Cellemetode til toksikologisk screening af rene stoffer og støv

BIOTEKNOLOGI Cellemetode til toksikologisk screening af rene stoffer og støv På indeklimaområdet mangler der gode modeller til måling af godt og dårligt indeklima. Her præsenteres en epitelcellemodel, der har givet lovende resultater mhp. at forudsige indeklimagener ud fra det inflammatoriske potentiale af støv Af Leila Allermann og Otto Melchior Poulsen, Indeklimaafdelingen, Arbejdsmiljøinstituttet Betændelsesreaktionen, også kaldet inflammation, er et grundlæggende karaktertræk ved luftvejssygdomme som f.eks. astma [1]. Disse sygdomme er ofte knyttet til en kompleks udsættelse for partikler, organisk støv og/eller biologisk aktive komponenter fra mikroorganismer [2]. Det kan derfor i praksis være svært at udrede årsagerne til sygdommene. Også bygningsrelaterede symptomer (BRS) i indeklimaet, som f.eks. uspecifikke klager over irritation af slimhinder i øjne, næse og hals, hovedpine, svimmelhed, unormal træthed, koncentrationsbesvær, hoste og tør hud, kan omfatte en underliggende betændelsesreaktion. Bygningsrelaterede symptomer menes at have en multifaktoriel årsagssammenhæng, hvor både kemiske, biologiske, fysiske og psykosociale faktorer kan være involveret. Mange forskergrupper tager i dag afsæt i inflammation som et centralt mål, når kemiske og mikrobiologiske påvirkninger skal farevurderes (tabel 1). berettigelse, dels ved test af store serier af prøver, dels ved test af stoffer med ukendt, men potentiel stor skadevirkning. Luftvejenes epitelceller og makrofager er en del af kroppens første forsvarssystem mod fremmedstoffer og indtrængende organismer. Hvis f.eks. endotoxin - en komponent i cellevæggen af Gram-negative bakterier - indåndes vil epitelceller og makrofager udskille en kaskade af signalstoffer, der igangsætter den inflammatoriske proces. På Arbejdsmiljøinstituttet er der derfor udviklet en cellemodel, hvor den humane lungeepitelcellelinje A549 kan bruges i en hurtig og billig screening af et stort antal prøver - enten rene stoffer eller komplekse partikler. Modellen afspejler - meget simplificeret - kroppens primære inflammatoriske forsvar mod et indtrængende fremmedstof. Ved at stimulere A549-celler med prøver, der ønskes undersøgt, og måle udskillelsen af signalstoffet interleukin IL-8, kan vi opnå et mål for prøvens evne til at starte en betændelsesreaktion. Cellemodeller Simple at udføre Billig og hurtig Biologisk variation kan negligeres ved brug af rene cellelinier Ingen etiske begrænsninger Forsøgsdyrsmodeller Omfatter hele kroppens immunsystem Biologisk variation er lille ved brug af indavlede dyr Relativt simpelt at fortolke resultater Human eksponeringsforsøg Omfatter hele menneskets immunsystem Relativt simpelt at fortolke resultater Modellen afspejler ikke alle relevante processer i kroppens immunsystem. Det kan derfor være svært at fortolke resultater Teknisk vanskelige at udføre Kostbare og langsomme Ekstrapolation fra dyr til mennesker kan være usikker Etiske begrænsninger Teknisk vanskeligt at udføre Kostbare Stor biologisk variation kan vanskeliggøre fortolkning af resultater Store etiske begrænsninger Tabel 1. Cellemodeller, forsøgsdyrsmodeller og humane eksponeringsforsøg til farevurdering af rene kemiske stoffer og komplekse partikulære prøver. Tabel 1 summerer fordele og ulemper ved de tre principielt forskellige typer af modeller, der kan bruges i toksikologiske test af, om stoffer eller blandinger af stoffer kan være årsag til inflammation: 1. Cellemodeller 2. Forsøgsdyrsmodeller 3. Humane eksponeringsforsøg. Resultater fra forsøgsdyrsmodeller eller humane eksponeringsforsøg er ofte lettere at fortolke mht. farevurdering end resultater fra cellemodeller. Imidlertid er forsøgsdyrsmodeller og humane eksponeringsforsøg kostbare at udføre, og disse modeller har etiske begrænsninger ift. hvilke stoffer, der