Kapitel 1 Genteknologi (1/6)

Kapitel 1 Genteknologi (1/6) Transformation FOTO: SØREN LUNDBERG FORMÅL At isolere plasmider fra plasmidbærende bakterier og overføre dem til andre bakterier. TEORI Transformation er den teknik, hvor generne optages gennem cellemembranen og efterfølgende udtrykkes i cellen. I dette eksperiment er det en bakterie, der optager fremmed DNA gennem cellemembranen, hvilket resulterer i syntese af proteiner. Det er lettest at overføre et plasmid, et cirkulært DNA-molekyle med nogle få gener, fra en bakterie til en anden. Først skal plasmidet isoleres fra en bakteriepopulation og siden indføres i en anden bakterie. Isolation af plasmider sker ved først at ødelægge cellemembranerne med sæbe og fjerne de store cellefragmenter ved centrifugering. De store fragmenter er cellevæg, proteiner (enzymer og cytoskelet) og membraner. Der tilsættes protease, der nedbryder proteiner og RNAse, der nedbryder RNA. Ved at hæve og bagefter sænke ph denaturerer proteinerne, hvorefter de danner bundfald, der kan centrifugeres fra. Plasmiderne skal også skilles fra de mindre fragmenter som RNA, kromosomalt DNA og opløste stoffer. Det gøres i en mikrosøjle, der er et lille rør med et finkornet materiale, der binder DNA, men lader andre opløste stoffer passere. For at forbedre renheden af plasmiderne vaskes søjlen to gange med en væske, der ikke kan frigøre plasmiderne. Plasmiderne, som er isolerede i søjlematerialet, kan frigøres med vand. Eksperimentet kan stoppes her. Hvis plasmiderne skal gemmes til næste øvelsesgang, bruges TE-buffer, der virker konserverende. De isolerede plasmider skal overføres til andre bakterier. Bakterier kan optage plasmider, når tre forhold er opfyldt: Cellerne er i vækst. Cellerne skal befinde sig i en opløsning af divalente metalioner. Cellerne skal udsættes for et chok. I dette eksperiment anvendes bakterier, der har vokset en dag på en agarplade og er kølet ned til 0 C. Bakterierne udsættes for calciumioner og en temperaturstigning fra 0 C til 42 C i 90 sekunder, hvorefter de køles ned igen. Ved at anvende et plasmid,

Kapitel 1 Genteknologi (2/6) der gør bakterierne resistente over for et bestemt antibiotikum, kan man se, om transformationen er lykkedes. Bakterier, som har optaget plasmidet, kan overleve på agarplader med det pågældende antibiotikum. Der skal udføres kontrolforsøg, som tjekker, at der er arbejdet sterilt, at temperaturchokket ikke slår alle bakterierne ihjel, og at antibiotikaet kan slå bakterier uden plasmidet ihjel. I eksperimentet benyttes disse opløsninger: Celleresuspensionsopløsning (50 mm TRIS, 10 mm EDTA, 100 mg/ml RNase A, ph = 7,5). TRIS er en buffer, der fastholder ph omkring RNasens ph-optimum. EDTA kompleksbinder magnesiumioner, der er nødvendige for, at DNaser kan fungere; EDTA beskytter således DNA et. RNasen fordøjer RNA, der ellers også godt kunne binde til søjlematerialet. Cellelyseringsopløsning (0,2 M NaOH, 1 % SDS). SDS ( sodiumdodecylsulfate ) er et sæbestof, der opløser cellemembraner. Basen denaturerer proteiner. Alkalisk protease. Enzym, der spalter proteiner til peptider, når ph er høj. Neutralisationsopløsning (4,09 M guanidinhydrochlorid, 2,12 M ethansyre, 0,759 M kaliumethanoat, ph = 4,2). En buffer, der neutraliserer natriumhydroxiden fra cellelyseringsopløsningen. Vaskebuffer (60 % ethanol, 60 mm kaliumethanoat, 10 mm TRIS, 2,5 mm EDTA, ph = 7,5) Den høje koncentration af ethanol forhindrer bufferen i at frigøre plasmiderne. EDTA skal stadig beskytte DNA et. TE-buffer (10 mm TRIS, 1 mm EDTA, ph = 8,0). Bufferen kan, især hvis den er 65 C varm, frigøre DNA et fra søjlematerialet. 50 mm CaCl 2, steril. Calciumioner letter bakteriers optagelse af plasmider. LB/kødpepton medium (1 % pepton, 0,5 % gærekstrakt, 1% NaCl) fungerer som næring. Pepton er delvist enzym-fordøjet protein fra kød, der fungerer som næring. Gærekstrakt indeholder vitaminer. Natriumchlorid giver passende osmotiske forhold. LB agarplader (LB-medium med 2 % agar), steril. Agar er et stivelsesstof, der udvindes af alger. Det har kun konsistensgivende funktion. HYPOTESE Udarbejd en hypotese over forsøgets udfald. For at kunne formulere en præcis hypotese, skal du overveje, hvordan resultatet aflæses.

