www.volvoxdk.dk C. Girnth-Diamba og B. Fahnøe, 2010 Claudia Girnth-Diamba og Bjørn Fahnøe Solrød Gymnasium, Solrød Center 2 DK 2680 Solrød Strand, Denmark E: sgcg@solgym.dk og sgbf@solgym.dk Plasmidoprensning med kogemetode Oprensning af plasmid DNA med kogemetode for brug til transformation og restriktionsanalyse Formål Forsøget går ud på at oprense plasmider fra en bakteriekultur til brug for trasnformation, eletroforese eller restriktionsanalyse Indledning Dette er en almindelig brugt metode til at oprense plasmider fra en bakteriekultur. Forsøget benytter sig af fraktioneret fældning hvor man først slår cellerne i stykker ved at tilsætte bl.a. sæbe og enzym. Så gør man de øvrige cellekomponenter uopløselige ved at kogning, og derefter bundfælder dem vha. centrifugering. Tilbage har man så plasmid DNA, salte og sæbe i supernatanten. Denne opløsning kan godt bruges til transformation. For at få en renere plasmid DNA opløsning kan man indrage en ekstra oprensning (Ekstra oprensingstrin). Ved hjælp af alkoholer gøres plasmid DNA uopløselig og de uønskede dele, sæbe og salt kan fjernes efter man har bundfældet plasmid DNA ved centrifugering. Supernatanten vil nu indeholde det vi øsker at fjerne. Plasmid DNA vil nu være meget rent og er velegnet til f.eks. restriktionsanalyse Plasmider på max. 10.000 basepar = 10 kb (bedst med mindre størrelse) kan nemt oprenses med denne simple måde. Den er både hurtig og billig. Forsøget vil altså almindeligvis gå ud på at udvinde plasmid DNA, påvise det ved gelelektroforese og bruge det til en hurtig transformation af E.coli K 12. Følgende plasmider er egnede til kogemetoden: puc 18 (2,7 kb), pbr 322 (4,4 kb), pbr 325 (5,9 kb), YEp 24 (8 kb), YRp 17 (7 kb), pc 508 (7,3 kb), ptz 19R-H(A16-M) (2,9 kb), pb1-l-mh(a16-m) (7,9 kb). Alle disse plasmider er godkendt til brug i gymnasiet. Figur 1: Ved kogemetoden fjernes slimede klat med cellerester med en træpind opdateret d. 17.02.10
Materialer Materialer til 1 plasmidoprensning Husk at krydse af inden I starter så man sikrer sig at alle materialer er klar Almene materialer til mikrobiologi Kogeplade med bægerglas eller gryde med kogende vand bruges til 100 C vandbad Centrifuge til mindst 10.000 rpm og rotor til mikrocentrifugerør (1,5 ml) En rulle dækpapir med vandafvisende lag Mikropipetter fra 10 200 µl, samt passende spidser Mikrocentrifugerør, størrelse 1,5 ml (brug eventuelt forskellige farver, hvis du arbejder med forskellige slags plasmider så undgås forbytninger) Sterile podenåle eller podepinde Sterile podepinde af træ indpakket i stanniol eller i reagensglas til at fiske snotklat op med (SKAL være sterile) Isbad brug eventuel termokrus med nogle isterninger i, max ½ fuld, som dækkes med lidt vand (2 styks per bord) Holder til mikrocentrifugerør, lavet af udklippede styroporbakker (bakker til frugt og grønt i supermarkeder) størrelsen skal tilpasses til termokrus og skal kunne flyde på isvand og i kogende vandbad Sakse Affaldsbeholder med stegepose til autoklavering. Alkohol og papirservietter til rengøring Malertape og spritpen Kitler, som kan koges Materialer specifikt til øvelsen En gensplejset E.coli stamme på petriskåle med næringsmedie indeholdende ampicillin (LB + amp). Stammen skal indeholde små plasmider. STET buffer 1 ml i mikrocentrifugerør (der bruges 0,2 ml per én oprensning) skal være på is! Lysozymopløsning ca. 0,1 ml i mikrocentrifugerør skal laves samme dag (der bruges 10 mikroliter per én oprensning) skal opbevares på is! En sikkerhedsnål eller lignende bruges til at prikke hul i mikrocentrifugerørets låg, så dampen ved kogningen kan slippe ud, mens væsken forbliver i røret Fremgangsmåde - forberedelser 4 uger før forsøget Biologilæreren anmelder forsøget ved at udfylde Undervisningsministeriets indberetningsske-ma, som læreren underskriver og rektor forsyner med skolens stempel og sin underskrift. Anmeldelsen sendes til Undervisningsministeriet, som derefter giver Arbejdstilsynet besked (AT har ifølge loven kontrol med all gensplejsning i DK). Forberedelser senest 2 uger før forsøget E.coli stammer indeholdende plasmid DNA bestilles hos BIONEER. De opbevares bedst i køleskab indtil brug (Figur 2). Køleskabet må KUN bruges til kemikalier og skal være placeret i et aflåst rum. På døren skal der stå gensplejsning kun autoriserede personer har adgang. 