2 - ANVENDELSESOMRÅDE

Transkript

1 PLATELIA Aspergillus IgG TEST PÅVISNING AF IgG ANTI-ASPERGILLUS-ANTISTOFFER I HUMANT SERUM ELLER PLASMA VED HJÆLP AF EN IMMUNENZYMATISK METODE 1 - FORMÅL Platelia Aspergillus IgG er en indirekte immunenzymatisk teknik udført på mikroplade til påvisning af IgG anti- Aspergillus-antistoffer i humant serum eller plasma. 2 - ANVENDELSESOMRÅDE Platelia Aspergillus IgG er en analyse, der - når den fortolkes på basis af patientens kliniske og terapeutiske kontekst, og når den udføres sammen med andre diagnostiske teknikker såsom radiologiske, cytologiske, immunologiske og mykologiske undersøgelser - kan anvendes som hjælp til at diagnosticere Aspergillus-patologier. 3 - KLINISK INTERESSE Der forekommer forskellige kroniske Aspergillus-patologier i immunkompetente, og diagnosen af disse medfører ofte vanskeligheder. Et forløb med sensibilisering over for skimmelsvampe ligger til grund for allergiske manifestationer såsom astma, allergisk bronchopulmonal aspergillosis (ABPA), der udgør den mest alvorlige kliniske præsentation4, 8. Patienter, der lider af mukoviskidose, udgør en risikogruppe for ABPA og overvåges regelmæssigt med henblik på denne diagnose1, 2. Hos, der er udsat for massiv inhalation af sporer, kan der forekomme extrinsic allergisk alveolitis; de mest kendte former er fugleholderlunge og tærskerlunge. Aspergilloma udgør den mest typiske ikke-allergene kroniske patologi, der er et resultat af kolonisering af et præeksisterende lungehulrum (tuberkulose, emfysem, sarcoidose, lungecancer) med svampemycelier, der danner en Aspergillus-klump 4, 6, 10. I forbindelse med de andre ikke-allergeniske patologier udgør kronisk nekrotisk aspergillosis en særligt alvorlig progressiv dødelig form. I disse forskellige kliniske manifestationer, hvad enten det er allergisk eller ikke-allergisk, er det ofte vanskeligt at diagnosticere aspergillosis. Dette skyldes, at de kliniske tegn kan tyde på andre mykosiske, bakterielle, virale sygdomme og endda kræftsygdomme. Radiologisk undersøgelse, der er karakteristisk for aspergilloma, er betydeligt mindre karakteristisk for de andre former for aspergillosis, hvor klinisk og radiologisk undersøgelse kun repræsenterer elementer i en diagnostisk orientering. Biologiske parametre og i særdeleshed serologiske test er uomgængelige redskaber i forbindelse med denne diagnose5. Hos med risiko for aspergilloma, en alvorlig men ofte klinisk set skjult infektion, er en serologisk undersøgelse følgelig relevant. Visse diagnoser af ABPA er baseret på fem kriterier inklusive serologisk påvisning af anti-aspergillus-antistof13. Platelia Aspergillus IgG, der er en metode, der anvendes til at påvise klasse G-immunglobuliner rettet mod et rekombinant, renset antigen af Aspergillus, er et nyttigt redskab til at diagnosticere disse kroniske former for aspergillosis, der observeres hos immunkompetente 3. Forekomsten af anti-aspergillus-antistoffer er desuden i den senere tid blevet beskrevet hos onko-hematologiske, inden der er anordnet en immunosuppressiv behandling for knoglemarvstransplantation. Disse studier anbefaler en påvisning af en Aspergillus-kolonisering, når patienten er indlagt på hospitalet eller i balancen inden transplanteringen hos de, der vil udgøre en risikogruppe for invasiv aspergillosis, efter at de immunosuppressive behandlinger er indledt. 4 - PRINCIPPER FOR PROCEDUREN PlateliaTM Aspergillus IgG er en tofaset indirekte immunenzymatisk teknik udført på mikroplade, der anvendes til påvisning af IgG anti-aspergillus-antistoffer i humant serum eller plasma. Prøver af fortyndet serum eller plasma fordeles i brøndene på mikropladen, der er sensibiliseret med renset rekombinant Aspergillus-antigen7. Efter inkubation ved 37 C skal strimlerne vaskes af for at fjerne al ubundet materiale. Konjugatet (anti-human IgG monoklonalt antistof fra mus mærket med peroxidase) kommes i hver brønd på mikropladen og inkuberes ved 37 C. Der dannes et kompleks, hvis IgG anti-aspergillus forefindes i den humane prøve: Ag Aspergillus - human IgG anti- Aspergillus - anti-human IgG Ab/peroxidase fra mus. Strimlerne vaskes for at fjerne al ubundet materiale. Tilsætning af kromogen, der indeholder peroxidase-substrat, og inkubation ved stuetemperatur har til formål at afsløre eventuelt dannede komplekser. Den enzymatiske reaktion stoppes ved at tilsætte 1N svovlsyre. Der anvendes et spektrofotometer, der er indstillet til 450/620 nm, til at aflæse den optiske densitet.

