PLATELIA Candida Ag Plus 96 TEST 62784 KONSTATERING AF CANDIDA-MANNANANTIGEN I SERUM ELLER HUMANT PLASMA VED HJÆLP AF IMMUNENZYMATISK ANALYSE

PLATELIA Candida Ag Plus 96 TEST 62784 KONSTATERING AF CANDIDA-MANNANANTIGEN I SERUM ELLER HUMANT PLASMA VED HJÆLP AF IMMUNENZYMATISK ANALYSE 1- TESTENS FORMÅL Platelia Candida Ag Plus er en indirekte immunenzymatisk mikropladeanalyse for kvantitativ konstatering af Candidamannan-antigen i serum eller humant plasma. 2- BRUGSANVISNING Diagnosen invasiv candidiasis skal baseres på en kombination af screening for antistof og cirkulerende antigener. 13 Platelia Candida Ag Plus (kode 62784) er en test, der anvendt sammen med Platelia Candida Ab plus (kode 62785) bidrager til forbedret mulighed for tidlig diagnose 11 og øger diagnosens sensibilitet som en del af en komplet diagnostisk 10, 13, 14 metode, hvori der indgår kliniske og mykologiske data samt indefrakommende og iatrogene risikofaktorer. Denne kombination er ligeledes en integreret del af et bioklinisk patientovervågningssystem som hjælp til fastlæggelse af behandlingen. 8 3- KLINISK VÆRDI Candida-infektioner er den hyppigste form for nosokomielle svampeinfektioner, idet candidæmier tegner sig for den fjerdestørste 12, 15 16 årsag til septikæmier af nosokomiel oprindelse. På det kliniske plan er invasiv candidiasis den mest alvorlige form med en dødelighed, der svinger mellem 30 og 70 % hos de immundeprimerede patienter. Diagnosen er fortsat svær at stille på grund af de kliniske symptomers ringe specificitet og hæmokulturens lave sensibilitet. Det er oftest en kombination af argumenter, der muliggør diagnosen invasiv candidiasis og iværksættelse af en adækvat behandling. 2 I denne sammenhæng skal diagnosen systemisk candidiasis altid bestå af serologiske teknikker og direkte mykologiske metoder. Screening for cirkulerende antigener i serum eller plasma forekommer at 10, 13, 14 være et middel, der muliggør en tidligere diagnose hos patienter med risiko for invasiv candidiasis. De primære risikofaktorer omfatter neutropeni efter kemoterapi eller immunsuppressiv behandling (af cancer-, onkohæmatologiske, transplantationspatienter) 4, 10, bredspektret antibioterapi, forekomst af venekatetre, parenteral ernæring, renal dialyse, 5, 13, 16 proteseimplantation (hos patienter på intensiv og kirurgiske afdelinger). Blandt Candida-antigenerne er mannan et polysaccharid, der er ikke-kovalent bundet til væggen, og som udgør mere end 7 % 9, 10, 13 af tørvægten af C. albicans. Dette antigen forekommer at være én af de primære markører for invasiv candidiasis. En regelmæssig overvågning af risikopatienter, hvor konstatering af mannan-antigenet og anti-mannan-antistoffer kombineres, udgør en hjælp til diagnosticering af invasiv candidiasis. 4- PROCEDUREPRINCIP Platelia Candida Ag Plus er en et-trins indirekte immunenzymatisk mikropladeanalyse af sandwich-typen, der muliggør konstatering af cirkulerende Candida-mannan-antigen i serum eller humant plasma. Det monoklonale antistof (MAb) fra rotter, EBCA-1, der retter sig mod 1-5 oligomannosider af Candida, og som er blevet karakteriseret i tidligere undersøgelser 13, 14, anvendes til: sensibilisering af mikropladens brønde og binding til mannan-antigenet, konstatering af antigen, der er bundet til den sensibiliserede mikroplade (konjugatreagens: peroxidase-mærket MAb). Serum- eller plasmaprøver varmebehandles ved forekomst af EDTA for at separere immunkomplekser og udskille serumproteiner, der eventuelt kan påvirke den immunenzymatiske reaktion. De behandlede serum- eller plasmaprøver og konjugat tilsættes mikropladens brønde, der er sensibiliserede med monoklonalt anti-mannan-antistof. Efter inkubation ved 37 C vaskes teststrimlerne for fjernelse af alt ikke-fikseret materiale. Ved forekomst af cirkulerende mannan i den humane prøve dannes et anti-mannan-antistof - mannan anti-mannan-antistof/peroxidase-kompleks. Tilsætningen af chromogen, der indeholder peroxidasesubstratet og er inkuberet ved stuetemperatur, muliggør påvisning af eventuelt dannede komplekser. Enzymreaktionen standses ved tilsætning af 1N svovlsyre. Den optiske densitet bestemmes med et spektrometer, der er indstillet til en bølgelængde på 450/620 nm. 5- REAGENSER Reagenser leveres i tilstrækkelig mængde til udførelse af 96 bestemmelser i maksimalt 9 serier. Der henvises til indikationerne på kassen for reagensernes opbevaringsbetingelser og udløbsdato. Lad reagenserne opnå stuetemperatur (+18-30 C) inden brug. Nedkøl straks samtlige reagenser til +2-8 C efter brug. Læg ubrugte teststrimler tilbage i posen og luk den omhyggeligt. Fjern ikke tørremidlet. 1