3 døgn før forsøget Figur 2 Der forberedes LB amp plader, dvs. plader med agar og næringsmediet LB, hvor der tilsættes 0,5 ml ampicillin stamopløsning(25 mg/ml) per 100 ml. Husk først at tilsætte ampicillin når temperaturen er 50 C 2 døgn før forsøget E.coli stammen med plasmid fra BIONEER Figur 3 udstryges på LB amp plader. Husk at skrive stammens identifikation på pladens låg og luk pladen med to strimler malertape på hver sin side (Figur 3). 2
Afmål 1 ml STET buffer og overfør den i mikrocentrifugerør, mærket S (1 rør per gruppe, 1 ml rækker til 4 oprensninger). Sæt disse rør i køleskabet. Afvej lysozym i et mikrocentrifugerør (mindste mål 25 mg, bruges til 5 ml STET buffer) og opbevar det i køleskabet. Gør mikrocentrifugerør klar til afmålte mængder lysozym-opløsning, mærkes L. Hvis der skal laves de ekstra oprensningstrin 22-34, skal der sørges for 0,05 ml natriumacetatopløsning (2,5M), 0,5 ml isobutanol og mindst 1 ml 70% ren ethanol per plasmidpræparation. Forberedelser på forsøgsdagen inden forsøgets start Hent det afvejede lysozym og tilsæt 5 ml STET-buffer. Ryst indtil enzymet er opløst. Derefter afmåles 0,1 ml og overføres i de forberedte mikrocentrifugerør, mærket L. Fremgangsmåde på forsøgsdagen Klargøring af lokalet laves af læreren og eleverne i grupperne 1. Sæt borde sammen til grupper à 4 personer og dæk bordet med papir, som er sugende på oversiden og vandtæt på undersiden. Sæt papiret fast med tape. De overtallige borde og stole sættes udenfor i et hjørne. Der må ikke være overflødige ting i lokalet, og der skal være god plads, så man mindsker risikoen for at falde og støde ind i hinanden (Figur 4). Eleverne skal efterlade tøj og tasker udenfor lokalet. 2. 3. 4. Hent centrifugen og kogepladerne og læg ligeledes et stykke dækpapir under. Sæt en affaldsbeholder i midten af gruppens bord. Find de øvrige materialer frem og læg dem på gruppens bord. Figur 4 3
5. Klargør isbade og klip passende styroporholdere ud (f.eks.1 isbad til opløsningerne S og L, samt 1 isbad til plasmidprøverne)(figur 5). 6. 7. Hent STET-bufferen ( S ) og sæt den i holderen i det ene isbad. Hent Lysozym-opløsningen ( L ) og sæt den i samme isbad som S. Figur 5 8. Fyld en gryde ¾ del med vand, sæt den på en kogepladen og tænd for pladen. Husk at skrue lidt ned når det koger. Bakterier høstes og cellerne brækkes op (det hedder lysering ) 9. Tag laboratoriekittel på husk: der arbejdes nu under særlige sikkerhedsregler (Se bilag om sikkerhed). Inte affald må hældes ud i miljøet Husk at vaske hænder hyppigt Vær opmærksom på de særlige sikkerhedsregler 10. Tag et mikrocentrifugerør (1 rør per oprensning), mærk det med gruppens ID. Tilsæt 200 µl STET-buffer S, luk låget og sæt det i isbad (Figur 5). 11. Fra en agarplade med gensplejsede E.coli bakterier skrabes to store klumper af med en steril podenål størrelsen ca et halvt tændstikshoved (Figur 6). Pas på ikke at knække podenålen, og pas på ikke at stikke den ned i agaren. Figur 6 12. Overfør klumperne til røret med den afmålte STET-buffer. 4
