptider identificeres, og ved databasesøgninger også hvorfra de er dannet. Gennem identifikation af spaltningssteder kan der kommes med forslag til hvilke kvalitetsforringende enzymer, der har været på spil. Der kan endvidere anvendes proteomanalyse til karakterisering af mælkens proteinkvalitet ved forskelligt celletal ved analyse af proteinnedbrydningen gennem proteinseparation på todimensionelle geler, udpegning af hot spots og identifikation af proteiner og fragmenter ved MALDI TOF. Resultatet bruges til at pege på betydningen af celletal for mælkens sammensætning og proteinnedbrydning. De kvalitetsforringende enzymer i mælk med forskelligt celletal kan endvidere karakteriseres ved enzymatiske tests, immunoblots, og nye enzymer søges identificeret ved integration af antistof teknikker med MALDI TOF massespektrometri. Sted: Institut for Råvarekvalitet, Det Jordbrugsvidenskebelige Fakultet, Aarhus Universitet, Forskningscenter Foulum. Henvendelse: Seniorforsker Lotte Bach Larsen, Institut for Råvarekvalitet, tlf. 89 99 11 71, lottebach.larsen@agrsci.dk. 17
Klumper i mælk sammensætning og årsager Formål: At belyse sammensætningen af klumper, der er dannes i mastitismælk med henblik på at identificere de mekanismer, der ligger bag, og dermed kunne udvikle sensorer, der kan frasortere denne type af mælk i malkerobotter. Baggrund: I forbindelse med mastitis dannes der ofte klumper og flager i mælken. Dannelsen af disse er et resultat af en ændret mælkesammensætning ved mastitis. Der sker en stigning i antallet af leucocytter, og andelen af valleprotein stiger, herunder også mængden af immunoglobulin. Også forholdet mellem frit og micel bundet kasein forskydes mod en større andel af frit kasein. Ligeledes stiger en række af mælkens enzymer, bl.a. de proteolytiske, og dermed stiger proteolysen af kaseinerne i denne type mælk. Der kan være flere årsager til dannelsen af klumper og flager i mastitismælk. Det kan f.eks. skyldes agglutinering af immunoblobulin, valleprotein og fedtkugler, men også proteolyse af kaseinerne med efterfølgende aggregering er en mulighed. Det er påvist, at der findes para κ kasein i visse typer af mastitismælk: det fragment, der dannes fra κ kasein i forbindelse med ostefremstilling efter tilsætning af chtymosin eller osteløbe. Det er ligeledes vist, at nogle af de enzymer, der stiger i mælk i forbindelse med mastitis, er i stand til naturligt af spalte κ kasein på denne måde. Det er derfor nærliggende at forestille sig, at mælkens enzymapparat kan spille en rolle i dannelsen af disse uønskede klumper og flager, men i hvor høj grad det sker, er ukendt på nuværende tidspunkt.. Mælk, der er visuelt forandret skal frasorteres under malkningen, da det ikke må leveres til mejeriet. Traditionelt har man anvendt den visuelle bedømmelse af formælk, men i forbindelse med indførelsen af malkerobotter (automatisk malkning, AMS) er det blevet tvingende nødvendigt af finde alternativer til den visuelle bedømmelse. Projektet er derfor en del af et større projekt, hvor formålet på længere sigt er at opstille målealgoritmer for forandret mælk, og dermed at kunne fremstille sensorer, der med større nøjagtighed end i dag kan frasortere forandret mælk. Projektet udføres i samarbejde med forskere fra Institut For Husdyrsundhed, Velfærd og Velfærd, herunder forskningsleder Morten Dam Rasmussen, DJF, samt med industrien. Indhold: Den overordnede sammensætning (fedt, protein og laktose) af forskellige typer af klumper bestemmes ved IR. Klumperne isoleres fra mælk fra dyr på forskellige infektionsstadier. Klumperne inddeles efter om de hovedsageligt består af fedt eller protein. Derefter bestemmes deres detailsammensætning ved brug af forskellige metoder, som GC MS og state of the art proteomicsmetoder. Klumpernes sammensætning analyseres ved 2 dimensionel gel elektroforese, samt ved multidimensionel kapillar HPLC af proteiner og peptider. Begge metoder er koblet op på proteindetektion ved brug af massespektrometri. Endvidere skal der anvendes forskellige assays til detektion af proteolyse og proteolytiske enzymer. Det kan også komme på tale at anvende immunologiske metoder til detektion af enzymer. Sted: Institut for Råvarekvalitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet, Forskningscenter Foulum. Henvendelse: Seniorforsker Lotte Bach Larsen, Institut for Råvarekvalitet, tlf. 89 99 11 71, lottebach.larsen@agrsci.dk. 18
Reducering af lipolyse i rå mælk Et af de største kvalitetsproblemer i moderne malkeanlæg er, at de kan være årsag til øget lipolyse i mælk. Lipolysen resulterer i dannelse af frie fedtsyrer. Frie fedtsyrer forårsager uønsket harsk smag i mælk. I fakultetets malkestald er der opsat et pladekøleanlæg, der kan køle mælken straks efter malknin,g og før den løber til mælketanken. Vi ved at køling til 4 5 C signifikant reducerer lipolysen i mælken. Ulempen ved køling er, at det er energikrævende. Det er derfor nødvendigt at vide hvor langt ned, det er nødvendigt at køle mælken for at få en effekt på lipolysen. Ved lidt højere temperaturer vil der kunne opnås store energibesparelser, da der kan udveksles varme med køernes drikkevandsystem. Analysemetoder vil/kunne være FFA bestemmelse ved BDI metoden, lipase aktivitets assay og immunofarvning af lipaseenzymet og fedtkuglestørrelse ved laser light scattering. Dette meget anvendelsesorienterede projekt kan udføres enten som bachelor eller masterprojekt. Der vil være kontakt til malkeudstyrsproducenter. Sted: Institut for Råvarekvalitet, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet, Forskningscenter Foulum. Henvendelse: Forsker Lars Wiking, lars.wiking@agrsci.dk, tel: 89991569 19