R1 R2 Bestanddel Indhold Mængde Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 62.5 R4b Calibrator 125 R4c Calibrator 250 R4d Calibrator 500 R0 R5 R6 R7 Negative Control Positive Control Conjugate Sample Treatment Solution Mikroplade: - 96 brønde (12 teststrimler med hver 8 brønde), der er sensibiliserede med monoklonalt anti-mannan-antistof EBCA-1. Koncentreret vaskeopløsning (20 x): - TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4) - 2 %Tween 20 Kalibrator 0 pg/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-trehalose-buffer, der ikke indeholder oprenset mannan fra Candida albicans Kalibrator 62,5 pg/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-trehalose-buffer - Mannan oprenset fra Candida albicans Kalibrator 125 pg/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-trehalose-buffer - Mannan oprenset fra Candida albicans Kalibrator 250 pg/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-trehalose-buffer - Mannan oprenset fra Candida albicans Kalibrator 500 pg/ml (klar til brug): - Tris-NaCl-trehalose-buffer - Mannan oprenset fra Candida albicans Negativ kontrol: - Humant serum, der ikke indeholder mannan - Konserveringsmiddel:<1,5% ProClin 300 Positiv kontrol: - Humant serum, der indeholder mannan Konjugat (klart til brug): - Monoklonalt, peroxidase-mærket anti-mannan-antistof - Bromkresolpurpur - Konserveringsmiddel: <1,5 % ProClin 300 Prøvebehandlingsopløsning (klar til brug): - EDTA-syreopløsning uden konserveringsmiddel 1 1 x 70 ml 1 x 2,0 ml 1 x 2,0 ml 1 x 2,0 ml 1 x 2,0 ml 1 x 2,0 ml 2 x 1,5ml 2 x 1,5 ml 1 x 17 ml 1 x 10,5 ml R9 Chromogen TMB TMB-chromogenopløsning (klar til brug): - Opløsning af 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2 O 2 (<1,0 %) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Stopopløsning (klar til brug): - 1N-svovlsyre 1 x 28 ml Selvklæbende film 4 6- HYGIEJNE- OG SIKKERHEDSFORSKRIFTER 1. Alene til in vitro-diagnosticering. 2. Kun til professionel brug. 3. Det anbefales ikke at bruge dette testsæt med andre prøver end humant serum eller plasma. 4. Den negative kontrol R0 og den positive kontrol R5 er fremstillet af humant serum, der er testet og fundet negativt for anti- HIV-1-, anti-hiv-2-, anti-hcv-antistoffer samt HBs-antigen med CE-mærkede test. Samtlige reagenser skal imidlertid håndteres som potentielt smittefarlige. Samtlige test skal udføres i henhold til OSHA-standarden for blodbårne patogener, biosikkerhedsniveau 2, eller i henhold til anden adækvat biosikkerhedspraksis. 5. Bær beskyttelsestøj, herunder laboratoriekittel, beskyttelsesbriller og ansigtsværn samt engangshandsker (syntetiske, latexfrie handsker anbefales), og håndtér sættets reagenser samt patientprøverne i henhold til kravene for god laboratoriepraksis. Vask hænderne grundigt efter udførelse af testen. 6. Undgå at pipettere med munden. 2

7. Undgå at ryge, drikke eller spise i de områder, hvor prøverne eller reagenserne i sættet håndteres. 8. Undgå sprøjt fra prøvemateriale eller opløsninger. 9. Overflader, hvorpå der er spildt en smittefarlig væske, der ikke indeholder syre, skal tørres grundigt af med et effektivt desinfektionsmiddel. De desinfektionsmidler, der kan anvendes, omfatter (men er ikke begrænset til) en 10 % blegemiddelopløsning (0,5 % natriumhypochloritopløsning), 70 % ethanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Materialer, der anvendes til rengøring, skal bortskaffes som biologisk farligt affald. ADVARSEL: Anbring aldrig opløsninger, der indeholder blegemiddel, i autoklaven. 10. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal de tilsmudsede overflader tørres af eller neutraliseres med natriumbikarbonat og derefter skylles og tørres; såfremt den kontaminerende væske indeholder biologisk farligt materiale, skal området vaskes med et kemisk desinfektionsmiddel. 11. Bortskaf alle prøver og materiale, der har været anvendt i udførelsen af testen, som om de indeholder potentielt smitsomme stoffer. Bortskaffelsen skal overholde alle gældende krav til farligt, kemisk og biologisk affald. 12. ADVARSEL: Følgende er en liste over potentielt kemiske risici, der er forbundet med nogle af sættets bestanddele (se kapitel 5 - REAGENSER) Xi - Irriterende Nogle reagenser indeholder ProClin 300 < 1,5 %: R43: Kan forårsage overfølsomhed ved berøring med huden S 24-37-60: Undgå kontakt med huden. Brug egnede beskyttelseshandsker. Dette materiale og dets beholder skal bortskaffes som farligt affald. 13. Materialesikkerhedsdataarket (MSDS) udleveres efter anmodning. 7- FORHOLDSREGLER FOR BRUGERNE 1. NEDFROSNE SERUM- ELLER PLASMAPRØVER, DER HAR VÆRET OPBEVARET UNDER UKENDTE FORHOLD, KAN GIVE FALSKE POSITIVE RESULTATER SOM FØLGE AF KONTAMINATION MED SVAMP OG/ELLER BAKTERIER. 2. Undgå at bruge sættet eller reagenser i sættet efter udløbsdatoen. 3. Undgå at blande reagenser fra andre sæt med andre batchnumre. BEMÆRK: Det er muligt at anvende vaskeopløsninger med andre batchnumre (R2, identifikation*: 20x grønfarvet), chromogen (R9, identifikation*: TMB turkisfarvet) og stopopløsning (R10, identifikation*: 1N rødfarvet) end dem, der medfølger i sættet, forudsat at der anvendes strengt ækvivalente reagenser med samme batchnummer i en given kørsel. BEMÆRK: Vaskeopløsningen (R2, identifikation* 20X grønfarvet) må ikke blandes med vaskeopløsningen (R2, identifikation*: 10X blåfarvet), der medfølger i Bio-Rads reagenssæt. * på flaskens etiket 4. Vent inden brug 30 minutter, således at reagenserne kan stabileres ved stuetemperatur (+18-30 C). 5. Brug fortrinsvis engangsmateriale. Er det ikke muligt, skal der bruges perfekt afvasket udstyr af glas, der er skyllet med destilleret vand. 6. Kontrollér, at pipetterne er præcise, og at de anvendte apparater fungerer korrekt. 7. Genfortynd omhyggeligt reagens R2 og undgå enhver kontamination. 