kan testes, og hvordan. Cellemodellerne har derfor en særlig A549-cellemetoden A549 er en udødelig lungeepitelcellelinje, der i 1972 blev isoleret fra en 58-årig mand med lungekræft. Cellelinjen har bevaret de fleste fundamentale karakteristika ved lungeepitelceller, herunder evnen til at producere og udskille signalstofferne IL-6 og IL-8, der sammen med IL-1 og Tumor Necrosis Factor (TNF) fra makrofager hører til gruppen af proinflammatoriske signalstoffer (cytokiner). Det akutte inflammatoriske respons, som initieres af de proinflammatoriske cytokiner, efterfølges generelt af et systemisk respons - et akut-fase-respons, som bl.a. er karakteriseret ved feber og en hurtig ændring i niveauet af proteiner i blodets plasma. dansk kemi, 84, nr. 5, 2003 42

α IL-8 er et signalstof, der tiltrækker og aktiverer neutrofile celler. Det kan sammen med IL-1, IL-6 og TNF spores, før en egentlig betændelsesreaktion kan ses. Til analyse af teststoffernes inflammatoriske potentiale blev der med forskellige biologiske og kemiske stoffer udviklet og karakteriseret et bioassay på den humane lungeepitelcellelinje A549. Cellerne inkuberes med teststoffet (eks. endotoxin, kendte allergener, irritanter eller støv) ved 36,6 C og 5% CO 2 i 24 timer. Teststoffet tilsættes cellerne i fem doser. Samtidig testes en negativ og en positiv kontrol hhv. rent celledyrkningsmedie og TNF-α (TNF-α ). Cellernes udskillelse af IL-8 måles med ELISA. Teststoffets potens (PF), altså dets evne til at få cellerne til at udskille IL-8, udtrykkes som den initiale hældning af dosis-responskurverne, dvs. det frigivne IL-8 versus den tilsatte koncentration af teststoffet (figur 1). For at reducere metodens dag til dag-variation korrigeres PF ift. værdien af den positive kontrol. Dosis-responskurverne har typisk et klokkeformet forløb. Det kan skyldes, at stoffernes celleskadende effekter ved større doser får betydning for IL-8-udskillelsen, så den falder. Figur 1. Typisk dosisresponskurve for A549- lungeepitelceller stimuleret med et teststof. Potensen af teststoffet udregnes herefter som PFcorr = α /( X/T), hvor α er den initiale lineære hældning af dosis-responskurven, X er middelværdien af den positive kontrol målt samme dag som teststoffet, og T er middelværdien af flere målinger af den positive kontrol målt på forskellige dage. Anvendelse af cellemetoden Rene kemiske stoffer: Endotoxiner (LPS, lipopolysaccharider) fra forskellige Gramnegative bakterier blev testet på cellemodellen (figur 2). Figur 2. Dosis-responskurver fra A549 lungeepitelceller stimuleret med LPS fra fire forskellige Gram-negative bakterier og en detoksificeret LPS fra E. coli, hvor Lipid A-delen, som er ansvarlig for LPS toksiske egenskaber, er fjernet. Hvert punkt på grafen er middelværdien af en trippelbestemmelse vist sammen med standardafvigelsen. Ved beregning af PF fra de fire bakterier gav LPS fra K. pneumoniae den højeste potens af de testede LPS er (figur 3) [3]. Derefter kom LPS fra P. aeruginosa, E. coli og S. enteritidis. Detoksificeret LPS gav ingen respons i A549- cellelinjen. Det viser, at selv små forskelle i LPS, som Bredt måleområde måleområde Høj opløsning opløsning BIOTEKNOLOGI Med et Avantes fiberoptisk spektrometer system kan du løse et væld af måleopgaver som rækker længere end en typisk spektrometer. Hjertet i løsningen er et mini spektrometer, der kombineret med forskellige fiberprober, prøveholder og lyskilder kan løse et utal af måleopgaver som farvemålinger, traditionel spektroskopi, flowmåling, inspektion af materialer og væsker mm. UV-NIR, 200-1100 nm eller IR, 900-2200 nm. Op til 1Å (0,1nm) Utallige anvendelser Utallige anvendelser Refleksion/farvemåling Absorption/transmission/koncentrations bestemmelse Flouracens Raman On-line/In-line proceskontrol Billige udbygningsmuligheder Avantes vil altid være en rentabel løsning Rekvirer et fuldt katalog: BBT Benny Larsen ApS Kongevejen 67 2840 Holte Tlf: 45412040 Fax 45412070 Email: sales@bbt-bl.com www.bbt-bl.com 43 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003