Purification and characterisation of low abundance bioactive peptides in milk Milk and especially colostrum have always been said to be a part of a healthy diet of mammals. The colostrum has a major effect on the innate immune system determining your future health as this is the first food you get. A few food derived proteins have been shown to hide bioactive peptides which are released upon cleavage of proteins into peptides. This cleavage of the protein backbone happens in the stomach and in the intestines so the effect of these bioactive peptides must be in the intestines. It is interesting to find and characterise these bioactive peptides as they may be used to create functional food meaning that these natural bioactive peptides are added to existing food to make it healthier. Present examples of functional food in Denmark are: Gaio, Actimel and Becel ProActiv. Aim: To find and characterise milk derived bioactive peptides with importance for the innate immune system. Experimental: Initially the parent protein is purified by affinity chromatography with an appropriate ligand. An example could be that CD14, a very important protein for the immune response to bacteria and virus, is purified because it has affinity for the ligand LPS which origin is gramnegative bacteria. The resulting proteins may be separated by two dimensional capillary HPLC initiated with ion exchange chromatography followed by a simulated stomach/intestine digest of the proteins. The peptides from this digest will be applied to HPLC reverse phase chromatography spotting the separated peptides onto a target for mass spectrometry where the peptides will be identified on basis of their amino acid composition. If time permits, the potential bioactivity of the peptides can be measured using a cell assay where mouse intestinal cells are stimulated with a ligand e.g. LPS and the putative bioactive peptides giving rise to NF kb expression which can be measured by luciferase. For more information about the project please contact: PhD student: Ann Louise W Jørgensen, email: annlouise.jorgensen@agrsci.dk, tel: 89991561 or senior scientist: Jan Stagsted, email: jan.stagsted@agrsci.dk, tel: 89991186 Experiments will be carried out at University of Aarhus, Faculty of Agricultural Sciences, Department of Food Science, Tjele. Picture: Crystal structure of murine CD14 and LPS. Coloured with green is the LPS binding sites. 20
Influence of milk derived peptides on the NF kb expression in cells In the intestines many cell types are present, but the immune function of these has gained limited attention. These cells are constantly subjected to a massive amount of bacteria which they recognise as being beneficial, but when strange bacteria enters the intestine the cells quickly recognise these as strangers, and as the receptors on the surface of the cells initiate pathways to produce cytokines and chemokines dependent on the stranger. Quite a few people die every year because of these strange bacteria or vira entering the body causing e.g. sepsis. Cells from intestines of mice have been isolated and are used as a model to study the responses of different bacterial and viral molecules. The cells are transfected by a luciferase promoter making them able to produce luminescence when NF kb is activated upon stimulation of certain receptors in the cell membrane or intracellular compartments. As the cells are present in the intestines it may be assumed that the surface receptors are in contact with digested proteins from food. Between these peptides there may be some bioactive peptides regulating the receptor signalling. Such bioactive peptides are interesting to identify as these may be targets for making functional food for a healthier life. Aim: To characterise the different pathways leading to NF kb expression upon stimulation with ligands of importance for the innate immune defence. Experimental: Initial experiments will include a setup of the cell assay optimising concentration of ligands and peptides and kinetics as measured by change in luciferase activity. The activity of the cells upon stimulation is regulated by kinases which are phosphorylated. The idea is to follow the phosphorylation by mass spectrometry which straight away can indicate which pathway is used upon specific stimulation. If time permits, bioactive peptides with interesting NF kb expression can be monitored using fluorescent stains and microscopy to detect if the peptides act on the surface of the cells or inside the cells. For more information about the project please contact: PhD student: Ann Louise W Jørgensen, email: annlouise.jorgensen@agrsci.dk, tel: 89991561 or senior scientist: Jan Stagsted, email: jan.stagsted@agrsci.dk, tel: 89991186 Experiments will be carried out at University of Aarhus, Faculty of Agricultural Sciences, Department of Food Science, Tjele. 21
