Atomic force mikroskopi på blodceller

Transkript

1 1 Atomic force mikroskopi på blodceller Problemstilling: Problemstillingen eleven bliver sat overfor er: Hvad er atomic force mikroskopi, og hvordan kan det bruges til at studere blodceller på nanometerskala? Hvordan varierer vedhæftningskræften med den type celle der undersøges, og det miljø den befinder sig i? Hvad sker der med vedhæftningskræften mellem tippen og en blodplade ved tilsætning af EDTA? Metoder: For at undersøge dette har eleven mulighed for at bruge lysmikroskopi og AFM. For at få de nødvendige data om cellernes respons på en ekstern kraft, skal man benytte friction mode. For at finde ud af hvor store fibre man kan hive ud ad cellen før tippen slipper overfladen (vedhæftningskræften) skal man måle nogle force curves. Det er vigtigt, at eleven også får indsigt i hvordan AFM mikroskopet virker. Øvelsesgang: Eleven har 3 dage til at lave de nødvendige forsøg. Det vil være hensigtsmæssig at følge nedenstående plan for de forskellige dage: 1. Introduktion til de to benyttede mikroskoper, samt teori om indholdet i menneskeblod. Prøveforberedelse samt lysmikroskopi delen af forsøget. Det vil måske være muligt at foretage nogle enkelte målinger med AFM denne dag. 2. AFM målinger hvor målet først er at blive fortrolig med instrumentet og dets fordele og ulemper. Herefter en øget koncentration omkring udseendet af de to forskellige celletyper. Undersøg specielt billeder i friction mode. Hvis der er tid kan også tapping mode benyttes. 3. Hovedsageligt vil denne dag blive benyttet til at foretage kraftkurve målinger med picoforce scanneren. Billederne fra AFM målingerne skal databehandles, og de bedste vælges. Til sidst kan man opsamle det man har gennemgået i form af teori, og se hvilke resultater der er opnået. Prøve forberedelse: Blodet skal helst være på en jævn overflade, så enten glas eller silicium kunne bruges. Det viser sig at glasset reflekterer laserstrålen fra overfladen og ind i detektoren hvilket giver interferens i friction mode billeder. Af denne grund er det hensigtsmæssig at bruge siliciumskiver der er ca. 0,7cm x 0,7 cm.

2 2 Det er vigtigt at få et monolag af blodceller. For at opnå dette, drypper man en lille dråbe blod fra en finger på siliciumskiven, hvorefter et glas cover slip benyttes for at skrabe en tynd, jævn overflade. Sterile nåle til at give bloddråber fra ens finger kan fås i apoteket, eller i synteselaboratoriet ved siden af AFM rummet. Herefter limes siliciumskiven fast på en magnetisk plade der passer ind i AFM mikroskopet. Teori om blod: Det er vigtigt at få indført eleven i hvordan blodet fungerer når det koagulerer. Denne information kan typisk findes i en simpel form på Internettet. Man kan også finde det i lærebøger som The Cell eller lignende. Det samme gælder information om thrombin, EDTA og Calcium. Bindingskonstanten mellem EDTA og Calcium findes fra nedenstående Internet side. ( ) Kort sagt binder EDTA calcium, som er en co-faktor til enzymet thrombin. Når calcium bliver fjernet fra thrombin stopper denne med at forvandle fibrinogen til fibrin. Fibrin er et af de vigtigste molekyler i koaguleringssytemet, da de danner skelettet hvori blodpladerne samles. Figurer af thrombin og EDTA ses i figur 1. Der er to artikler hvor AFM er blevet brugt til at studere blod: Analysis of the coagulation of human blood cells on diamond surfaces by atomic force microscopy Baranauskas V., et al. Nanotechnology 15(2004) Conformational change of membrane proteins leads to shape changes of red blood cells Betz T., et al. Bioelectrochemistry 70(2007) Figur 1: Venstre: Proteinet thrombin bundet til calcium. En kemisk inhibitor er også til stede i billedet. Højre: EDTA der kompleksbinder til calcium.

3 3 Optiske billeder: Det er vigtigt at give eleven en idé om de størrelser der opereres med. Begynd med en forstørrelse på 5X og zoom derefter ind med 20X og 50X zoom, 10X zoom kan også bruges. Den lave zoom kan bruges til at vise overgangen mellem en homogen overflade af blod og enkelte blodlegemer. Den større zoom kan identificere forskellige typer blodceller, hvorefter man kan zoome ind på disse og studere dem nærmere, f. eks. med 100X zoom, hvis det er muligt. Billeder med 5X, 50X og 100X zoom ses i figur 2. Man leder hovedsageligt efter røde blodceller og blod plader. Typisk vil man kunne se røde blodceller i discocyt formen. Nogle af de røde blodceller vil være sammenfoldede i midten, imens andre vil bevare deres form. Hvide blodceller kan også identificeres. Prøv med de forskellige filtre og se hvad der giver billeder med mest information om cellernes udseende. Figur 2: Venstre: 5X zoom af et område med mange blodceller. Midten: 50X zoom fra samme prøve. Her ses enkelte celler, og man begynder at kunne se forskel på dem. Højre: 100X zoom fra samme prøve. Her kan forskellige celler differentieres. Et andet filter er brugt til dette billede. AFM: Der benyttes en nitride sharpened tip med fjederkonstant på 0,06 N/m til at tage contact mode billederne med. Denne er mest følsom, hvilket er nødvendigt for at få god friktion data. Til at begynde med kan man fokusere på at få taget nogle billeder af de forskellige celletyper. Dette gøres i contact mode for at man kan få friktion dataene. Se figur 3. Det handler om at give eleven en idé om de kræfter man påvirker cellen med når man tager et billede, og hvilken type information man får ud af det.