BIOTEKNOLOGI stammer fra forskellige bakteriestammer, kan give udslag i metoden. Figur 3. Potensen af forskellige rene kemiske stoffer. LPS fra K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli og S. enteritidis. Kontaktallergener som nikkelsulfat, methylmethacrylat og formaldehyd. Irritanter som sæbestofferne Genapol X-80, SDS, kokosolie og SDBS. Svampe skrabet af gulvpap. Lungecellerne reagerede også på forskellige rene kemiske stoffer med allergene og irritative effekter [3]. Nikkelsulfat, methylmethacrylat og formaldehyd er alle kendte kontaktallergener. Formaldehyd gav den højeste PF (figur 3), men også mange døde celler ved lave koncentrationer. Nikkelsulfat gav endvidere tydelige celleforandringer (figur 4). Der blev ikke fundet en klar korrelation mellem stoffernes allergiske potentiale og det inflammatoriske potentiale. Af irritative stoffer blev fire overfladeaktive stoffer (sæbestoffer) testet i modellen [3]. Den nonioniske detergent Genapol X-80 gav den højeste potens i modellen (figur 3) efterfulgt af natriumdodecylsulfat (SDS), kokosolie og dodecylbenzensulfonsyre (SDBS). Selv meget lave koncentrationer af sæbestofferne havde celleskadende effekter, som gav sig udslag i døde celler. Figur 4. A) Normale A549-lungeepitelceller forstørret 400 gange. Pilen peger på en celle, som er ved at dele sig til to. B) A549-celler efter 24 timers stimulering med 0.1% nikkelsulfat, forstørret 400 gange. Pilene peger på pseudopodia som er det sidste cellen trækker til sig, når den runder pga. toksisk effekt af stoffet. Mikroorganismer Ved test af forskellige partikler og fragmenter fra forskellige svampe afskrabet fra gulvpap gav Trichoderma den højeste PF (figur 3). Derefter kom Aspergillus versicolor og Stachybotrys chartarum, mens Chaetomium gav den laveste PF. Der er altså forskel på de forskellige svampearters potens, hvilket også er vist på makrofag cellelinjer [4]. Her har svampesporer fra Streptomyces californicus et højere inflammatorisk potentiale end sporer fra andre svampearter. Komplekse støvprøver Ved test af mere komplekse prøver som støv fra affaldssorteringsanlæg og fra skoler blev lungecellemodellen brugt til at differentiere mellem forskellige anlæg og mellem skoler med og uden indeklimaproblemer. Støv opsamlet fra gulvet i 19 affaldssorteringsanlæg gav i gennemsnit en PF=2 ng IL-8/mg støv (0,3-14). Anlæg, som håndterede blandet affald, havde støv med signifikant højere PF-værdier end støv fra anlæg som håndterede renere affaldstyper som papir og flasker [5]. Der var ikke nogen sammenhæng mellem PF og indholdet af endotoxin, men der blev fundet en indikation af, at bakterier og svampe spiller en rolle. Støv fra indeklimaet blev opsamlet fra 20 skoler i København [3]. PF af støv fra gulve var 2,8 ng IL-8/mg støv (0,1-11,8), og fra vandrette højereliggende overflader var PF=11 ng IL-8/mg støv (1,1-28,6). PF for indeklimastøv er altså på højde med PF for støv fra affaldssorteringsanlæg, hvor man ved, at der kan være mavetarmproblemer og luftvejssymptomer, som hovedsagelig skyldes udsættelse for mikroorganismer. I skolerne blev der fundet en positiv korrelation mellem PF af støv fra gulve og PF af støv fra højereliggende overflader, hvilket tyder på, at prøverne afspejler hinanden (figur 5). PF for gulvstøvprøverne fra skoler med få indeklimagener var signifikant lavere end PF for gulvstøv fra skoler med mange indeklimagener (Mann-Whitney-test p<0,0001). Figur 5. Potensen af støv fra gulve og højereliggende vandrette overflader vist for skoler med få og mange indeklimasymptomer. Potensen af støvet fra skolerne korrelerede med indholdet af organisk stof, og der fandtes en svag korrelation mellem PF og