13. Brug i første omgang podenålen til at røre rundt. Fordel bakterierne yderligere ved at suge dem talrige gange op og pust ud med en pasteurpipette med gummibold eller en mikropipette (Figur 7). Vær forsigtigt og sug IKKE FOR MEGET OP ellers bliver bakterieklumper hængende for højt oppe i pipetten. Figur 7 14. Tilsæt 10 µl iskold lysozym-opløsning. Luk låget og prik hul i mikrocentrifugerørets låg med en sikkerhedsnål. Celledele gøres uopløselige ved at koge dem. Plasmid DNA vil stadig være opløst 15. Vend røret 2-3 gange så indholdet blandes, sæt røret i styroporholderen og placer røret med holderen i det kogende vandbad. OBS: holderen med røret skal flyde på vandet det må ikke vælte (Figur 8). 16. Røret med indhold koges i 90 sekunder i det kogende vandbad og stilles derefter i isbad mens man venter på centrifugering. Figur 8 Bakteriecellernes indhold adskilles i tunge, uopløseige dele (cellevæg-ge, protein, kromosom DNA m.m.) og en opløselig del, som indeholder plasmid DNA. De uopløselige dele centrifugeres ned og bundfaldet fjernes 17. Centrifuger i 15 minutter ved mindst 10.000 omdrejninger per minut (rpm)(figur 9). Figur 9 5
18. Bundfaldet (pellet), der ses som en fnugget hvid klump (Figur 10), fiskes op med en steril træpind, og smides i affaldsbeholderen til senere autoklavering. Hvis bundfaldet er fast og hårdt, er forsøget ikke lykkedes, - sandsynligvis fordi cellerne ikke er ordentligt resuspenderede. Bundfaldet skal have en slimet konsistens som en snotklat. Figur 10 19. Supernatanten (væsken, som indeholder opløst plasmid DNA) sættes i køleskab. Hvis plasmiderne skal bruges til transformation, bør de fortyndes 10 gange i TE-buffer af hensyn til sæbeindholdet i STET-bufferen. Ekstra oprensningstrin Materialer til ekstra oprensningstrin 0,1 ml 2,5 M natriumacetat (ph 5,6) der bruges 40 µl per oprensning Isopropanol (2 propanol, analysekvalitet), ca.½ milliliter per oprensning 70% ethanol (finsprit), 1 ml per oprensning Sterilt filtrerpapir Fremgangsmåde for ekstra oprensningstrin Plasmid DNA gøres uopløselig ved at tilsætte alkohol og natriumacetat, medens sæbe og salte bliver i opløsningen 20. Tilsæt 40 µl 2,5M natriumacetat ph 5,6 og 420 µl isopropanol til supernatanten og luk låget. Bland rørets indhold ved at vende det rundt et par gange. 21. Lad det stå i 5 min ved stuetemperatur. Der burde komme hvide fnug i væsken det er udfældet plasmid DNA, som ikke kan opløses i 6
syre og alkohol.. 22. Bundfæld plasmid DNA ved at centrifugere i 10 min ved 12.000 rpm. 23. Hæld væsken (= supernatanten) forsigtigt fra og tør pellet ved at fjerne den overskydende væske ved at stille mikrocentrifugerøret med åbningen nedad på et stykke sterilt filtrerpapir (Figur 11). Pellet er ikke ret stor, den kan ses som en lys plet lidt oppe af siden vær derfor forsigtigt. Figur 11 24. Tilsæt 1 ml 70% ethanol (finspritkvalitet), luk låget og vend røret et par gange. Det bruges til at fjerne syren og isopronalolen. 25. Centrifuger røret i 3 min ved 12.000 rpm eller 5 min ved 10.000 rpm. 26. Se efter, om der kommer bundfald ellers centrifuger lidt længere. 27. Hæld forsigtigt supernatanten (ethanol) fra og læg røret med åbent låg på et sterilt filtrerpapir indtil all væske er fordampet. 28. Resuspender bundfaldet i 50 µl TE buffer (ph 8,0, steril) og opbevar røret i fryseren indtil du skal bruge det til enten restriktionsanalyse eller transformation Oprydning og sikker destruktion af affald Affaldsposerne overføres til en stegepose, som lukkes og sættes ned i autoklaven, hvor det skal opvarmes i 15 min ved 120 grader. Dækpapir foldes sammen og sendes til forbrænding i lukket sort sæk. 7
Kitlerne samles sammen og vaskes som kogevask. Resultater og bearbejdning Man kan gennemføre en gelelektroforese for at få en idé om hvor meget plasmid DNA man har fået i udbytte. Figur 12 viser et eksempel fra et forsøg lavet af elever fra Solrød Gymnasium. Figur 11 Geleelektroforese af plasmid DNA, uklippet og klippet. Gelen er med Ethiduimbromid og båndene synliggøres ved UV-lys. 8