8. Enzymreaktionen er meget følsom over for metal eller metalioner. Som følge heraf må intet metalelement komme i berøring med de forskellige opløsninger, der indeholder konjugatet eller substratopløsningen. 9. Ved manuel pipettering af kontroller og prøver skal der anvendes en ny pipettespids til hvert serum for at forebygge kontamination. 10. For at sikre tilstrækkelig rengøring af brøndene skal det anbefalede antal vaskecyklusser overholdes, og du skal sørge for, at brøndene er helt fyldte og efterfølgende helt tømte. Vask må ikke udføres med en mikropladevasker. 11. Undgå at mikropladen tørrer mellem slutningen af vaskecyklussen og tilsætningen af reagenser. 12. Brug ikke den samme beholder til konjugat og substratopløsning. 13. Undgå at udsætte chromogen- eller substratopløsningen for stærkt lys under opbevaring eller inkubation. Undgå, at chromogenopløsningerne kommer i kontakt med et iltningsmiddel. 14. Chromogenet (R9) skal være farveløst. Forekomst af en blåfarvning indikerer, at reagenset er ubrugeligt og skal kasseres. 15. Undgå, at stopopløsningen kommer i berøring med et iltningsmiddel, metal eller metalioner. 16. Undgå at hælde overskydende konjugat tilbage i den oprindelige beholder. 8- FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENSER Mikroplade (R1) Hver plade med 12 teststrimler er emballeret i en pose. Klip posen op lige under svejsningen. Åbn posen og tag pladen ud. Læg pladen med ubrugte teststrimler tilbage i originalposen. Luk omhyggeligt posen og opbevar den ved +2-8 C. Efter åbning af posen under vakuum er teststrimlerne stabile i 8 uger, når de opbevares ved +2-8 C i deres omhyggeligt lukkede originalpose. Kontrollér, at posen indeholder tørremiddel. Vaskeopløsning (R2) Forbered vaskeopløsning ved at fortynde den koncentrerede vaskeopløsning 20 gange i destilleret vand: 50 ml R2 i 950 ml destilleret vand (anvend 400 ml fortyndet vaskeopløsning til en fuld plade med 12 teststrimler eksklusive dødvolumen på grund af det anvendte apparatur). Efter fortynding kan vaskeopløsningen opbevares i 14 dage ved +2-30 C. Efter åbning er den koncentrerede vaskeopløsning stabil indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis den opbevares ved +2-30 C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. 3

Kalibrator 0 (R3), Kalibrator 62,5 (R4a), Kalibrator 125 (R4b), Kalibrator 250 (R4c), Kalibrator 500 (R4d): Kalibratorerne er klare til brug. Efter åbning er disse reagenser stabile i 8 uger, hvis de opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. Negativ kontrol (R0), positiv kontrol (R5): Den negative kontrol (R0) og den positive kontrol skal behandles med EDTA-opløsningen som patientprøverne for ligeledes at være en behandlingskontrol. Efter åbning er reagenserne stabile i 8 uger, hvis det opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. Konjugat (R6), Prøvebehandlingsopløsning (R7), TMB-chromogenopløsning (R9): Disse reagenser er klare til brug. Efter åbning er disse reagenser stabile i 8 uger, hvis de opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ikke forekommer kontamination. Stopopløsning (R10): Dette reagens er klart til brug. Efter åbning er dette reagens stabilt indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis det opbevares ved +2-8 C, og forudsat der ingen kontamination forekommer. 9- PRØVER 1. Test udføres på serum- eller plasmaprøver indsamlet på EDTA-, heparin- eller citrat-antikogualanter. 2. Overhold følgende forskrifter ved prøvetagning, behandling og opbevaring af blodprøver: - Tag blodprøver i henhold til sædvanlige procedurer. - For serum skal prøverne have lov til at clotte totalt inden centrifugering. - Opbevar de lukkede rør. - Efter centrifugering udvindes serum eller plasma, der opbevares i lukkede rør. - Prøverne opbevares ved +2-8 C, hvis testen udføres inden 5 dage. - Hvis testen ikke udføres inden 5 dage, nedfryses prøverne til -20 C (eller -80 C). - Det kan ikke anbefales at foretage mere end fem nedfrysninger/optøninger. Prøverne skal omhyggeligt homogeniseres (Vortex) efter optøning og inden udførelse af testen. 3. Resultaterne påvirkes ikke af prøver, der indeholder 60 g/l humant albumin eller 120 g/l totalprotein eller 200 mg/l ikkekonjugeret bilirubin eller 200 mg/l konjugeret bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder ækvivalenten til 30 g/l triolein (triglycerid) eller 5 g/l kolesterol eller hæmolyserede prøver, der indeholder 2 g/l hæmoglobin. 4. Undgå at opvarme prøverne. 10- PROCEDURE Medfølgende materialer Se kapitlet REAGENSER Krævede materialer, der ikke medfølger 1. Sterilt, destilleret eller deioniseret vand til fortynding af koncentreret vaskeopløsning. 2. Sugende papir. 3. Engangshandsker. 4. Beskyttelsesbriller. 5. Natriumhypochlorit (blegemiddel) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, der kan være automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller faste, til måling og fordeling af 10 μl til 1000 μl, 1 ml, 2 ml og 10 ml. 7. 1,5 ml mikrocentrifugerør af polypropylen med lufttætte hætter, der kan tåle opvarmning til 120 C (varmeblok) eller 100 C (kogende vandbad) - Rør med skruelåg: 1,5 ml koniske rør, Bio-Rad kat. # 224-0010 eller tilsvarende. ELLER - Rør med snaplåg: EZ-mikrotestør, 1,5 ml, Bio-Rad kat. # 223-9480 eller tilsvarende. 