Characterisation of peptides in a simulated gastrointestinal digest of food Indigested food is degraded by proteases mainly in the stomach and intestines. In the stomach the ph is low resulting in a partial digest of the food derived proteins by the endopeptidase pepsin. The ph is increased to physiological ph when food enters the intestines activating other proteases. Some of the generated peptides are bioactive making them advantageous for the human health as they have a beneficial impact on the biomolecules on the intestines. Some bioactive peptides may be generated under very specific conditions resulting in limited release in humans, which can be beneficial or crucial to the health. To gain knowledge of the generated peptides at specific conditions it is necessary to evaluate the outcome of the digest which can be done by mass spectrometry. Aim: To identify potential bioactive peptides from a simulated gastrointestinal digest by mass spectrometry Experimental: Skimmed milk is partly digested by pepsin followed by a complete digest by Corolase which is an extract from pancreas. The peptides are captured by reverse dialysis using different cut offs. The peptides are characterised by adding a fluorophore to the n terminal as well as by nano capillary HPLC. The peptides are identified by mass spectrometry using different purification strategies and matrices for detection. Mass spectrum of a digest of bovine serum albumin For more information about the project please contact: PhD student: Ann Louise W Jørgensen, email: annlouise.jorgensen@agrsci.dk, tel: 89991561 or senior scientist: Jan Stagsted, email: jan.stagsted@agrsci.dk, tel: 89991186 Experiments will be carried out at University of Aarhus, Faculty of Agricultural Sciences, Department of Food Science, Tjele. 22
Generation of in house searchable database for milk derived proteins and peptides Generation of a simple, user edible and experiment based database containing information about milk derived proteins and peptides will be of great impact simplifying future work when doing experiments with protein or peptide interactions, proteomics, mass spectrometry, oxidation, crosslinking etc. Aim: To generate an easy to use database for milk derived proteins and peptides. Experimental: The project could include experimental work with protein or peptide interactions and mass spectrometry, but will mainly be to set up the database based on existing data. For more information about the project please contact: PhD student: Ann Louise W Jørgensen, email: annlouise.jorgensen@agrsci.dk, tel: 89991561 or senior scientist: Jan Stagsted, email: jan.stagsted@agrsci.dk, tel: 89991186 Experiments will be carried out at University of Aarhus, Faculty of Agricultural Sciences, Department of Food Science, Tjele. 23
Kinetics and mechanisms of selenomethionine oxidation in different milk related systems. Selenium is an essential trace element for humans and animals since it is necessary for a narrow range of critical enzymes and thus plays a significant role in the immune system. Se is specifically incorporated as selenocysteine into glutathione peroxidase (a major antioxidant enzyme of cells) and other Se enzymes. Selenomethionine (Se Met), in contrast, is incorporated non specifically into proteins in place of its sulphur analogue, methionine. The altered redox properties of selenomethionine compared to methionine makes it especially prone to oxidation and this may affect the stability of milk proteins and lipids in either an anti or prooxidative way. We know that selenomethionine is a better quencher of peroxynitrite and other radicals than methionine, and that its oxidation product is recycled by the cysteine containing tripeptide gluthathione. But effects of selenomethionine in milk related systems are still un clear: Is the oxidation of other protein compounds and lipids spared due to preferential oxidation of selenomethionine, or do we have an increased oxidation due to formation of other reactive products? Description of these issues requires a thorough understanding of the chemistry of selenomethionine oxidation, and we propose that this aspect is addressed in simple model systems as well as in milk. Therefore the aim of this project is to investigate the oxidation of selenomethionine compared to methionine in different milk related systems and milk. The research should include development of an analysis for determination of selenomethionine oxidation products using GC MS or MALDI TOF MS. This analysis should be used in a description of the kinetics of selenomethionine oxidation under hydroperoxide, metal or UV light induced oxidation. Furthermore investigation of interactions between other low molecular weight compounds present in milk and selenomethionine could be an issue. For further information about the project, please contact: PhD student Morten Rahr Clausen, 8999 1852, MortenR.Clausen@agrsci.dk or Senior Scientist Jan Stagsted, 8999 1186, Jan.Stagsted@agrsci.dk. The experimental work will take place at the Department of Food Science, Faculty of Agricultural Sciences, University of Aarhus. 24