2 5- REAGENSER Der er leveret reagenser i et tilstrækkeligt antal til at udføre 96 bestemmelser eller maksimalt 9 testkørsler. Opbevaringsbetingelser og udløbsdato for reagenserne fremgår af oplysningerne på kassen. Alle reagenser skal have stabiliseret sig ved stuetemperatur ( C), inden de anvendes. Nedkøl alle reagenserne til +2-8 C øjeblikkeligt efter brug. Læg de ubrugte strimler tilbage i originaletuiet, og forsegl dem omhyggeligt. Fjern ikke tørremidlet. Mærkning Reagenstype Præsentation Mikroplade: 1 R1 Microplate - 96 brønde (12 strimler, der hver især indeholder 8 brønde) sensibiliseret med det rensede rekombinante Aspergillus-antigen. R2 Koncentreret vaskeopløsning (20x) 1 x 70 ml Concentrated TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4) Washing Solution - 2 %Tween 20 (20x) Kalibrator 0 AU/ml (brugsklar): 1 x 2,5 ml R3 Calibrator 0 - Tris-NaCl-buffer, der ikke indeholder IgG anti-aspergillus Kalibrator 10 AU/ml (brugsklar): 1 x 2,5 ml R4a Calibrator 10 - Humant serum med anti-aspergillus-antistoffer Kalibrator 20 AU/ml (brugsklar): 1 x 2,5 ml R4b Calibrator 20 - Humant serum med anti-aspergillus-antistoffer Kalibrator 40 AU/ml (brugsklar): 1 x 2,5 ml R4c Calibrator 40 - Humant serum med anti-aspergillus-antistoffer Kalibrator 80 AU/ml (brugsklar): 1 x 2,5 ml R4d Calibrator 80 - Humant serum med anti-aspergillusantistoffer. Konjugat (brugsklar): 1 x 26 ml R6 Conjugate - Anti-humant IgG monoklonalt antistof fra mus mærket med peroxidase - Fenolrødt R7a R7b R9 R10 Sample Diluent 1 Sample Diluent 2 Chromogen TMB Stopping Solution Prøvefortyndervæske 1 (brugsklar): - Tris-NaCl-buffer, - 0,1 % Tween 20, - Fenolrødt Prøvefortyndervæske 2 (brugsklar): - Tris-NaCl-buffer, - 0,1 % Tween 20, - Bromkresolpurpur Kromogen TMB opløsning (brugsklar) - 3,3,5,5 - tetrametylbenzidin (< 0,1 %)-opløsning, H 2 O 2 (<1,0 %) 1 x 28 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml Stopopløsning (brugsklar): 1 x 28 ml -1N-svovlsyreopløsning Selvklæbende film SUNDHEDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER 1. Må kun anvendes til in vitro-diagnosticering. 2. Kun til professionelt brug. 3. Vi anbefaler, at denne analyse ikke anvendes med andre prøver end humant serum eller plasma. 4. Kalibrator R4a, R4b, R4c og R4d er fremstillet af humant serum, der er testet negativt for anti-hiv-1, anti-hiv-2 og anti-hcv-antistoffer såvel som HBs-antistoffer, der benytter CE-mærkede test. Alle reagenser skal dog som potentielt infektiøse. Alle test skal gennemføres i overensstemmelse med OSHA-standarden vedrørende patogene stoffer, der overføres hematogent, biosikkerhedsniveau 2, eller i overensstemmelse med andre egnede biosikkerhedspraksis. 5. Bær beskyttelsesdragt inklusive en laboratoriekittel, øjen- og ansigtsbeskyttelse og engangshandsker (handsker fremstillet af syntetisk materiale uden latex anbefales), og håndtér reagenserne i sættet og patientprøverne i overensstemmelse med foreskreven god laboratoriepraksis (GPL). Vask hænderne grundigt efter udførelse af analysen. 6. Undgå at pipettere med munden.