Kapitel 1 Genteknologi (3/6) MATERIALER Kitler Underlag/dækpapir Affaldsstativer med autoklaveposer Del 1 isolering Eppendorfrør Centrifuge Petriskål Mikropipetter med spidser Filtrerpapir Mikrosøjler (Wizard Plus SV Minipreps fra Promega) Celleresuspensionsopløsning (50 mm TRIS, 10 mm EDTA, 100 mg/µl RNase A, ph = 7,5) Cellelyseringsopløsning (0,2 M NaOH, 1 % SDS) Alkalisk protease Neutralisationsopløsning (4,09 M guanidinhydrochlorid, 2,12 M ethansyre, 0,759 M kaliumethanoat, ph = 4,2) Vaskebuffer (60 % ethanol, 60 mm kaliumethanoat, 10 mm TRIS, 2,5 mm EDTA, ph = 7,5) TE-buffer (10 mm TRIS, 1 mm EDTA, ph = 8,0) Udvokset kultur af Escherichia coli MC 1000 med puc18. Del 2 transformation Sterile eppendorfrør Mikropipetter med pipettespidser Podenåle Drigalskispateler Isbad Holder til eppendorfrør 42 C-termostatbad Spritpen Stopur Spritbrænder 50 mm CaCl 2, steril LB/kødpepton medium (1 % pepton, 0,5 % gærekstrakt, 1% NaCl), steril LB/kødpepton agarplader (LB-medium med 2 % agar), steril LB agarplader med 0,1 ppm ampicillin Ethanol 1-2 dage gammel udstrygningskultur af E. coli MC 1000 puc18 plasmid (enten oprenset fra del 1 eller købt)

Kapitel 1 Genteknologi (4/6) SIKKERHED Dæk arbejdspladsen med dækpapir/underlag, som kan sprittes af. Under arbejde med genetisk modificerede organismer arbejdes under skærpede laboratoriebetingelser. Se side 37. METODE Del 1: Isolering af plasmider Høst bakterier Overfør 1,5 ml bakteriekultur (E. coli med puc18) til et eppendorfrør mærket med holdets navn. Når alle hold er klar, centrifugeres opløsningen i 2 minutter ved 10.000 rpm. Eppendorfrørene skal placeres symmetrisk i centrifugen. Husk pladsnumrene! Hæld supernatanten (væsken over bundfaldet) væk i autoklaveposen. Gentag høsten to gange i det samme rør, så der i alt er høstet 4,5 ml bakteriekultur. Tør pellet (bundfaldet) ved at banke eppendorfrøret med mundingen nedad på et filtrerpapir i en petriskål. Både filtrerpapiret og petriskålen lægges til sterilisering i autoklaveposen. Resuspender Tilsæt 250 µl celleresuspensionsopløsning til eppendorfrøret. Resuspender cellerne ved gentagne gange at suge væske op i pipettespidsen og spule det ud direkte mod pellet. Undgå at få for store stykker løsrevet pellet op i pipetten, da det kan stoppe spidsen til. Frigør plasmider Tilsæt 250 µl cellelyseringsopløsning til eppendorfrøret, luk det og vend det fire gange. Undgå at ryste eppendorfrøret for at det kromosomale DNA ikke går i stykker, så det opsamles sammen med plasmidet. Tilsæt 10 µl alkalisk protease og bland opløsningen ved at vende eppendorfrøret fire gange. Lad proteasen virke i 5 minutter. Opløsningen skal nu blive mere klar og tyktflydende. Tilsæt 350 µl neutralisationsopløsning og vend eppendorfrøret nogle gange. Der dannes nu et tykt bundfald af protein og andre cellerester. Centrifuger eppendorfrøret 10 minutter ved 13.000 rpm. Mikrosøjlen Sæt mikrosøjlen i opsamlingsrøret. Overfør ca. 750 µl supernatant til mikrosøjlen, det er det inderste rør, mens det yderste rør kaldes opsamlingsrøret. Pas på hverken at få pellet eller hinden, der ligger øverst, med. Læg det brugte eppendorfrør i autoklaveposen. Centrifuger mikrosøjlen i 1 minut ved 13.000 rpm. Smid den væske, der nu findes i opsamlingsrøret, i autoklaveposen. Vask søjlen Tilsæt 750 ml vaskebuffer til mikrosøjlen og sæt den i opsamlingsrøret igen. Centrifuger mikrosøjlen i 1 minut ved 13.000 rpm. Smid den væske, der nu findes i opsamlingsrøret, i autoklaveposen.