8. Låse til mikrorørslåg (VWR kat. # 6054001 eller tilsvarende). Disse låse forsegler rør med snaplåg og forhindrer lågene i at åbnes på grund af ændringer i temperatur eller tryk. Et lille håndtag gør det muligt at løfte mikrorøret ud af varmeblokken eller vandbadet, hvorved enhver risiko for forbrænding således undgås. 9. Laboratoriebænkcentrifuge til 1,5 ml polypropylenrør, der kan tage 10000 g. 10. Ved anvendelse af varmeblok til behandling af sera: Varmeblok. Følgende varmeblokmodeller anbefales: - model med 1 blok: Grant kat. # QBD1 (VWR kat. # 460-0074) - model med 2 blokke: Grant kat. # QBD2 (VWR kat. # 460-0076) Blok til varmeblok: begge varmeblokke (QBD1,QBD2) skal anvendes sammen med Grant-blok kat. # QB-E1 (VWR kat. # 460-8517). Flydende mikrocentrifugestativ Kogende vandbad, der kan indstilles til 100 C. 11. Prøverør med 25 ml, 50 ml, 100 ml og 1000 ml gradueringer. 12. Beholder til kontamineret affald. 13. Vortex-mixer. 4

14. Mikropladeinkubator, der kan indstilles til 37 C ± 1 C (*). 15. Halvautomatisk eller automatisk mikropladevasker (*). 16. Mikropladelæser med filtre på 450 og 620 nm (*). (*) Kontakt os venligst for præcise informationer om de apparater, som vore tekniske afdelinger har valideret. Behandling af prøver Den negative kontrolprøve (R0) og den positive kontrolprøve R5 skal behandles samtidigt med samtlige patientprøver ved tilsætning af 100 μl behandlingsopløsning R7. Kalibratorerne R3, R4a, R4b, R4c og R4d, der er klare til brug, skal ikke udsættes for denne behandling. 1. Tilsæt 300 μl af hver prøve, der skal testes, og af den negative kontrolprøve (R0) og den positive kontrolprøve (R5) til hvert 1,5 ml polypropylenrør. 2. Tilsæt 100 μl serumbehandlingsopløsning (R7) til hvert rør. 3. Bland grundigt med en vortex-mixer. Luk røret tæt til ved hjælp af en låseklemme for at forhindre utilsigtet åbning under opvarmning. Undgå at prikke hul på hætten. 4. Varmeblok: Opvarm rørene i 6 minutter i en varmeblok ved 120 C. Rørene skal først anbringes i blokken, når den foreskrevne temperatur er nået.(*) ELLER Vandbad: Ved brug af vandbad: Opvarm rørene i 3 minutter ved 100 C.(*) Rørene skal først anbringes i blokken, når den foreskrevne temperatur er nået 5. Fjern forsigtigt de varme rør fra varmeblokken eller vandbadet, og anbring dem i en centrifuge. Centrifugér rørene i 10000 g i 10 minutter. 6. Supernatanten anvendes til konstatering af mannan-antigenet. Test supernatanterne ved hjælp af følgende procedure. Testen skal udføres senest to timer efter behandling af serummet eller plasmaet. (*) Streng overholdelse af den foreskrevne behandlingstid og temperatur, såvel som brug af de anbefalede materialer, er afgørende for, at testen bliver vellykket. Du kan derfor ikke regne med den temperatur, der vises på apparaterne, men skal kontrollere, at temperaturen overholder specifikationerne ved hjælp af et termometer, der indføres i et rør, som indeholder mineralolie: der skal være 120 C inde i røret i en varmeblok og 100 C i et kogende vandbad. NB! Alle prøver, der er behandlet ifølge denne procedure, kan anvendes til at udføre Platelia Aspergillus EIA-testen, eftersom serumbehandlingerne er identiske for de to test. Opbevar ikke prøver (negative og positive kontrolprøver samt testprøver) efter behandling. EIA-procedure Overhold den foreslåede protokol nøje. Overhold god laboratoriepraksis. Reagenserne skal have stuetemperatur (18-30 C) i mindst 30 minutter før brug. Anvend samtlige kalibratorer og den negative og positive kontroller ved hver kørsel til validering af testens kvalitet. Fremgangsmåde: 1. Fastlæg omhyggeligt planen for fordeling og identifikation af kalibratorer, negative og positive kontroller samt testprøver efter følgende plan: A1: Positiv kontrolprøve R5 (supernatant fra den behandlede kontrolprøve) B1: Kalibrator 500 pg/ml (R4d) C1: Kalibrator 250 pg/ml (R4c) D1: Kalibrator 125 pg/ml (R4b) E1: Kalibrator 62,5 pg/ml (R4a) F1: Kalibrator 0 pg/ml (R3) G1: Negativ kontrolprøve R0 (supernatant fra den behandlede kontrolprøve) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R5 S2 S10 B R4d S3 S11 C R4c S4 D R4b S5 E R4a S6 F R3 S7 G R0 S8 H S1 S9 2. Tag pladeholderen og teststrimlerne (R1) ud af den beskyttede pose. Læg ubrugte teststrimler tilbage i originalposen og luk den omhyggeligt. 3. Tilsæt 100 μl behandlet supernatant fra testprøven og kontrolprøven R0 og R5 til de tilsvarende brønde. 4. Tilsæt derefter 100 μl R4d, R4c, R4b, R4a og R3 efter pladens plan. NB! Fordelingen af kalibreringsudsnittet kan kontrolleres på dette håndteringstrin. Intervallet har reelt en farvegraduering, der spænder fra orange (R4d) til lysegul (R3). 5