3 7. Undgå at ryge, drikke og spise i de områder, hvor prøverne eller reagenserne i sættet håndteres. 8. Undgå at stænke med prøvematerialer eller opløsninger. 9. Overflader, der er farvet med kontaminerende væske, der ikke indeholder syre, skal renses grundigt ved hjælp af et effektivt desinfektionsmiddel. Desinfektionsmidler, der kan bruges (men ikke kun disse), er f.eks. en 10 % klorinvandsopløsning (0,5 % natriumhypochloritopløsning), 70 % ethanol eller 0,5 % Wescodyne Plus. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres og anbringes i en særlig beholder til kontamineret affald. ADVARSEL: Kom aldrig opløsninger, der indeholder klorinvand, i dampsterilisatoren. 10. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal farvede overflader tørres af eller neutraliseres ved hjælp af natriumbikarbonat, og området skal skylles af og tørres; hvis den kontaminerende væske indeholdt biologisk farligt materiale, skal området vaskes af med et kemisk desinfektionsmiddel. 11. Alle prøver og reagenser, der anvendes til analysen, skal bortskaffes som potentielt infektiøse. Farlige kemiske og biologiske spildprodukter skal bortskaffes i overensstemmelse med de gældende forskrifter. 12. ADVARSEL: Potentielt kemiske risici, som nogle komponenter i sættet indebærer, er anført nedenfor (se kapitel 5 - REAGENSER) Xi-Irritans Nogle reagenser indeholder ProClinTM 300 < 1,5 %: R43: Kan fremkalde irritation ved hudkontakt. S : Undgå indånding af dampe/sprøjtetåge. Undgå hudkontakt. Benyt egnede handsker. Dette materiale og beholderen til det skal bortskaffes som farligt affald. 13. Materialesikkerhedsdataarket (MSDS) udleveres efter anmodning. 7 - FORHOLDSREGLER FOR BRUGEREN 1. FROSNE PRØVER, DER OPBEVARES UNDER FORHOLD, DER ER OS UKENDTE, KAN GIVE FORKERTE POSITIVE RESULTATER SOM FØLGE AF FUNGAL OG/ELLER BAKTERIEL KONTAMINATION. 2. Anvend ikke sættet eller nogle af reagenserne i sættet efter udløbsdatoen. 3. Undgå at blande eller kombinere reagenser fra beholdere med forskellige partinumre inden for samme serie. BEMÆRK: Der kan anvendes andre partier af vaskeopløsningen (R2, etiketidentifikation* 20x, grøn), af kromogen (R9, etiketidentifikation* TMB, turkis) og af stopopløsningen (R10, etiketidentifikation* 1N, rød) end de, der leveres med beholderen, under forudsætning af, at reagenserne inden for samme serie svarer helt til hinanden og er fra samme parti. BEMÆRK: Vaskeopløsningen (R2 etiketidentifikation* 20x, grøn) må ikke blandes med vaskeopløsningen (R2 etiketidentifikation* 10x, blå), der leveres i Bio-Rad-reagenssæt. * på flaskens etiket 4. Vent 30 minutter, før reagenserne fordeles, så de kan stabilisere sig ved stuetemperatur ( C). 5. Brug fortrinsvis engangsudstyr. Hvis ikke dette er muligt, skal der anvendes glasbeholdere, der er blevet vasket grundigt af og skyllet efter med destilleret vand. 6. Kontrollér, om pipetterne er i orden, og om de benyttede instrumenter fungerer korrekt. 7. Rekonstituér reagens R2 forsigtigt, og undgå kontamination. 8. Den enzymatiske reaktion er meget følsom over for metaller eller metalioner. Derfor må metal ikke komme i kontakt med de forskellige opløsninger, der indeholder konjugat- eller substratopløsningen. 9. Når der pipetteres kalibratorer og prøver, skal der anvendes en ny pipettespids for hver brønd for at undgå kontamination. 10. For at sikre, at brøndene vaskes tilstrækkeligt, skal du gennemføre det anbefalede antal afvaskninger og sikre dig, at alle brøndene fyldes helt og derefter tømmes helt. Afvaskningen skal gennemføres ved hjælp af en mikropladevasker. 11. Undgå, at mikropladen tørrer mellem afslutningen af afvaskningen og tilsætningen af reagenser. 12. Brug ikke den samme flaske til konjugat- og udviklingsopløsninger. 13. Undgå at udsætte kromogenopløsningen eller afsløringsopløsningen for stærkt lys under opbevaring og inkubation. Undgå, at opløsninger, der indeholder kromogen, kommer i kontakt med iltningsmidler. 14. Kromogenet (R9) bør være farveløst. Hvis der forekommer en blå farvning, er reagensen ubrugelig og skal skiftes ud. 15. Undgå, at stopopløsningen kommer i kontakt med iltningsmidler, metal eller metalioner. 16. Undgå at hælde overskydende ubrugt konjugat tilbage i den oprindelige flaske. 8 - FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENSER Mikroplade (R1) Hver ramme indeholder 12 strimler og er pakket i en pose. Skær posen op med en saks lige under forseglingen. Åbn posen, og tag rammen ud. Læg rammen med de ubrugte strimler tilbage i originalposen. Luk posen forsigtigt, og opbevar den ved +2-8 C. Efter at den vakuumpakkede pose er åbnet, er strimlerne stabile i 8 uger, når de opbevares ved +2-8 C i deres originalpose, og denne er blevet forseglet igen forsigtigt. Kontrollér, om tørremidlet stadig er til stede.

