Ekstraktion af proteiner fra kød, æg og mælkeprodukter

Ekstraktion af proteiner fra kød, æg og mælkeprodukter Udarbejdet af Lektor Lars Haastrup Pedersen, forskningsadjunkt Claus Gyrup Nielsen, Phd. Anders Bundgaard Sørensen, Phd. Malene Bredal Brohus samt Phd.-studerende Ea Høegh og MSc. Anne Mette Elimar. 1. Formål Page1

Formålet med denne øvelse er at ekstrahere proteiner fra kød, æg og mælkeprodukter, separere proteinerne ved hjælp af den bioteknologiske metode SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) samt at stifte bekendtskab med proteinernes egenskaber og biologiske funktion. 2. Introduktion Ekstraktion af protein foregår ved at tilsætte 20 mm acetat buffer med ph 5.5, hvormed nogle proteiner kommer i opløsning. Proteiner er opbygget af aminosyrer og har i sit naturlige miljø (fx en menneskecelle ved fysiologisk ph) en særlig tredimensionel struktur (se figur 1). Figur 1: Proteiners 3-dimensionelle struktur De ekstraherede proteiner analyseres ved SDS-PAGE, der er en gel-elektroforese baseret metode, som anvendes til at adskille proteiner efter deres størrelse. Separationen foregår i et elektrisk felt over en gel af polyacrylamid. Inden elektroforesen, denatureres (udfoldes) proteinerne ved at reducere eventuelle disulfidbroer og ved at tilsætte det sæbelignende stof natriumdodecylsulfat (som forkortes SDS fordi natrium = sodium på engelsk). Ved at tilsætte disse stoffer og udsætte proteinerne for varme vil de udfoldes, og det negativt ladede SDS bindes regelmæssigt langs med det udfoldede protein og giver derfor alle proteiner Page2

samme ladning pr masseenhed, samt medvirker til at holde det lineært. Den negative ladning af SDS vil overstige proteinets egen samlede ladning og dermed muliggøre at alle proteiner bliver adskilt efter størrelse og ikke deres oprindelige ladning. Oftest anvendes DTT (Dithiothreitol) som reduktionsmiddel og dermed forhindres dannelsen af disulfid bindinger mellem to cysteiner, som er svovlholdige aminosyrer. Peptidkæderne kan derefter adskilles efter størrelse og sammenlignes med en størrelsesmarkør (se figur 2). Figur 2: Princippet bag SDS-PAGE 3. Proteinekstraktion fra kød Materialer: Kød Skalpel/køkkenkniv Buffer A: 20 mm acetatbuffer i 20 mm NaCl, ph 5.5 50 ml Greinerrør 20 ml sprøjte 2-3 0,4 µm engangsfiltre Pipette og spidser Fremgangsmåde a) Afvej 10 g kød og findel kødet med en skalpel/almindelig køkkenkniv. b) Overfør kødet til et rent 50 ml Greinerrør. Page3

c) Tilsæt 30 ml buffer A, sæt låg på røret og vend det forsigtigt nogle gange. N.B. Her skulle væsken gerne blive rød (i hvert fald hvis oksekød anvendes) d) Lad opløsningen stå i 5-15 minutter. Den kan evt. vendes / omrøres fra tid til anden. Det kan være nødvendigt at filtrere ekstraktet efter følgende procedure: e) Sug ca. 20 ml af kød-buffer-opløsningen op i en 20 ml engangs-sprøjte. Undgå at suge kødstykker med op. f) Et gult 0,4 µm engangs-filter placeres på sprøjtens spids (skrues fast) og væsken presses igennem filtret og ned i et rent 50 ml Greiner rør. 4. Proteinekstraktion fra mælk og æg Materialer: Mælk Æg Buffer A: 20 mm acetatbuffer i 20 mm NaCl, ph 5.5 15 ml Greinerrør Pipette og spidser Eppendorfrør Fremgangsmåde mælk a) Afpippeter 1 ml mælk i to eppendorfrør. b) Centrifuger 10 minutter ved højeste rpm-indstilling. c) Mælkefedtet ligger nu foroven fjern dette forsigtigt og udtag 400 µl af den vandige opløsning d) Prøven er nu klar til punkt 5 Fremgangsmåde æg a) Slå ægget ud og adskil hvide og blomme i hver deres vejebakke b) Tag 1 ml af hviden og fortynd med 9 ml buffer A og bland godt c) Udtag 1 ml i to eppendorfrør og centrifugér 10 minutter ved højeste rpm-indstilling d) Udtag 400 µl som skal bruges under punkt 5 5. Analyse af proteinoprensningen I skal nu analysere prøverne fra æg, mælk og kødekstrakt via SDS-PAGE. Materialer 4-20% acrylamid geler fra GenScript Sample buffer Running buffer (MOPS) Gel elektroforesesystem: Bio-Rad Mini protean tetra kar med 2 holdere, låg, ledninger, plastik buffer dam og strømforsyning CBB stain og destain Page4