5. Bland indholdet af flasken R6 ved at vende den før brug. For anvendelse af en multikanalspipette skal der kun udtages det nødvendige volumen for gennemførelse af serien: anvend 2,5 ml til to teststrimler og 8 brønde. 6. Tilsæt 100 μl konjugatopløsning (R6) til hver brønd. 7. Dæk mikropladen med en klæbende film og tryk den omhyggeligt fast på hele overfladen for at sikre tæthed. 8. Inkubér straks mikropladen i en tør mikropladeinkubator i 90 ± 10 minutter ved 37 C (± 1 C). 9. Forbered den fortyndede vaskeopløsning (se kapitel 8). 10. Fjern den klæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en affaldsbeholder til kontamineret affald (en beholder med natriumhypochlorit). Vask mikropladen 5 gange ved hjælp af en mikropladevasker (med 800 μl fortyndet vaskeopløsning). Efter den sidste vask vendes mikropladen og duppes forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 11. Tilsæt hurtigt og ikke i skarpt lys 200 μl TMB-chromogenopløsning (R9) til hver brønd. 12. Inkubér mikropladen i mørke ved +19-25 C i 30 ± 5 minutter. Anvend ikke klæbende film på dette inkubationstrin. 13. Tilsæt 100 μl stopopløsning (R10) til hver brønd i samme rækkefølge og med samme rytme som for substratopløsningen. Bland grundigt. 14. Tør bunden af hver plade grundigt. 15. Aflæs den optiske densitet for hver brønd ved 450 nm (referencefilter på 620 nm) senest 30 minutter efter tilsætning af stopopløsningen (teststrimlerne skal konstant opbevares beskyttet mod lys inden aflæsningen). 16. Tjek inden transskription af resultaterne, at der er konkordans mellem aflæsning og pladernes fordelingsplan. 11- KVALITETSKONTROL (VALIDERINGSKRITERIER) Brug kalibratorerne og kontrolprøverne på hver mikroplade til hver test. Følgende kriterier skal opfyldes, for at testen kan valideres: Værdi for optisk densitet: OD R4a > 0,280 OD R0 < OD R4a Forhold: OD R4a /OD R3 > 1,25 OD R4b / OD R4a > 1,15 OD R4c / OD R4b > 1,15 OD R4d / OD R4c > 1,20 Mannankoncentration i den positive kontrolprøve R5: Koncentrationen af R5 skal svare til den koncentration, der er angivet på flasken ± 30 %. 12- FORTOLKNING AF RESULTATERNE Oprettelse af kalibreringskurven Kalibreringskurven er oprettet ud fra 5 intervalpunkter (kalibratorer) 0 pg/ml, 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml og 500 pg/ml. Opret kalibreringskurven [OD = funktion (pg/ml)] ved plotting på den vertikale akse (Y-aksen) af OD for kalibratorerne R3, R4a, R4b, R4c og R4d og deres respektive koncentration på den horisontale akse (X-aksen) i pg/ml. Vælg en punkt-til-punkt-kurve, der forbinder de forskellige intervalpunkter. Bestemmelse af anti-mannan-antistofkoncentrationen (pg/ml) i de testede prøver Den tidligere oprettede kalibreringskurve kan anvendes til at bestemme mannankoncentrationen, udtrykt i pg/ml, for hver testprøve. Fortolkning af resultaterne Prøver med koncentrationer under 62,5 pg/ml (C < 62,5) betragtes som "negative" for forekomst af mannan-antigen. Prøver med koncentrationer mellem 62,5 og 125 pg/ml (62,5 C < 125) betragtes som "mellemsensitive" for forekomst af mannan-antigen. Prøver med koncentrationer på eller over 125 pg/ml (C 125) betragtes som "positive" for forekomst af mannan-antigen. De anvendte kalibratorer til oprettelse af kalibreringskurven muliggør ikke en præcis bestemmelse af koncentrationer over 500 pg/ml. Testen bør gentages efter forfortynding af den behandlede testprøve (ny behandling) i forholdet 1:5 med den fortyndede vaskeopløsning (R2) (se kapitel 8) for at få en mere præcis bestemmelse af de stærkt positive testprøver. Den således opnåede koncentration skal multipliceres med en faktor 5. Et "mellemsensitivt" resultat vil kunne bekræftes på en ny patientprøve i ugerne efter den prøvetagning, der viste en mellemsensitiv koncentration. 13- PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. En negativ test udelukker ikke diagnosen invasiv candidiasis på grund af den meget lave koncentration af antigen ved infektionen og mannans hurtige eliminering. Der kan først stilles en diagnose på invasiv candidiasis efter sammenligning af de kliniske, terapeutiske, radiologiske, cytologiske, direkte mykologiske og serologiske argumenter, idet hver bestanddel isoleret set skal fortolkes med forsigtighed. 2. En negativ test for mannan-antigen skal ligeledes fortolkes sammen med resultaterne for test af forekomst af anti-mannanantistof: også i tilfælde af invasiv candidiasis er antigenet sværere at konstatere hos patienter, der er testet positive for antimannan-antistoffer (se kapitel 15- Ydeevne). 6

3. Ydeevnen for konstatering af mannanantigen i sera eller plasmaer er forbundet med hyppigheden af test udført for patienterne. Regelmæssig overvågning af patienter i risikogruppen og screening for anti-mannan-antistoffer anbefales for at øge sensitiviteten og opnå en tidlig konstatering ved positiv test. 4. Proceduren for og fortolkningen af resultaterne, der er beskrevet for testen for Platelia Candida Ag Plus, skal følges, når prøverne testes for forekomst af mannan-antigen. Brugeren af sættet anbefales at læse pakkens indlægsinformation grundigt, før testen udføres. Testproceduren skal især følges omhyggeligt ved prøve- og reagenspipettering, vask af mikroplade og tidsbestemmelse af inkubationstrinnene. 5. Der kan opnås et falsk negativt resultat, hvis prøverne eller reagenserne ikke tilsættes som anført i indlægsinformationen. Der skal testes en ny prøve fra samme patient i tilfælde af klinisk mistanke om invasiv candidiasis eller i tilfælde af procedurefejl. 6. Kontamination af negative patientprøvebrønde med brønde med positive kontrolprøver, kalibratorer eller patientprøvebrønder er mulig, hvis indholdet af den ene brønd flyder over i en anden brønd på grund af uforsigtig håndtering af mikropladen eller forkert pipetteringsteknik under tilsætning af reagenserne. 7. Ydeevnen for Platelia Candida Ag Plus er ikke evalueret med serum- eller plasmaprøver fra nyfødte eller pædiatriske patienter. 