4 Vaskeopløsning (R2) Forbered vaskeopløsningen ved at fortynde den koncentrerede opløsning 20 gange i destilleret vand. 50 ml af R2 i 950 ml destilleret vand. (brug 650 ml fortyndet vaskeopløsning til en hel plade med 12 strimler foruden dødvolumenet af benyttet vasker). Efter fortyndingen kan vaskeopløsningen opbevares i 14 dage ved C. Efter at den koncentrerede vaskeopløsning, der opbevares ved C, er åbnet, er den stabil indtil udløbsdatoen, der står på etiketten, forudsat at der ikke forekommer kontamination. Kalibrator 0 (R3), kalibrator 10 (R4a), kalibrator 20 (R4b), kalibrator 40 (R4c), kalibrator 80 (R4d): Kalibratorerne er klar til brug. Disse reagenser, der opbevares ved +2-8 C, er efter åbningen stabile i 8 uger, hvis de ikke udsættes for kontamination. Konjugat (R6), prøvefortynder 1 (R7a), prøvefortynder 2 (R7b), TMB kromogen-opløsning (R9): Disse reagenser er klar til brug. Disse reagenser, der opbevares ved +2-8 C, er efter åbningen stabile i 8 uger, hvis de ikke udsættes for kontamination. Stopopløsning (R10): Denne reagens er klar til brug. Efter at denne reagens, der opbevares ved +2-8 C, er åbnet, er den stabil indtil holdbarhedsdatoen, der står på etiketten, forudsat at der ikke forekommer kontamination. 9 - PRØVER 1. Testene udføres på prøver af serum eller plasma, der er taget på EDTA-heparin eller citrat-antikoalugans 2. Overhold følgende instruktioner for prøvetagning, behandling og opbevaring af disse blodprøver: Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis. Ved serum skal koaglet udformes fuldstændigt inden centrifugeringen. Hold rørene lukket. Efter centrifugeringen skal serummet eller plasmaen udskilles og opbevares i et lukket rør. Prøverne opbevares ved +2-8 C, hvis analysen udføres inden for 4 dage. Hvis ikke analysen udføres inden for 4 dage, fryses prøverne ned til -20 C (eller -80 C). Nedfrysning og efterfølgende optøning bør ikke foretages mere end fem gange. Prøverne skal homogeniseres forsigtigt (Vortex) efter optøning, og inden analysen udføres. 3. Resultaterne påvirkes ikke af prøver, der indeholder 90 g/l albumin, 100 mg/l ukonjugeret bilirubin, lipæmiske prøver, der indeholder, hvad der svarer til 36 g/l triolein (triglycerid), eller hæmolyserede prøver, der indeholder 10 g/l hæmoglobin. 4. Prøverne må ikke opvarmes PROCEDURE Udstyr, der medfølger Se kapitlet REAGENSER Påkrævet udstyr, der ikke medfølger 1. Sterilt, destilleret eller demineraliseret vand til fortynding af den koncentrerede vaskeopløsning. 2. Sugende papir. 3. Engangshandsker. 4. Beskyttelsesbriller. 5. Natriumhypoklorit (klorinvand) og natriumbikarbonat. 6. Pipetter eller multipipetter, enten automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede, der kan måle og levere 10 μl til 1000 μl, 1 ml, 2 ml og 10 ml. 7. Graduerede testrør til 25 ml, 50 ml, 100 ml og 1000 ml. 8. Engangsrør 9. Beholder til kontamineret affald. 10. Vortex-mikser. 11. Mikropladeinkubator, der kan indstilles til 37 C ± 1 C (*). 12. Halvautomatisk eller automatisk mikropladevasker (*). 13. Mikropladelæser med filtre på 450 og 620 nm (*). (*) Henvend dig til os for nærmere oplysninger angående udstyr, der er valideret af vores tekniske afdelinger. EIA-procedure Overhold den angivne protokol. Overhold god laboratoriepraksis: - Sørg for, at reagenserne stabiliserer sig ved stuetemperatur (18-30 C) mindst 30 minutter, inden de anvendes. - Brug alle kalibratorer, hver gang doseringen benyttes til at validere analysen.