4 4 Figur 3: 3-D billeder af de to forskellige celletyper der undersøges. Øverst, venstre: Et tapping mode billede af en enkelt rød blodcelle. Øverst, højre: Contact mode billede af to røde blodceller der ligger op ad hinanden. Nederst: Contact mode billede af en blodplade. Bemærk forskellen i størrelse af blodpladen og de røde blodceller. Typisk kan man begynde med at se på de røde blodlegemer. Disse vil findes i to typer, nogle der er kollapset i midten pga. den manglende kerne, og nogle der ikke er kollapset. Prøv at tage 10 μm x 10 μm billeder med cellen i midten. Cellerne er ca. 8 μm i diameter. Typisk kan man begynde med en skanhastighed på 2 Hz for at lokalisere de celler man vil undersøge. Det er herefter en god idé at sætte hastigheden ned til 1 Hz når man vil tage billedet. Dette vil mindske artefakterne. Man vil opdage at friktionen af disse celler ikke er nævneværdig anderledes end deres omgivelser. Herefter kan man prøve at tage tilsvarende billeder af en blodplade. Vi ved at deres størrelse er omkring 1-4 μm. Dette vil også kunne ses i deflection dataene. Man vil dog hurtigt se noget andet på friktion billederne. Det lader til at cellen er noget større. Der er et stort område omkring cellen hvor friktionen er markant anderledes end de omkringliggende områder. Se figur 4. Prøv her at tage et større billede, f.eks. 20 μm x 20 μm. Diskuter hvad der kan forårsage denne friktionsændring i området lige omkring cellen. Det kan være at cellerne imploderer når de kommer i kontakt med luften. Det kan også være at blodpladen er blevet aktiveret og har frigivet sin cytosol for at

5 5 forårsage koagulation. Figur 4: Øverst, venstre: Deflection data fra de to celler der ses i figur 3. Øverst, højre: Friction data af de samme celler. Det ses at cellernes overflade har nogenlunde samme friktion som omgivelserne. Nederst, venstre: Deflection data af blodpladen der ses i figur 3. Et område omkring selve cellen skiller sig ud. Dette område ses ikke altid i deflection dataene. Nederst, højre: Friction data af blodpladen. Området omkring cellen og selve cellen har en markant anderledes friktion end omgivelserne. Force curves: Hvis der er tid kan man prøve at måle force curves på enkelte blodplader, eller blodceller. Hvor stor er vedhæftningskraften imellem tip og overflade? Da målingerne skal køres i væske er det vigtigt at cellerne ikke bliver skyllet af overfladen. Desværre sker netop det i PBS buffer. Af denne grund bliver man nød til at binde cellerne til overfladen. Dette vil selvfølgelig have en effekt på forsøget, men der er ingen andre muligheder.

6 6 Skær et stykke glas ca. 0,7 cm x 0,7 cm. En dråbe glutaraldehyd lægges på overfladen og fordeles så jævnt som muligt. Dråben skal tørre før blod bliver tilsat. Det tager ca. 40 minutter før vandet er fordampet. Husk at glutaraldehyd er giftigt og skal omgås med forsigtighed. Når glutaraldyden er fordelt på overfladen tilsættes en dråbe blod. Denne fordeles så jævnt som muligt. Prøv at opnå et monolag, da dette vil gøre det muligt at lave kraftkurver på enkelte celler. Det svært at fordele blodet på glutaraldehyd, så det kan være at flere forsøg skal bruges. Denne del af forsøget køres i en væskecelle. I cellen er der en saltopløsning (PBS). PBS findes koncentreret i AFM rummet og en fortynding laves. Herefter kan man forsøge at få taget nogle kraftkurver. Hvis der er tid kan man prøve at tilsætte noget EDTA. Er der nogen ændring i kraftkurverne? Man kan også prøve at se på et tykt område med størknet blod, og foretage de samme målinger. Hvilken effekt har EDTA i dette system? EDTA kompleksbinder med Calcium. For at danne de fibre som holder en koaguleret blodklat sammen har proteinet thrombin brug for calcium. Når calcium bliver fjernet pga. kompleksbindingen vil blodklatten gå i opløsning. Giver dette mening i forhold til de målinger der blev foretaget? Det er ikke sikkert at disse målinger vil vise nogen nævneværdig forskel. Prøv at sammenligne kraftkurver for røde blodceller og blodplader.