koncentrationen af endotoxin i støvet. Da mængden af endotoxin i støvprøverne lå under cellemetodens detektionsgrænse, kan det betyde, at endotoxin er en markør for andre biologiske eksponeringer. Korrelationerne af støvets PF, indholdet af levende bakterier i gulvstøvet, PF og indholdet af mide-, katte- og hundeallergen var generelt svage, hvilket tyder på, at ingen af de testede parametre er dominerende faktorer i støvet. Potensen af støvet målt i celleassayet kan derfor betragtes som multifaktorielt [3]. Skolebygninger med flade tage, havde signifikant højere PF end bygninger med tage, der havde hældning. Mindre volumen pr. person gav et højere PF fra støvet. Der blev fundet positive associationer mellem PF for gulvstøv og symptomer som øjenkløe, stoppet næse, træthed, et indeks for mindst to tilstedeværende symptomer ud af fem fra slimhinderne og huden og et indeks for mindst et symptom fra centralnervesystemet (p<0,05). Prikkende følelse i huden og hovedpine var næsten signifikante (p<0,1) [3]. Diskussion A549-cellemodellen kan klart differentiere mellem skoler med godt og dårligt indeklima. Endvidere kan den differentiere mellem anlæg, der håndterer affald med stort indhold af organisk materiale fra planter, dyr og mikroorganismer og anlæg, der håndterer renere materialer som flasker og papir. Bioassayet kan derfor bruges som screeningsredskab i evalueringen af, om faktorer i støvet kan give gener for slimhinder i øjne, næse og hals og fra luftvejene. Modellen med A549-celler kan bruges til en toksikologisk vurdering af forskellige stoffers evne til at fremkalde et dansk kemi, 84, nr. 5, 2003 44

BIOTEKNOLOGI inflammatorisk respons via måling af signalstoffet IL-8. Cellemodeller tager ikke i så høj grad som dyremodeller højde for det komplekse system af organer og væv i mennesker og dyr, men afspejler nogle af de underliggende processer i betændelsesreaktionen. Andre forskergrupper bruger andre celletyper og andre markører for betændelse. Nogle anvender f.eks. makrofager, der er en meget central celletype i immunresponset [4]. Epitelcellen, der bruges i denne model, er den første celletype, som får kontakt med de fremmedstoffer, vi udsættes for i vores hverdag. Epitelcellen er derfor også med til at stimulere f.eks. makrofagerne, hvorefter en kaskade af signalstoffer udskilles, og betændelsesreaktionen sættes i gang. Fugt har vist sig at være en god prædiktor for indeklimasymptomer [6]. Denne epitelcellemodel er derfor også et lovende bud på, hvordan man kan forudsige indeklimagener ud fra støvs inflammatoriske potentiale. E-mail-adresser: Leila Allermann: LAM@ami.dk Otto Melchior Poulsen: OMP@ami.dk Referencer 1. Horwitz RJ, Busse WW. 1995. Inflammation and Asthma. Clinics in Chest Medicine,16, 583-602. 2. Rylander R. 1986. Lung Diseases Caused by Organic Dusts in the Farm Environment. Am J Ind Med, 10, 221-227. 3. Allermann, L. 2001. Development of in vitro models for hazard evaluation of dust from the indoor environment. Correlation to organic parameters and building related symptoms. 1-126. Copenhagen, National Institute of Occupational Health, Lersoe Parkalle 105, DK- 2100 Copenhagen Ø. (Ph.D-afhandling). 4. Murtoniemi T, Nevalainen A, Suutari M, Toivola M, Komulainen H, Hirvonen MR. 2001. Induction of cytotoxicity and production of inflammatory mediators in raw264.7 macrophages by spores grown on six different plasterboards. Inhal Toxicol, 13, 233-247. 5. Allermann L, Poulsen OM. 2000. Inflammatory potential of dust samples from waste handling facilities measured as IL-8 secretion from lung epithelial cells in vitro. Ann Occup Hyg, 44, 259-269. 6. Bornehag, C. G. and Sundell, J. 2002. Dampness in buildings an a risk factor for heslth effests. European multidisiplinary review of the entire litterature (EUROEXPO). Levin, H. VI, 13-18. Santa Cruz, CA, Indoor Air 2002. 