5 Fremgangsmåde: 1. Udarbejd omhyggeligt en plan til fordeling og identifikation af kalibratorer og patientprøver. 2. Forfortynd prøverne, der skal testes: i forholdet 1/20, dvs. 10 μl serum eller plasma μl prøvefortynder 1 (R7a). Forfortynd prøveresultaterne i en rød farvning. 3. Tag rammen og strimlerne (R1) ud af beskyttelsesindpakningen. Læg de ubrugte strimler tilbage i indpakningen, og forsegl den igen. 4. Fordel 190 μl prøvefortynder 2 (R7b) i brøndene, der skal rumme prøverne, der skal testes, og tilsæt 10 μl forfortyndede prøver i forholdet 1/20, bland det varsomt ved sugning, og gentag forløbet 2 eller 3 gange. NB! Ved dette trin i proceduren kan fordelingen kontrolleres, for efter tilsætningen af 10 μl forfortyndede prøver skifter brøndene, der indeholder prøver, farve og bliver grå. En kop, der ikke indeholder nogen prøve, har en blå-violet farve. 5. Fordel de brugsklare kalibratorer med 200 μl pr. Brønd i overensstemmelse med følgende plan: - A1: Kalibrator 0 (R3) - B1: Kalibrator 10 AU/ml (R4a) - C1: Kalibrator 20 AU/ml (R4b) - D1: Kalibrator 40 AU/ml (R4c) - E1: Kalibrator 80 AU/ml (R4d) A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Dæk mikropladen til med en selvklæbende film, der presses fast ned over overfladen, så den slutter helt til overalt. 7. Inkubér øjeblikkeligt mikropladen i en tør mikropladeinkubator i 60 ± 5 minutter ved 37 C (± 1 C). 8. Klargør den fortyndede vaskeopløsning (se kapitel 8). 9. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af hver brønd op i en beholder (der indeholder natriumhypochlorit) til kontaminerede affaldsprodukter. 10. Vask mikropladen 4 gange ved hjælp af en mikropladevasker (med 800 μl fortyndet vaskeopløsning). Vend mikropladen efter den sidste vask, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 11. Homogenisér indholdet i flaske R6 ved at vende den på hovedet, inden den bruges. Når du anvender en multipipette, skal du kun opsuge det volumen, der behøves for serien: Anvend 3,5 ml til to strimler á 8 kopper. 12. Fordel 200 μl R6 konjugat i hver brønd. 13. Dæk mikropladen til med en selvklæbende film, der presses fast ned over overfladen, så den slutter helt til overalt. 14. Inkubér mikropladen i en tør mikropladeinkubator i 60 minutter (± 5 minutter) ved 37 C (± 1 C). 15. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af hver brønd op i en beholder (der indeholder natriumhypochlorit) til kontaminerede affalds-produkter. 16. Vask mikropladen 4 gange ved hjælp af en mikropladevasker (med 800 μl fortyndet vaskeopløsning). 17. Fordel hurtigt 200 μl TMB (R9) kromogenopløsning i hver brønd, og undgå at udsætte dem for skarpt lys. 18. Inkubér mikropladen i mørke ved stuetemperatur ( C) i 30 ± 5 minutter. Undgå at bruge selvklæbende film under dette inkubationstrin. 19. Tilsæt 100 μl stopvæske (R10) i hver brønd i samme rækkefølge og takt som under tilsætningen af substratopløsningen. Bland grundigt. 20. Tør undersiden af hver mikroplade forsigtigt af. 21. Aflæs den optiske densitet i hver brønd ved 450 nm (referencefilter ved 620 nm) inden for 30 minutter efter tilsætningen af stopopløsningen (strimlerne skal altid opbevares i mørke inden aflæsningen). 22. Kontrollér, at der er overensstemmelse mellem aflæsningsresultatet og fordelingsplanen for mikropladen, inden resultaterne rapporteres KVALITETSKONTROL (VALIDERINGSKRITERIER) Anvend ved alle testkørsler kalibratorerne på alle mikroplader. Følgende kriterier skal overholdes ved validering af analysen: Værdi for optisk densitet: OD R4a > 0,200 Forhold: OD R4a/OD R3 > 3,00 OD R4b/OD R4a > 1,20 OD R4c / OD R4b > 1,20 OD R4d / OD R4c > 1,00

6 12 - FORTOLKNING AF RESULTATER Optegning af kalibreringskurven Kalibreringskurven defineres ved de 5 intervalpunkter (kalibratorer) 0, 10, 20, 40 og 80 AU/ml. Kalibreringskurven tegnes [OD = funktion (AU/ml)] ved at angive OD for kalibratorerne R3, R4a, R4b, R4c og R4d på den lodrette (Y) akse og derefter angive deres respektive koncentration i AU/ml på den vandrette (X) akse. Vælg en punkt til punkt-sti, der forbinder de forskellige intervalpunkter. Bestemmelse af koncentrationen af IgG anti-aspergillus antistoffer (AU/ml) i de testede prøver Koncentrationen i IgG anti-aspergillus-antistoffer, der er udtrykt i AU/ml, kan bestemmes for hver prøve, der er testet ved hjælp af kurveoptegningen i afsnit 12. Fortolkning af