Kapitel 1 Genteknologi (5/6) Tilsæt 250 ml vaskebuffer til mikrosøjlen og sæt den i opsamlingsrøret igen. Centrifuger mikrosøjlen i 2 minutter ved 13.000 rpm. Smid opsamlingsrøret med væske i autoklaveposen. Udvind plasmid Overfør søjlen til et nyt eppendorfrør. Klip låget af eppendorfrøret. Tilsæt 100 µl nucleasefrit vand eller varm (65 ºC) TE-buffer til søjlen og vent 1 minut. Centrifuger eppendorfrøret med søjlen ved 13.000 rpm i 1 minut. Smid mikrosøjlen i autoklaveposen. Væsken i eppendorfrøret indeholder nu ca. 5 µg plasmid opløst i vand eller TE-buffer. Del 2: Transformation Forarbejde Placer tre sterile eppendorfrør i et isbad. Mærk de tre rør henholdsvis +, - og 0. Tilsæt 250 µl steril calciumchloridopløsning til alle rør. Overfør bakterier Steriliser en podenål og en dissektionsnål ved at gløde dem i en ethanolflamme. Dyp en steril podenål i røret markeret 0 og steriliser igen. Tag et par bakteriekolonier med den sterile podenål og brug begge nåle til at overføre kolonierne til rørene markeret + og -. Undgå at få agar med, da det hæmmer transformationen. Resuspender cellerne ved forsigtigt at suge dem op og sprøjte dem ud med pipetten en halv snes gange for at sikre, at cellerne ikke klumper. Sug også op og spul ud i røret markeret 0. Tilsæt plasmider Tilsæt 10 ml plasmidopløsning til røret mærket +. Vær omhyggelig med at få den lille mængde blandet godt i væsken. Luk rørene, sæt dem tilbage i isbadet og lad dem alle stå i 15 minutter. Tag fire LB plader og mærk dem i bunden med henholdsvis: -amp, +plasmid -amp, sterilkontrol +amp, +plasmid +amp, -plasmid Varmechock Giv cellerne et varmechock ved at overføre alle eppendorfrør direkte fra isbadet til et 42 C vandbad i præcis 90 sekunder. Varmechocket gør, at plasmiderne optages. Derefter føres de direkte tilbage til isbadet i 2 minutter. Dyrk bakterierne Tilsæt 250 µl LB-medium til hvert rør og sæt rørene ved stuetemperatur i 3 minutter. Bland indholdet forsigtigt et par gange ved at vende rørene op og ned.

Kapitel 1 Genteknologi (6/6) Overfør 100 µl fra + -røret til hver af de to plader, der er mærket +-plasmid, 100 µl fra - -røret til pladen, der er mærket -plasmid og 100 µl fra 0 -røret til sterilkontrolpladen. Benyt ny pipettespids til hvert eppendorfrør. Udstryg alle fire plader med en steril drigalskispatel. Steriliser drigalskispatelen i ethanolflamme mellem hver udstrygning. Steriliser drigalskispatlen og podenålene en gang til. Pladerne anbringes med bunden i vejret i varmeskab ved 37 C. Ryd op Alt laboratoriegrej, der har eller måske har været i kontakt med bakterier og plasmider kommes i autoklaveposer og autoklaveres. Det gælder fx også engangskitler og dækpapir, men ikke sterile nåle og spatler. Sprit underlaget af. RESULTATER Efter to døgn tælles antal kolonier på alle fire plader. DISKUSSION Hvorfor er vores fremgangsmåde sikkerhedsmæssigt i orden? Hvilken ph forventes der i eppendorfrøret, efter vi har tilsat henholdsvis celleresuspensionsopløsning, cellelyseringsopløsning og neutralisationsopløsning? Analyser og forklar resultaterne for hver plade. Inddrag fejlkilderne. KONKLUSION Hvad kan du konkludere ud fra resultaterne? Er hypotesen eftervist? KILDER Lav en liste over alle anvendte kilder som fx bøger, artikler og internetkilder. Anfør fuldstændig reference som forlag, udgivelsesår og URL-adresse.