Mikroskopet. Sebastian Frische

Mikroskopet Sebastian Frische

Okularer (typisk 10x forstørrelse) Objektiver, forstørrer 4x, 10x el. 40x Her placeres objektet (det man vil kigge på) Kondensor, samler lyset på objektet Lampe

Oversigt Forstørrelse og opløsningsevne Lysbølger og lysmikroskopi Fluorescensmikroskopi Fasekontrastmikroskopi Elektronmikroskopi

Forstørrelse Forstørrelse udtrykkes ved forholdet mellem billedstørrelse og objektstørrelse i lineært mål (Geneser s 34) Forstørrelsen er et tal, der fortæller hvor mange gange større en ting (f. eks. en celle) vises på et billede

1 cm Afstand på billedet: 30 cm Afstand på musen: 1 cm Forstørrelse (30/1) = 30x

10 cm Ved at indtegne en målestok på billedet får beskueren et umiddelbart indtryk af motivets virkelige størrelse

Mikroskopiske længder millimeter (mm): 1/1000 meter mikrometer ( m): 1/1.000.000 meter n nanometer (nm): 1/1.000.000.000 meter

Mikroskopiske længder millimeter (mm): 1/1000 meter mikrometer ( m): 1/1000 millimeter n nanometer (nm): 1/1000 mikrometer

Opløsningsevne Opløsningsevnen er den mindste afstand 2 objektpunkter må have fra hinanden, når de endnu skal kunne ses adskilt Geneser s 34

d Opløsningsevnen (d) fortæller hvor små ting man kan se med mikroskopet d

Mikroskopet Forstørrelse og opløsningsevne Lysbølger og lysmikroskopi Fluorescensmikroskopi Fasekontrastmikroskopi Elektronmikroskopi

Lysmikroskopi er baseret på lys Lys er elektromagnetisk stråling og kan beskrives både som bølger og som partikler (fotoner)

Lys som bølger Amplitude Bølgelængde En lysbølge har en bølgelængde og en amplitude. Dem ser vi som henholdsvis farve og intensitet.

Bølgelængden stiger fra blåt til rødt lys Omvendt falder frekvensen...lysets hastighed er konstant

Lys som fotoner Fotoner er lysklumper En foton har en bestemt bølgelængde ( farve ) Mængden og bølgelængden af fotoner fra en lyskilde bestemmer farven og intensiteten Hvidt lys indeholder fotoner med mange (alle) synlige bølgelængder Laser-lys indeholder kun fotoner med en bølgelængde

Lyset fra forskellige lyskilder er forskellige blandinger af fotoner Xe-lampe Antal fotoner Hg-lampe 200 400 600 Bølgelængde (nm) 528 Laser

Opløsningsevnen (d) i lysmikroskopi: d = 0.61 x bølgelængde Numerisk Apertur (NA) 1 NA = n* sin(u) u: den halve topvinkel i den lyskegle der opfanges af objektivet og n: brydningsindekset mellem dækglas og mediet mellem dækglas og objektiv 0 sin(u) 1

Optimal opløsningsevne (lille d) fås således hvis bølgelængden er lille og NA er stor d = 0.61 x bølgelængde NA

Jo større topvinkel, jo mere lys ind i objektivet fra hvert punkt......og jo større bliver det numeriske apertur (NA): NA = n* sin(u)

Brydningsindekset (n) mellem dækglas og mediet mellem dækglas og objektiv har også indflydelse på NA:...men hvis mediet og glasset har samme brydningsindeks og den halve topvinkel er 90 o (umuligt i praksis!) er NA maksimal: NA = n* sin(u) NA = 1.51* sin(90 o ) = 1.51*1 = 1.51

Maksimal opløsningsevne for lysmikroskopi: d = 0.61 x bølgelængde 1.51...og da bølgelængden for synligt lys typisk er 500 nm er den mindst opnåelige d = 200 nm = 0.2 mikrometer

Lyset og objektet interagerer Noget af lyset reflekteres, noget absorberes og noget passerer igennem objektet Objekt Amplituden er blevet mindre - lysintensiteten er mindre Bølgelængden er ændret - vi ser en farveændring Der sker fase-forskydning - det kan vi ikke se!

I påfaldende lys ser vi den del af det hvide lys, der reflekteres, hvilket afhænger af objektets overflade og indhold af pigmenter

Normal lysmikroskopi, gennemfaldende lys. Strukturer er synlige, da de absorberer forskellige dele af det hvide lys og derfor fremstår med forskelle i farve og intensitet (oftest skabt ved farvning af præparatet)

Normal lysmikroskopi Hvidt lys ind Farvet lys ud En del af det hvide lys er blevet absorberet, og vi ser de bølgelængder, der slipper igennem Hvad sker der med det absorberede lys? - omdannes til varme i objektet - genudsendes som lys i andre bølgelængder...fluorescens!