resultater Prøver med koncentrationer under 5 AU/ml (C < 5) som "negative" mht. forekomst af IgG anti- Aspergillus-antistof. Prøver med koncentrationer mellem 5 og 10 AU/ml (5 C < 10) som "inkonklusive" mht. forekomst af IgG anti-aspergillus-antistof. Prøver med koncentrationer over eller lig med 10 AU/ml (C 10) som "positive" mht. forekomst af IgG anti-aspergillus-antistof. Intervalpunkter, der benyttes til at tegne kalibreringskurven, kan ikke anvendes til at opnå en nøjagtig titrering af koncentrationer over 80 AU/ml. Hvis du vil bestemme titeren af markant positive prøver mere nøjagtigt, skal du gennemføre analysen igen, idet du udfører en ekstra forfortynding af prøven ved fortynding af R7a: - For prøver med en titer > 80 AU/ml og med en OD < 3,000: Forfortynd først til 1/5 af prøven i R7a. - For prøver med en titer > 80 AU/ml og med en OD 3,000: Forfortynd først til 1/60 af prøven i R7a. Efter denne indledende forfortynding skal proceduren, der er anført i kapitel 10, følges (forfortynding til 1/20 i R7a og derefter fortynding til 1/20 i R7b). Titeren af den markant positive prøve udregnes ved at multiplicere den opnåede titer med faktoren af den første forfortynding (dvs.: 5 eller 60 alt efter den udførte forfortynding). Et inkonklusivt resultat kan bekræftes med en anden prøve fra patienten inden for 2-3 uger efter datoen for prøven med den inkonklusive titer. I forbindelse med en serologisk overvågning af patienten anbefaler vi, at du kontrollerer alle prøver fra patienten inden for samme serie for at påvise betydelige variationer af titere af IgG anti-aspergillus-antistoffer PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. Et negativt resultat udelukker ikke en diagnose af aspergillosis. En diagnose af aspergillosis kan kun foretages efter en undersøgelse af de kliniske, terapeutiske, radiologiske, cytologiske, direkte mykologiske og serologiske resultater, idet hvert enkelt element skal fortolkes isoleret og med omtanke. 2. Hos en immunkompetent patient, der forventes at have aspergillosis, kan prøver, der er taget på et tidligt stade af Aspergillus-infektionen, vise et negativt resultat mht. påvisning af IgG anti-aspergillus. Det anbefales derfor, at der gennemføres en ny analyse af en prøve, der tages to til tre uger senere. 3. Proceduren og fortolkningen af resultaterne, der er beskrevet for Platelia Aspergillus IgG-analysen, skal overvåges, når prøverne testes for forekomst af IgG anti-aspergillus-antistoffer. Vi anbefaler, at brugeren af sættet læser indlægssedlen omhyggeligt, inden analysen udføres. Protokollen skal følges særligt tæt i forbindelse med pipettering af prøver og reagenser, vaskning af mikropladen og timing af inkubationstrinnene. 4. Hvis ikke prøverne og reagenserne tilsættes som anført på indlægssedlen, kan der opnås et forkert negativt resultat. I tilfælde af en procedurefejl skal der testes en ny prøve fra den samme patient. 5. Kontamination af brønde, der indeholder negative patientprøver, med brønde, der indeholder positive patientprøver, eller patientprøver, kan opstå, hvis indholdet af en brønd flyder over i en anden brønd på grund af en klodset håndtering af mikropladen eller en dårlig pipetteringsteknik under tilsætningen af reagenser. 6. Resultaterne af Platelia Aspergillus IgG-testen blev ikke opnået på baggrund af prøver af serum eller plasma fra nyfødte børn eller pædiatriske. 7. Udførelsen af Platelia Aspergillus IgG-testen er ikke udviklet til manuel aflæsning og/eller visuel bestemmelse af resultaterne. 14 FORVENTEDE VÆRDIER Prævalensen af anti-aspergillus IgG, der blev målt ved hjælp af Platelia Aspergillus IgG-testen, blev evalueret ud fra et panel bestående af 129 prøver fra 64 franske med lidelsen cystisk fibrose, der udgjorde en risikogruppe for Aspergillus-infektioner. Af de 129 prøver var 53 positive og 12 inkonklusive, hvilket resulterer i en udbredelse på 53/129 = 41,1% [: 32,5-50,1%], når de inkonklusive resultater som negative, og 65/129 = 50,4 % [: 41,4-59,3 %], når de inkonklusive resultater som positive. Hvad ne angår, havde 29 ud af de 64 testede mindst én positiv prøve, og 5 havde mindst én inkonklusiv prøve og ingen positive, hvilket resulterer i en udbredelse på 29/64 = 45,3 % [: 32,8-58,3 %], når de inkonklusive resultater som negative, og 34/64 = 53,1 % [: 40,2-65,7 %], når de inkonklusive resultater som positive.