Pædagogiske tips Diskussionsspørgsmål Hvorfor skal du altid arbejde sterilt? Hvilke sikkerhedsrisici er der for dig ved dette forsøg? Hvilke sikkerhedsrisici er der for miljøet? Hvordan kan du undgå sikkerhedsproblemerne? Hvorfor skal affaldet autoklaveres? Forklar dine iagttagelser undervejs, hvad sker der og hvorfor sker det. Hvilke fejlkilder kan du finde? Her må du eventuel sammenligne dine resultater med klassens. Sammenlign punkterne 1-18 med tegningen i bilaget. Hvilke punkter hører til under de viste billeder? Ideer til ændringer i fremgangsmåden Lave en overnatskultur i flydende LB med ampicillin. Den kan laves i en kolbe til fælles brug eller i et mikrocentrifugerør til til hver gruppe. Forberedelse og tidsforbrug Forberedelserne kræver mellem ½ til 1 time hver gang. Læreren kan lade eleverne selv deltage i nogle af dem af pædagogiske grunde: Deltagelse i udfyldning af UVM s indberetningsskema kan gøre eleverne bevidste om lovgivningen for brugen af GMO. Starte overnatskultur Fremstille plader med ampicillin Praktiske tips Bemærkninger til sikkerhed Forsøgene må kun udføres, når den ansvarlige lærer har en uddannelse i biologi og har gennemgået det kompetencegivende kursus på 2 dage. Håndtering af affald Se under forsøget Mulige fejlkilder Eleverne skal være godt instrueret i sterilteknik. Problemer med sterilitet viser sig ofte som vækst af andre bakteriekolonier. Især de gule stafylokokker optræder hyppigt, da de findes naturligt på huden og slimhinder. Sådanne forurenede plader må ikke åbnes. LB plader med ampicillin er lysfølsomme og skal derfor opbevares i mørke, f.eks. pakket i stanniol. I stuetemperatur kan de højst holde sig i 1 uge. LB plader uden ampicillin kan holde sig i ca. 4 uger, dog sker der en udtørring, som kan hæmme væksten på gamle plader. Opløst ampicillin i vand kan kun opbevares 1 uge i køleskab. Det er varmefølsomt og må først tilsættes flydende LB agar, når temperaturen er under 50 C. Indkøb og leverandører Bakterier må kun købes fra godkendte steder. En af dem er Bioneer, adressen og bestillingslisten se www.volvoxdk.dk. Oprenset plasmid DNA skal opbevares i køleskab. Købte plasmider kan holde sig i årevis, mens selvoprensede plasmider har en begrænset levetid alt efter oprensningsmetoden, fordi der altid er spor af dnaser tilstede, som efterhånden nedbryder DNA også i køleskab. Ved længere opbevaring kan man sætte dem i fryser. Men gentagen optøning ødelægger også DNA. Indkøb og leverandører Se siden med links på: http://www.volvoxdk.dk/index.php/genteknologi/ links Opbevaring af materialer Bakterierne må kun opbevares på skolen i aflåst rum og i den til UVM udmeldte forsøgsperiode. Sterile væsker som calciumchloridopløsning og flydende LB kan opbevares ubegrænset eller indtil der opstår bundfald eller synlig klumpning grundet vækst af bakterier eller mug. Ampicillin stamopløsning kan kun opbevares i køleskab og i mørke i 1 uge. Man kan afveje 40 mygram i et 1,5 ml eppendorfrør og opbevare det i køleskabet i nogle år og tilsætter først sterilt vand, når amp-opløsningen skal bruges. LB plader og LB+amp plader pakkes i stanniol og opbevares i max 1 uge ved stuetemperatur. Forurenede plader kasseres. Andre kilder til information Ideer til litteratur til undervisningsbrug findes på www.volvoxdk.dk. Vigtig litteratur Hæftet Tjek på Biotek, produceret af Københavns Universitet, Det Biovidenskabelige Fakultet, indeholder i kapitel 10 og 11 noget om lovgivning og sikkerhedregler. Tak til Tak til Foreningen ECB5 for økonomisk støtte til udformning af vejledninger til gentek kurser og oprettelse af en webside. Tak til Ulrik Fahnøe, for at hjælpe med tilpasningen af forsøget fra en protokal fra universitetet. Tak til kursister på de kompetencegivende gentekkurser for at stille alle de vigtige spørgsmål. Tak til eleverne, som har hjulpet med til at gøre vejledningen læsevenlig. 9