8. Ydeevnen for Platelia Candida Ag Plus er ikke fastsat for en manuel aflæsning og/eller en visuel bestemmelse af resultaterne. 9. Ved et eksternt studie blev der observeret en krydsreaktion hos patienter, der fik infusion fra bestemte partier af plasmaekspandere til hydroxyethylstivelse (af typen Hesteril 6 %), som anvendes i behandlingen af kredsløbsforstyrrelser: hypovolæmi, hæmoragisk shock, septisk shock. 10. Der er observeret falske positive resultater, når prøverne indeholder 60 g/l humane gammaglobuliner og ligeledes for nogle prøver testet positive for forekomst af anti-toxoplasma-antistof. 14- FORVENTEDE VÆRDIER Prævalensen for det specifikke mannan-antigen for Candida målt ved hjælp af Platelia Candida Ag Plus-testen er blevet evalueret ved anvendelse af et panel af 613 prøver fra 51 nederlandske patienter (Sted 1 Nederlandene), der var indlagt for cancerbehandling (49 patienter med malign hæmopati og 2 med ikke-hæmotologisk cancer) ved intensiv kemoterapi. Ud af 613 prøver blev 88 konstateret positive og 51 mellemsensitive, dvs. en prævalens på 88/613 = 14,4 % [KI 95 %: 11,7-17,4 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 139/613 = 22,7 % [KI 95 %: 19,4-26,2 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. Udtrykt i forhold til patienter havde 23 ud af 51 testede mindst én positiv prøve og 14 mindst én mellemsensitiv prøve uden nogen positiv, dvs. en prævalens på 23/51 = 45,1 % [KI 95 %: 31,1-59,7 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 37/51 = 72,6 % [KI 95 %: 58,3-84,1 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. Ud af disse 51 patienter havde 30 (388 prøver) ikke dokumenteret invasiv candidiasis. Blandt disse blev 20 koloniserede ved hjælp af gær (12 ved hjælp af Candida albicans, 7 ved hjælp af Candida albicans sammen med en anden art af Candida og 1 koloniseret ved hjælp af mindst én ikke-albicans Candida-art). Fire andre patienter havde kliniske symptomer og en superficiel, mikrobiologisk konstateret Candida-infektion. 24 af disse patienter havde svære skader på slimhindebarriererne. Ud af 388 tilsvarende prøver blev 41 konstateret positive og 43 mellemsensitive, dvs. en prævalens på 41/388 = 10,6 % [KI 95 %: 7,7-14,1 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 84/388 = 21,7 % [KI 95 %: 17,7-26,1 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. Udtrykt i forhold til patienter havde 10 ud af 30 testede mindst én positiv prøve og 11 mindst én mellemsensitiv prøve uden nogen positiv, dvs. en prævalens på 10/30 = 33,3 % [KI 95 %: 17,3-52,8 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som negative og 21/30 = 70,0 % [KI 95 %: 50,6-85,3 %], hvor de mellemsensitive resultater blev betragtet som positive. 15- YDEEVNE A. Undersøgelse af reproducerbarhed Præcision for den interne analyse (repeterbarhed): Til evaluering af repeterbarheden for den interne analyse blev fem testprøver (to negative og tre positive) testet i 32 gentagelser i samme serie. Koncentrationen i pg/ml blev bestemt for hver prøve. Middelkoncentrationen, standardafvigelsen (Standard Deviation, SD) og variationskoefficienten (VK %) for hver prøve er angivet i nedenstående tabel: Præcision for den interne analyse (repeterbarhed) N=32 Prøve Negativ Stærkt negativ testprøve Svagt positiv testprøve Middel positiv prøve Stærkt positiv prøve Middelkoncentrationer (pg/ml) 25,1 54,8 63,7 154,1 261,8 SD 4,11 5,20 4,27 8,01 16,93 VK % 16,3 % 9,5 % 6,7 % 5,2 % 6,5 % Præcision for den interne analyse (reproducerbarhed): Til evaluering af reproducerbarheden for den interne analyse blev fem prøver (to negative og tre positive) hver især testet i to eksemplarer i to serier pr. dag over en 20 dages periode. Koncentrationen i pg/ml blev bestemt for hver prøve. Middelkoncentrationen, standardafvigelsen (Standard Deviation, SD) og variationskoefficienten (VK %) for hver prøve er angivet i nedenstående tabel: 7

Præcision for den interne analyse (reproducerbarhed) N=80 Prøve Negativ Stærkt negativ testprøve Svagt positiv testprøve Middel positiv prøve Stærkt positiv testprøve Middelkoncentrationer (pg/ml) 24,1 55,0 70,0 161,6 264,9 SD 6,99 11,47 14,50 30,07 38,62 VK % 29,0 % 20,8 % 20,7 % 18,6 % 14,6 % B. Krydsreaktioner Patologi Antal testede Antal positive Antal mellemsensitive prøver Aspergillus 10 0 1 Anti-ds-dna-antistoffer 10 0 0 Positive ANA 10 0 0 Myelom-IgG og IgM 20 0 1 Anti-Toxoplasma IgG 10 3 1 Humane anti-muse-antistoffer 10 0 0 Rhumatoid faktor 10 0 0 C. Linearitet Linearitetsområdet for Platelia Candida Ag Plus-testen blev bestemt til mellem 20 og 470 pg/ml ud fra undersøgelser af fortyndinger af 4 positive prøver. D. Kliniske test Ydeevnen for Platelia Candida Ag Plus-sættet blev evalueret på 3 steder med i alt 852 prøver fra 505 patienter. SENSITIVITET Platelia Candida Ag Plus-sættets sensibilitet blev bestemt ud fra et panel med 436 prøver fra 89 indlagte patienter på 2 hospitaler i Nederlandene og i Frankrig. Der var følgende fordeling for prøverne: Sted 1 (Nederlandene): 225 prøver fra 21 nederlandske patienter indlagt på en onkohæmatologisk afdeling for behandling mod malign hæmopati (19 tilfælde) eller ikke-hæmotologisk cancer (2 tilfælde) ved hjælp af intensiv kemoterapi, der alt efter tilfældet blev efterfulgt af en hæmatopoietisk stamcelletransplantation. Alle disse patienter havde invasiv candidiasis, der var mikrobiologisk dokumenteret på grundlag af mindst én kultur, der var positiv for Candida (hæmokultur eller kultur af normalt steril vævsprøve). 