7 15 - FUNKTIONSEGENSKABER A. Undersøgelse af reproducerbarhed Gentagelsesnøjagtighed for intern analyse: Med henblik på at evaluere gentagelsesnøjagtigheden inden for analysen blev én negativ prøve og fem positive prøver testet 32 gange inden for en given serie. Titeren (AU/ml) blev bestemt for hver positiv prøve. Gennemsnittet af titerne, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (CV%) for hver prøve er anført i tabellen nedenfor: Gentagelsesnøjagtighed for intern analyse: Negativ Svagt positiv N=332 prøve prøve nr. 1 Gennemsnit Svagt positiv prøve nr. 2 Svagt positiv prøve nr. 3 Mellempositiv prøve Stærkt positiv prøve 2,44 9,31 10,31 13,64 31,69 43,10 (AU/ml) SD 0,067 0,320 0,218 0,387 0,939 1,546 CV % 2,7 % 3,4 % 2,1 % 2,8 % 3,0 % 3,6 % Krydskontrolleret nøjagtighed (reproducerbarhed): Med henblik på at evaluere gentagelsesnøjagtigheden for krydskontrolleret analyse gennemgik hver af de seks prøver (én negativ og fem positive) en dobbelttest med to serier om dagen over en samlet periode på 20 dage. Titeren (AU/ml) blev bestemt for hver positiv prøve. Den negative prøve udtrykkes som et forhold. Gennemsnittet af koncentrationerne eller forholdene, standardafvigelsen (SD) og variationskoefficienten (CV%) for hver prøve er anført i tabellen nedenfor: Krydskontrolleret nøjagtighed (reproducerbarhed) N=80 Gennemsnit (AU/ml) Negativ prøve Svagt positiv prøve nr. 1 Svagt positiv prøve nr. 2 Svagt positiv prøve nr. 3 Mellempositiv prøve Stærkt positiv prøve 1,88 3,60 6,99 12,34 32,49 51,65 SD 0,26 0,46 0,92 1,49 5,25 7,65 CV % 13,8 % 12,8 % 13,1 % 12,1 % 16,2 % 14,8 % B. Krydsreaktioner Patologi Antal testede prøver Antal positive prøver Anti-Candida-antistoffer 54 2* Anti-ds-DNA-antistoffer 10 0 ANA-positiv 10 0 Myeloma IgG 10 0 Toxoplasma OgG 10 0 Humane anti-mus-antistoffer 12 0 HIV 10 0 Rheumatoid-faktor 10 0 * De to sera, der testede positivt, blev bekræftet med et kommercielt sæt til påvisning af anti-aspergillus IgG-antistoffer. C. Linearitet Det lineære dynamiske område af Platelia Aspergillus IgG doseringen blev fastsat til mellem 2 og 80 UA/ml ud fra fortyndingsundersøgelser, der blev gennemført på 5 positive prøver. D. Kliniske studier Specifikationerne for Platelia Aspergillus IgG-sættets ydeevne blev evalueret på to undersøgelsessteder ud fra i alt 499 prøver fra 329. SENSITIVITET Sensitiviteten blev bestemt ud fra et panel bestående af 277 prøver fra 2 undersøgelsessteder i Frankrig fordelt på: 129 sera fra 64 med lidelsen cystisk fibrose, der udgjorde en højrisikogruppe for allergisk bronchopulmonal aspergillosis (ABPA) blev testet på undersøgelsessted sera fra 43 med alvorlig kronisk aspergillosis blev testet på undersøgelsessted 2.

8 Resultater fra undersøgelsessted 1 Tabellen nedenfor opsummerer resultaterne, der blev opnået på undersøgelsessted 1 for en population af med lidelsen cystisk fibrose, for hvilke ABPA-diagnosen blev foretaget på baggrund af kliniske data, med resultater opnået for total IgE, Aspergillus elektrosynerese, påvisning af Aspergillus-antigener og påvisning af anti-aspergillus IgG-antistoffer med en anden kommerciel EIA-test end Platelia Aspergillus IgG. Patienterne blev opdelt i 4 kategorier: Fravær af ABPA, tidligere ABPA, formodet ABPA og bekræftet ABPA9, 11. Fravær af ABPA udelukker imidlertid ikke en anden Aspergillus-patologi12. Patientens status ved anvendelse af Aspergillus-elektrosynerese eller Platelia Aspergillus IgG blev betragtet som positiv, når mindst én af patientens prøver testede positivt med den tilsvarende metode. Derimod blev status betragtet som inkonklusiv, hvis mindst én af patientens prøver testede inkonklusivt, og som negativ, hvis alle patientens prøver testede negativt. Patientkategorier 49 uden ABPA 5 med tidligere ABPA 4 med formodet ABPA 6 med bekræftet ABPA Resultater ved elektrosynerese Status Resultater ved PlateliaTM Aspergillus IgG Patientstatus Antal Positiv Inkonklusiv Negativ Negativ 40 7 (1) 4 (2) 29 som negative) 7/40 (17,5 %) [7,3-32,8 %] som positive) 11/40 (27,5 %) [14,6-43,9 %] 9/9 (100,0 %)* 5/5 (100,0 %)* Positiv /9 (88,9 %)* Negativ 5 5 (3) 0 0 5/5 (100,0 %)* Positiv Negativ 2 2 (4) 0 0 2/2 2/2 (100,0 %)* (100,0 %)* Positiv /2 2/2 (100,0 %) (100,0 %) Negativ 3 2 (5) 0 1 2/3 2/3 (66,7 %)* (66,7 %)* Positiv /3 3/3 (100,0 %)* (100,0 %)* 1): 57 % (4/7) af de positive resultater, der blev opnået med Platelia Aspergillus IgG, testede positivt med et andet markedsført EIA-sæt til påvisning af anti-aspergillus IgG. (2): 100 % (4/4) af de inkonklusive resultater, der blev opnået med Platelia Aspergillus IgG, testede negativt med et andet markedsført EIA-sæt til påvisning af