9th International Conference on indoor air quality and climate. 30-6-0002 (Konference Proceeding). KORT NYT Kvinder, kom i gang! nye kvindelige iværksættere springer ud Kvinder, kom i gang! har som formål at stimulere akademikerkvinder til at starte egen virksomhed. Projektet foregår i et samarbejde mellem Den Europæiske Socialfond og Competencehouse A/S. Den 19. januar 2003 mødte 250 entreprenante kvindelige akademikere fra Københavnsområdet op til en forrygende dag i Symbion på inspirationskonferencen om iværksætteri. Ved afslutningen af projektet står mellem 28 og 77 nye virksomheder og venter på at blive til noget - alle med kvindelige akademikere ved roret. Et af de fem vinderprojekter er MicroKrable af Pernille Ingildsen og Rikke Nikolajsen. Forretningsplanen handler om vandrensning om udvikling af sensorer til onlinedetektion af mikrobakterier i vand. Overvågningen af drikkevandskvaliteten har i dag har to begrænsninger: - den er baseret på stikprøver, som medfører stor tidsforsinkelse mellem udbrud af bakterier og til der er slået alarm (nogle udbrud kan totalt overses). - nuværende analysemetoder ser på indikatororganismer i stedet for de sygdomsfremkaldende bakterier. Nye metoder under udvikling er baseret på analyse af cellers genetiske materiale, og de kan detektere de specifikke mikroorganismer, der er årsag til sygdomme. Det er virksomhedens første mål ud fra en af disse teknologier at udvikle en online sensor til detektion af sygdomsfremkaldende bakterier. Udviklingen af MicroKrables produkter kræver, at flere teknologier kombineres. Det er filosofien at købe viden og forskning fra specialiserede universitetsinstitutter. Selve integrationen af denne viden til et produkt foretages af MicroKrable. Pernille Ingildsen er miljøingeniør og har erfaring inden for automation og Rikke Nikolajsen er kemiingeniør med erfaring inden for mikroteknik. Toppost til kemiker fra Københavns Universitet Prodekan ved Det Naturvidenskabelige Fakultet på Københavns Universitet, professor Sine Larsen, tiltræder den 1. juni stillingen som forskningsdirektør ved en af de største fælleseuropæiske forskningsfaciliteter ESRF (European Synchrotron Radiation Facility), der ligger i Grenoble, Frankrig. Som forskningsdirektør får Sine Larsen direkte indflydelse på brugen og driften af Europas kraftigste røntgensynkrotronstrålingsanlæg, der har et budget på ca. 64 millioner euro. Et synkrotronstrålingsanlæg kan populært sagt sammenlignes med et»supermikroskop«. Det kan bruges i stort set alle naturvidenskabelige grene og giver forskerne mulighed for undersøge strukturer helt ned i de enkelte atomer. Tusindvis af forskere fra de i alt 17 europæiske lande, der støtter og driver anlægget, besøger hvert år ESRF. Sine Larsen er professor i strukturkemi og er en yderst aktiv forsker. Hun har ledet Center for Krystallografiske Undersøgelser på Københavns Universitet, siden det i 1994 blev oprettet med støtte fra Danmarks Grundforsknings Fond. Centeret undersøger sammenhænge mellem proteiners struktur og funktion og opnåede på kort tid international anerkendelse inden for strukturel biologi. Hendes gruppe er en af de få i verden med ekspertise både inden for strukturel kemi og biologi. Ud over sin egen forskning har Sine Larsen lagt kræfter i adskillige kollegiale hverv lokalt og internationalt. Hun har været formand for udvalget vedrørende Bioteknologisk forskning på Københavns Universitet, General Secretary and Treasurer i International Union of Crystallography, og står for den danske indsats i det fælles dansk-svenske 40 millioner kroners projekt Cassiopeia ved MAX-lab i Lund. MAX-lab er den svenske synkrotronstrålingsfacilitet og Cassiopeia-projektet har indvielse den 21. maj. Siden 2002 har Sine Larsen som prodekan desuden lagt kræfter i administrationen af Det Naturvidenskabelige Fakultet. 45 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003