17 Sted 2 (Frankrig): 211 prøver fra 68 franske patienter indlagt på forskellige hospitalsafdelinger, intensiv eller onkohæmatologisk afdeling, og med invasiv candidiasis, der var mikrobiologisk dokumenteret på grundlag af mindst én positiv hæmokultur for Candida spp. NB! De anvendte prøvepaneler under disse to undersøgelser stammede fra patienter, der fik taget blodprøver mellem 1999 og 2007. Mannan-antigenets og anti-mannan-antistoffernes relative stabilitet i disse prøver i nedfrysningsperioden samt efter hver nedfrysnings- og optøningscyklus gav resultater afhængigt af testpanelets opbevaringstilstand. Testens sensitivitetsværdier, der blev bestemt som led i retrospektive kliniske studier, kan således være mindre end dem, der blev opnået ved prospektive, kliniske studier foretaget på grundlag af nyligt indsamlede prøver. Resultater fra Sted 1 De 21 nederlandske patienter, der indgik i dette studie, blev indlagt for behandling af en malign hæmopati (akut myeloid leukæmi, akut lymfatisk leukæmi, kronisk lymfatisk leukæmi, myelom, myelodysplastisk syndrom, aplastisk anæmi eller ikke- Hodgkin-syndrom) eller en ikke-hæmatologisk cancer ved hjælp af intensiv kemoterapi eventuelt efterfulgt af en hæmatopoietisk stamcelletransplantation. 17 Disse 21 patienter havde udviklet invasiv candidiasis, der var mikroskopisk dokumenteret på grundlag af mindst én kultur, der var positiv for Candida spp. (hæmokultur eller kultur af normalt steril vævsprøve). Status for disse patienter for forekomst af det specifikke mannan-antigen for Candida, konstateret med Platelia Candida Ag Plus-testen, betragtes som positiv, hvis mindst én af patientens prøver er positive. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af patientens prøver er mellemsensitiv, og som negativ, hvis samtlige patientens prøver er negative. 17 Patientkategorier 21 patienter (225 prøver) med mindst én kultur, der er positiv for Candida spp. Resultater for Platelia Candida Ag Plus Antal patienter (antal prøver) Sensitivitet Sensitivitet (mellemsensitive (mellemsensitive Mellemsensitiv Positiv Negativ betragtet som betragtet som negative) positive) 13 (47) 3 (8) 5 (170) 61,9 % 95 % KI [38,4-81,9 %] 76,2 % 95 % KI [52,8-91,8 %] 8

Parallelt med Platelia Candida Ag Plus-testen blev disse samme prøver testet for forekomst af anti-mannan-antistof med Platelia Candida Ab Plus-sættet. 9 Patientens status for forekomst af det specifikke mannan-antigen eller anti-mannan-antistof for Candida betragtes som positiv, hvis mindst én af de to test er positiv. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af de to test er mellemsensitiv, og som negativ, hvis begge test er negative. Patientkategorier 21 patienter (225 prøver) med mindst én kultur, der er positiv for Candida spp. Kombination af resultaterne for Platelia Candida Ag Plus og Platelia TM Candida Ab Plus Antal patienter (antal prøver) Sensitivitet Sensitivitet (mellemsensitive (mellemsensitive Mellemsensitiv Positiv Negativ betragtet som betragtet som negative) positive) 15 (98) 4 (34) 2 (93) 71,4 % 95 % KI [47,8-88,7 %] 90,5 % 95 % KI [69,6-98,8 %] Resultater fra Sted 2 De 68 franske patienter, der indgik i dette studie, blev indlagt på forskellige hospitalsafdelinger for intensiv behandling (kirurgi, transplantation, forbrændinger, traumatologi, pneumologi osv.) eller for onkohæmatologi (malign hæmopati). Alle udviklede invasiv candidiasis, der blev konstateret mikrobiologisk på grundlag af mindst én hæmokultur, der var positiv for Candida ( albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei eller tropicalis) 6, 7, 14 i dagene forud for eller efter den testede blodprøve. Blodprøverne blev i gennemsnit taget 6 dage efter den første hæmokultur, der har positiv for Candida (mindst 61 dage før, maksimalt 67 dage efter). Status for disse patienter for forekomst af det specifikke mannan-antigen for Candida, konstateret med Platelia Candida Ag Plus-testen, betragtes som positiv, hvis mindst én af patientens prøver er positiv. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af patientens prøver er mellemsensitiv, og som negativ, hvis samtlige patientens prøver er negative. Patientkategorier 68 patienter (211 prøver) med mindst én hæmokultur, der er positiv for Candida spp. Resultater for Platelia Candida Ag Plus Antal patienter (antal prøver) Sensitivitet (mellemsensitive Mellemsensitiv Positiv Negativ betragtet som negative) 35 (86) 7 (14) 26 (111) - heraf 34 for C. albicans (113 prøver) 22 (55) 6 (12) 6 (46) - heraf 15 for C. parapsilosis (37 prøver) 2 (3) 1 (1) 12 (33) - heraf 12 for C. glabrata (32 prøver) 7 (13) 0 (0) 5 (19) 51,5 % 95 % KI [39,0-63,8 %] 64,7 % 95 % KI [46,5-80,3 %] 13,3 % 95 % KI [1,7-40,5 %] 58,3 % 95 % KI [27,7-84,8 %] Sensitivitet (mellemsensitive betragtet som positive) 61,8 % 95 % KI [49,2-73,3 %] 82,5 % 95 % KI [65,5-93,2 %] 20,0 % 95 % KI [4,3-48,1 %] 66,7 % 95 % KI [34,9-90,1 %] - heraf 4 for C. tropicalis (19 prøver) 4 (15) 0 (1) 0 (3) 100,0 % * 100,0 % * - heraf 2 for C. krusei (8 prøver) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % * - heraf 1 for C. norvegensis (2 prøver) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % * *: Det var ikke muligt at beregne konfidensintervallet på 95 % på grund af en utilstrækkelig prøvestørrelse. Parallelt med Platelia Candida Ag Plus-testen blev disse samme prøver testet for forekomst af anti-mannan-antistof med Platelia Candida Ab Plus-sættet 9. Patientens status for forekomst af mannan-antigen eller de specifikke anti-mannanantistoffer for Candida betragtes som positiv, når mindst én af disse test er positiv. I fravær af positiv prøve betragtes status som mellemsensitiv, hvis mindst én af de to test er mellemsensitiv, og som negativ, hvis begge test er negative. 9