anti-aspergillus IgG. (3): 100 % (5/5) af de positive resultater, der blev opnået med Platelia Aspergillus IgG, testede positivt med et andet markedsført EIA-sæt til påvisning af anti-aspergillus IgG. (4): 100 % (2/2) af de positive resultater, der blev opnået med Platelia Aspergillus IgG, testede positivt med et andet markedsført EIA-sæt til påvisning af anti-aspergillus IgG. (5): 100 % (2/2) af de positive resultater, der blev opnået med Platelia Aspergillus IgG, testede positivt med et andet markedsført EIA-sæt til påvisning af anti-aspergillus IgG. * : På grund af en utilstrækkelig prøvestørrelse kunne der ikke beregnes et 95 % konfidensinterval. Resultater fra undersøgelsessted 2 Tabellen nedenfor opsummerer resultaterne, der blev opnået med en prøvepopulation af med lidelsen alvorlig kronisk aspergillosis. Patienterne blev rekrutteret på baggrund af forenelig lungebilledfremstilling, ekspektorat positivt for Aspergillus og Aspergillus-positive serologiske test baseret på immunelektroforese (IEP).

9 Resultater ud fra prøven IEP-resultater Patientkategorier Alvorlig kronisk aspergillosis Status PlateliaTM Aspergillus IgG-resultater Patientstatus som negative) Antal Positiv Inkonklusiv Negativ Positiv Inkonklusiv Negativ ,3 % [90,8-99,0] 68,2 % [45,1-86,1] 35,3 % [14,2-61,7] som positive) 99,1 % [95,0-100] 86,4 % [65,1-97,1] 64,7 % [38,5-85,8] Resultater ud fra patienten Patientens status ved anvendelse af Aspergillus-immunelektroforese eller Platelia Aspergillus IgG blev betragtet som positiv, når mindst én af patientens prøver testede positivt med den tilsvarende metode. Derimod blev status betragtet som inkonklusiv, hvis mindst én af patientens prøver testede inkonklusivt, og som negativ, hvis alle patientens prøver testede negativt. Patientkategorier Alvorlig kronisk aspergillosis Resultater ved IEP Status Antal Resultater ved PlateliaTM Aspergillus IgG Patientstatus Positiv Inkonklusiv Negativ som som positive) negative) Positiv ,0 % [83,1-99,4] 97,5 % [86,8-99,00] Negativ ,3 %* 66,7 %* * : På grund af en utilstrækkelig prøvestørrelse kunne der ikke beregnes et 95 % konfidensinterval. SPECIFICITET Specificiteten blev bestemt ud fra et panel af 222 prøver fra 222, som var hospitalsindlagt på undersøgelsessted 1 (200 prøver) og undersøgelsessted 2 (22 prøver), og som ikke havde symptomer på en Aspergillus-infektion. Testet gruppe / sted Antal prøver Negativ Inkonklusiv Positiv Sted Sted Total Specificitet, der som negative) 99,5 % [97,2-100 % [84,6-99,6 % 95 % [97,5- Specificitet, der som positive) 100 % [98,2-100 % [84,6-100 % [98,3-16. PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialer til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og frigives kun til salg, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares hos virksomheden.

10 17. LITTERATURLISTE 1. Agarwal, R Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3): p Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A Aspergillus hypersensitivity and allergic bronchopulmonary aspergillosis in patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in North India. Mycoses Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis, M., Casimiro, C., Exposto, F Follow-up of anti-aspergillus IgG and IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical laboratory analysis 16: p Denning, D. W Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical microbiology and infection 7 (Suppl 2): p Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta, C Comparison of serum markers for allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone, P., Farina, C., Castelnuovo, P Paranasal sinus fungus ball: diagnosis and management. Mycoses 50: p Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M., Latgé, J.P Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic microbiology and infectious disease 55: p Schubert, M. S Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis and management. Medical Mycology p Shah, A Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders. Indian journal of Chest disease and allied sciences 50: p Shah, R., Vaidesswar, P., Pandit, S. P Pathlogy of pulmonary aspergillomas. Indian journal of pathology and microbiology 51 (3): p Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M Diagnosing allergic bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic fibrosis, Paediatric Respiratory Reviews 10: p Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy 60: p Virnig, C., Bush, R. K Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US perspective. Current opinion in Pulmonary Medicine 13: p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) Fax: +33 (0) /2009