Elucidation of factors affecting lactoperoxidase induced dityrosine formation in cows milk Lactoperoxidase (LPO) is an enzyme present in different body fluids (milk, saliva, tears), and the lactoperoxidase induced oxidation of halides using H 2 O 2 as electron acceptor is believed to be a major defence mechanism against pathogens of the organism. However the LPO/H 2 O 2 system also oxidizes other substrates, such as cysteine and tyrosine residues in proteins. Tyrosine oxidation results in tyrosyl radical formation, and subsequently the reaction between two tyrosyl radicals results in the formation of dityrosine. Thus intra and intermolecular cross binding between tyrosine containing proteins is induced by the LPO/H 2 O 2. 10 Gauss The lactoperoxidase activity of milk from individual cows, measured as their ability to oxidise the synthetic substrate ABTS is highly variable. But as we know that LPO and H 2 O 2 are required for dityrosine formation a simple linear correlation between the LPO activity, determined in the ABTS assay (a synthetic chromogenic substrate), and dityrosine formation is expected. However, we observe that milk from cows with comparable LPO activity may vary 10 fold in their ability to form dityrosine. Therefore the aim of the project is to elucidate factors affecting dityrosine formation in cows milk. The research may include purification of lactoperoxidase from different cows and kinetic characterization of their ability to oxidise different substrates. Swapping experiments and fractionation of milk components, characterisation of LPO and its substrates using MALDI TOF MS and ESR spectroscopy and investigation of the effects of antioxidant low molecular weight compounds present in milk. Formation of the resonance stabilised tyrosyl radical and subsequent formation of dityrosine cross links. Detection of tyrosyl radicals using ESR spectroscopy Structure of Lactoperoxidase For further information about the project, please contact: PhD student Morten Rahr Clausen, 8999 1852, MortenR.Clausen@agrsci.dk or Senior Scientist Jan Stagsted, 8999 1186, Jan.Stagsted@agrsci.dk. The experimental work will take place at the Department of Food Science, Faculty of Agricultural Sciences, University of Aarhus. 25
Development of a quartz crystal microbalance biosensor for detection of bioactive components in foods Project proposal: The concept of functional foods targets the health of humans beyond nutrition. The interaction and importance of specific molecular interactions between food derived components and our primary epithelial barrier of the gastrointestinal (GI) tract is, however, incompletely understood. The GI has been comprehensively characterized for transport of a variety of food derived molecules of importance for nutrition. Thus, a number of specific proteins have been described that function in the transformation of ingested proteins into constituents which can be taken up by the enterocyte lining of the GI. This progress has largely been facilitated by the study of well defined brush border membrane vesicles (BBMVs) prepared by homogenization of mucosal scrapings from the GI. Thus, BBMVs will be our primary target as they represent the apical membrane surface of the lumen and are in direct contact with the ingested food. The quartz crystal microbalance with dissipation (QCM D) is based on the piezoelectric properties of quartz. Applying an AC voltage over gold electrodes deposited on a quartz crystal induces oscillations at a fundamental resonance frequency or an overtone thereof and subsequent adsorption of material onto the surface of the crystal leads to a decrease in resonance frequency proportional to the adsorbed mass. We suggest preparing brush border membrane vesicles, solubilizing the membrane proteins responsible for transport and transformation of food components by the use of detergents and reconstituting these into phospholipid vesicles. Under certain conditions, phospholipid vesicles collapse into supported lipid bilayers on silicacoated quartz crystals. Thus, it is hypothesized that a biosensor displaying similar characteristics as the small intestine can be prepared on the surface of the quartz crystal. When food components are injected onto the sensor surface, interacting components can be detected as a decrease in the resonant frequency due to the increased mass. We use colostrum ( mothers first milk ) as a model food for the development of this biosensor because this food source is rich in bioactive components. Experimental design: Brush border membrane vesicles are prepared and characterized by dynamic light scattering, SDS PAGE and activity assays. Optimal conditions for the solubilization of brush border membrane proteins by various detergents are determined and solubilized proteins are reconstituted into phospholipid vesicles, either as a crude mixture or as single components purified by affinity chromatography. These proteoliposomes are then collapsed into supported lipid bilayers on silica coated quartz crystals employed in the quartz crystal microbalance technique to create a biosensor capable of detecting one or more components in foods that interact with the reconstituted brush border membrane protein(s). Protein candidates interacting with the biosensor are identified by mass spectrometry methods including peptide mass fingerprinting and/or peptide sequencing by MS/MS. For more information, please contact: PhD student: Søren Bang Nielsen, email: soren.bangnielsen@agrsci.dk, tel: 8999 1218 or senior scientist: Jan Stagsted, email: jan.stagsted@agrsci.dk, tel: 8999 1186 Experiments will be carried out at University of Aarhus, Faculty of Agricultural Sciences, Department of Food Science, 8830 Tjele. 26