Fluorescens mikroskopi blåt lys ind Filter grønt lys ud Fluorescens opstår, når et stof efter at have absorberet en foton, udsender en anden foton (større bølgelængde) Ved brug af passende filtre, kan man nøjes med at se på det udsendte lys og på den måde udelukkende se fluorescensen.

Et fluorescerende stof exciteres i eet bølgelængdeområde og udsender lys i et andet. Excitationsspektrum Emissionsspektrum 450 500 550 Bølgelængde (nm)

fluorescens mikroskop laser konfokal mikroskop Kviksølv-lampe laser dikroisk spejl blænde excitationsfilter emmissionsfilter okular dikroisk spejl pinhole pinhole emmissionsfilter PMT objektiv objektiv

Fluorescensmikroskopi (inkl. konfokal mikroskopi) Kun stoffer, der udsender fluorescenslys med det valgte excitationslys er synlige Ved hjælp af f.eks. antistoffer kan fluorescerende stoffer bindes til bestemte dele (f.eks. et bestemt protein) af præparatet

To-foton laser konfokalmikroskopi: LIVE in vivo Interdigiterende dendritiske celler Th (CD4+) lymfocytter Figur fra Bousso: Nature Reviews Immunology, 8, September 2008

Mørkefeltsmikroskopi

Det afbøjede lys er faseforskudt Objekt faseforskydning Et fasekontrastmikroskop kan oversætte forskydning af fase til ændringer i amplitude, altså intensitetsforskelle. Nobel-prisen i fysik i 1953 gik til hollænderen Fritz Zernike for opdagelsen af fasekontrast og opfindelsen af fasekontrastmikroskopet

Princippet bag fasekontrast Lys fra lampen på objektet Noget af lyset afbøjes og ændrer fase efter kontakt med objektet. Dette er dog den mindste del, og faseskiftet er oftest meget lille Det upåvirkede lys dæmpes og forskydes 1/2 bølgelængde. Dette forøger effekten af interferens Objekt faseplade faseforskydning faseforskydning Interferens mellem de to lysstråler skaber kontrasten, der viser hvor meget lys, der er blevet faseforskudt de forskellige steder i præparatet.

Fasekontrast kræver ikke farvning og kan derfor bruges til levende celler

Elektronmikroskopi er baseret på elektronstråler Elektronstråler har en meget kort bølgelængde (0,005 nm, hvor lys typisk har 500 nm, altså 100000x kortere bølgelængde)...hvad betyder det for opløsningsevnen ved elektronmikroskopi? Tyskeren Ernst Ruska konstruerede i 1933 som den første et elektronmikroskop...27 år gammel! - I 1986 fik han Nobel-prisen i fysik for det.

To typer elektronmikroskopi Transmission (TEM) Scanning (SEM)

Opløsningsevnen ved elektronmikroskopi er langt bedre en ved lysmikroskopi på grund af den langt mindre bølgelængde Optimal TEM opløsningsevne: 0.2 nm...men præparater skaber også støj, så: Typisk TEM opløsningsevne: 2 nm

Opløsningsevne Det blotte øje: 0,2 millimeter Lysmikroskopi : 0,2 mikrometer Elektronmikroskopi 0,2 nanometer (2 nanometer i praksis)

Transmissions elektronmikroskopi (TEM) Elektroner frigives fra katoden og accelleres med 70-300 kv mod anoden Elektromagnetiske linser (spoler) styrer strålen i en lufttom cylinder Objektet skal være meget tyndt (50 nm) for at elektronerne kan trænge igennem Billedet vises på en fluorescerende skærm, optages på film eller med CCD-kamera. Det viser objektets gennemtrængelighed for elektroner.

TEM giver meget detaljerede oplysninger om cellers indre struktur Tynde snit nødvendige, - og farvning for at opnå god kontrast Maunsbach, FG fig. 2:19

Scanning elektronmikroskopi (SEM) En system af elektromagnetiske linser får elektronstrålen til at scanne hen over objektet En detektor opfanger elektroner, der reflekteres af overfladen. Signalet fra detektoren forstærkes og vises på en skærm, der scanner i takt med elektronstrålen på objektet. Dette resulterer i et billede af objektets overflade

SEM giver detaljerede billeder af cellers overflader Verlander et al. 1987, AJP-Renal 253:1142-1156

Tak for idag