Rystebord Pippetter og spidser a) Tilsæt 20 µl Sample buffer (SB) til 20 µl af hver af prøverne (brug pipetten husk ren pipettespids til hver pipettering). b) Prik hul i hvert låg eller sæt noget tungt ovenpå rørene, således at lågene ikke popper under opvarmning. c) Alle prøver undtagen protein-vægt-markør (Thermo Scientific #26610, figur 3) opvarmes i 5-10 min ved 95 C (i vandbad eller varmeblok). d) Herefter sættes prøverne på is i 5 minutter, hvorefter de centrifugeres kort i en bordcentrifuge på max speed (ex. 14,500 rpm i 20 sekunder). N.B. Imens prøverne varmes og nedkøles gøres SDS-PAGE klar e) Tag et par handsker på og pak GenScript gelen ud (måske hedder gelen noget andet alt efter hvad der er på lager). N.B.Det er vigtigt at fjerne det grønne stykke tape i bunden og den grønne plastikkam i toppen af gelen. f) Gelen sættes i gelelektroforesekarret, som vist på Figur 3, så den korte side af gelen vender ind mod midten af indsatsen og sikre at gelerne sidder stramt mod bunden mens siderne klikkes op: N.B. Følg evt. linket http://www.youtube.com/watch?v=iafuee4db2u&feature=related hvor det demonstreres, hvordan karret sættes rigtigt i (dette kar er muligvis ikke helt identisk med det i får udleveret). A B C D Figur 3 A indsæt gelerne ved at placere den korte side af gelen mod midten af beholderen. B Når gelerne er på plads skubbes de grønne klemmer på plads. C Gelbeholderen placeres i karret ved at beholderen med elektroderne står udenfor plastikforhøjningerne på karret. D Markør der anvendes som værktøj til at vurdere ukendte proteiners størrelse. Page5

g) Karret med gelerne fyldes først helt op med SDS-PAGE running-buffer. Tjek om der løber running buffer ud af beholderen før der fyldes SDS-PAGE running-buffer i resten af karet. Holder midten af karret ikke tæt, skal hele indsatsen skilles ad, sættes ordentlig sammen og karret tørres af inden man forsøger igen! h) 5 µl af protein-vægt-markøren (Thermo Scientific #26610) loades (påsættes) i den første brønd med pipetten og 10 µl af hver af prøverne tilføres hver af de resterende brønde (husk ren pipettespids ved hver enkelt pipettering). N.B. Husk at notere rækkefølgen af de enkelte prøver. Anvend vedlagte skema (Tabel 1) til at holde styr på rækkefølgen. Låget sættes på karret (dette kan kun vende på én måde) og strømstikkene sættes i strømforsyningen (rødt stik til rød indgang sort stik til sort indgang). Page6

Tabel 1: Skema til notering af fraktioner loaded på gelen. Husk at skrive navn på. Eksempelvis: skummetmælk Gel 1 Brønd Prøve Mix Load 1 Markør Er blandet 5 µl 2 20 µl prøve+20 µl SB 10 µl 3 20 µl prøve+20 µl SB 10 µl 4 20 µl prøve+20 µl SB 10 µl 5 20 µl prøve+20 µl SB 10 µl 6 20 µl prøve+20 µl SB 10 µl 7 20 µl prøve+20 µl SB 10 µl 8 Markør Er blandet 5 µl 9 Tom brønd - - 10 Tom brønd - - i) Strømforsyningen tændes (stik på højre side) hvorved der sættes en strøm over gelen med konstant spændingsforskel på 140 V i ca. 50 minutter (indtil den blå linje har arbejdet sig ned til bunden af gelen - lad ikke farven løbe helt ud af gelen!). (Strømforsyningen kan ses på Figur 1). N.B. For at adskille proteinerne med en konstant spændingsforskel skal prikken lyse udfor V (Voltage) og ikke A eller T. Når strømmen er startet skal det gerne begynde at boble med ilt inde i karret (hvis dette ikke er tilfældet, sidder gelen enten ikke rigtigt, eller også er der for lidt buffer i karret). Figur 1: til venstre ses strømforsyningen til elektroforesekarret og til venstre ses displayet. j) Når den blå linje er i bunden af gelen (efter ca. 30 minutter) skilles elektroforesecellen ad og gelen udtages. Gelen sidder imellem to stykker plastik. Disse skilles ad som vist på Figur 2 med et værktøj som indsættes mellem plastikpladerne og vrikkes til det siger klik. Pas på ikke at ødelægge gelen i denne proces. Page7

Figur 2: Værktøjet indsættes mellem de to plastikplader og vrikkes op og ned indtil det siger klik, sørg for at pladerne er ordentlig skilt ved flere punkter (fx i begge sider og i bunden) før gelen overføres til farvning. k) Gelen overføres til en bakke hvori der tilsættes blå SDS-PAGE farve (Coomassie Brilliant Blue (CBB) stain) til gelen er dækket. Låget sættes løst på bakken. N.B. Skriv tydeligt gruppe nr. på et stykke tape og sæt dette fast på låget til bakken med gelen i. l) Blandingen varmes i mikrobølgeovn i 40 sekunder og derefter køles gelen i 10 minutter ved stuetemperatur (gerne på et rystebord, hvis et sådant er tilgængeligt). m) Den blå væske hældes fra gelen (tilbage i flasken) og destain tilsættes så det dækker gelen. n) Blandingen opvarmes igen i 40 sekunder i mikrobølgeovnen. o) Et par foldede papirservietter lægges ned i bakken til gelen for at suge farven (der skal stadig være væske i beholderen). p) Lad gelen affarve (destaine) i 10 min, hvorefter papirservietterne skiftes. Allerede her burde det være muligt at se nogle blå protein bånd på gelen (disse bånd ses lettere ved at løfte bakken op fra bordet). q) Lad gelen affarve fuldstændigt, hvorefter proteinseparationen kan visualiseres. r) Gelen kan med fordel overføres til en plastiklomme og scannes med en almindelig scanner. Page8