Patientkategorier 68 patienter (211 prøver) med mindst én hæmokultur, der er positiv for Candida spp. Kombination af resultaterne for Platelia Candida Ag Plus og Platelia TM Candida Ab Plus Antal patienter (antal prøver) Sensitivitet Sensitivitet (mellemsensitive (mellemsensitive Mellemsensitiv Positiv Negativ betragtet som betragtet som negative) positive) 48 (122) 8 (40) 12 (49) - heraf 34 for C. albicans (113 prøver) 28 (74) 2 (22) 4 (17) - heraf 15 for C. parapsilosis (37 prøver) 5 (7) 6 (15) 4 (15) - heraf 12 for C. glabrata (32 prøver) 11 (24) 0 (3) 1 (5) 70,6 % 95 % KI [58,3-81,0 %] 82,4 % 95 % KI [65,5-93,2 %] 33,3 % 95 % KI [11,8-61,6 %] 91,7 % 95 % KI [61,5-99,8 %] 82,4 % 95 % KI [71,2-90,5 %] 88,2 % 95 % KI [72,6-96,7 %] 73,3 % 95 % KI [44,9-92,2 %] 91,7 % 95 % KI [61,5-99,8 %] - heraf 4 for C. tropicalis (19 prøver) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0 % * 100,0 % * - heraf 2 for C. krusei (8 prøver) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0 % * 0,0 % * - heraf 1 for C. norvegensis (2 prøver) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0 % * 0,0 % * *: Det var ikke muligt at beregne konfidensintervallet på 95 % på grund af utilstrækkelig prøvestørrelse. SPECIFICITET Specificiteten blev bestemt ud fra et panel på 416 prøver, der stammede fra 2 steder i Frankrig, med følgende fordeling: Sted 1: 200 prøver fra 200 franske patienter, der blev overvåget for toxoplasmose-serologi under svangerskab, og som ikke havde kliniske symptomer på Candida-infektion. Sted 2: 216 prøver fra 216 franske bloddonorpatienter. Patientkategorier 200 gravide kvinder (200 prøver) overvåget for toxoplasmose-serologi Resultater for Platelia Candida Ag Plus Antal patienter (antal prøver) Specificitet (mellemsensitive Mellemsensitiv Positiv Negativ betragtet som positive) 3 2 195 216 bloddonorer (216 prøver) 1 1 214 97,5 % 95 % KI [94,3-99,2 %] 99,1 % 95 % KI [96,7-99,9 %] Specificitet (mellemsensitive betragtet som negative) 98,5 % 95 % KI [95,7-99,7 %] 99,5 % 95 % KI [97,5-100 %] 16- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle produkter, der fremstilles og markedsføres af selskabet Bio-Rad, kvalitetssikres fra modtagelse af råmaterialerne til markedsføring af slutprodukterne. Hvert parti af slutprodukter kvalitetskontrolleres og markedsføres kun, hvis det opfylder acceptkriterierne. Producenten opbevarer dokumentation for fremstilling og kontrol af hvert parti. 17- BIBLIOGRAFISKE REFERENCER 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of (1,3)- beta-d-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candida species specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p. 1-9. 2- Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag, D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p. 7 14. 3- Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J. 2005. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p. 65-84. 4- Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p. 606-615. 5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M., Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p. 55 62. 6- Nucci, M.,, Colombo, A.L. 2007. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p. 77 82. 10

7- Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G. 2008. Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p. 377-397. 8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F., Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503 535. 9- Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S. 2002. Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p. 455 460. 10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p. 95 101. 11- Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R. 1998. The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p. 781 788. 12- Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R. 2009. Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p. 443 451. 13- Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433 442. 14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D. 2003. Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalisinfection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p. 4551 4558. 15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p. 317 322. 16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p. 289 292. 17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E. 2009. Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2011 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881082 www.bio-rad.com 11