Leuko64 Analyse til detektering af akut systemisk inflammatorisk respons i Produktinformation h LK-064-75 (75 tests) ; LK-064-250 (250 tests) V Til in vitro-diagnostik SAMMENDRAG OG PRINCIP Neutrofil CD64-ekspression forøges hurtigt både in vitro og in vivo indenfor få timer af inflammationsmediatorer så som interferon-gamma og G-CSF (1-3). Den samme ændring kan ses som respons på dokumenteret infektion eller vævsskade og indikerer derved, at målingen af neutrofil CD64- ekspression korrelerer med tilstedeværelsen af sådanne tilstande i mennesker (4-14). Leuko64 TM -analysen bruger en blanding af tre monoklonale antistoffer med specificiteter for CD64 (klonerne 22 og 32.2) og CD163 (klon Mac2-158). Brugen af to antistoffer mod forskellige epitoper på CD64 forøger analysens signal-støjforhold og er en mekanisme til at minimere variationerne fra et parti til et andet i reagensets fluorescenssignal. Tilsætning af det monoklonale antistof mod CD163, som er et monocytspecifikt antigen, forøger specificiteten af identifikation af underpopulationen af leukocytter, og gør det derved lettere for Leuko64 TM QuantiCALC softwarens algoritme at finde klynger og åbne mulighed for identifikation af interne populationer af positive og negative kontroller. Brugen af automatiseret software eliminerer den variation, som er indbygget i standard subjektiv flowcytometrisk analyse i listemodus. Brugen af en suspension af fluorescerende perler til standardisering af cellulær CD64-kvantificering gjorde det muligt at spore NISTstandardreferencemateriale SRM 1932 (RM 8640), og det giver en mekanisme til at minimere forskellene fra et parti til et andet i Leuko64 TM - analysesæt. Resultaterne af Leuko64 TM -analysen er rapporteret som et PMN CD64-indeks som den diagnostiske parameter sammen med indekserne for monocyt-cd64 og CD163. APPLIKATION LK-064-75- og LK-064-250-versionerne af Leuko64 TM -analysesættet er specielt beregnet til brug med følgende flowcytometre: Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios, BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur og BD Biosciences Cantos.
TILSIGTET BRUG Trillium Diagnostics Leuko64 TM -analysesættet er beregnet til brug til måling af neutrofil leukocyt-cd64-ekspression og er beregnet til brug sammen med andre laboratoriefund og kliniske vurderinger som en hjælp til in vitro-diagnosticering af den akutte systemiske inflammatoriske respons på vævsskade, såsom ved vævsbeskadigelse, infektion eller sepsis. Trillium Leuko64 TM er udelukkende beregnet til in vitro-diagnostisk brug af uddannet, kvalificeret personale. SÆTTETS KOMPONENTER Blanding af murine monoklonale antistoffer (indeholder bufret Reagens A saltvandsopløsning med 0,5 % renset bovin serum albumin (BSA) og 0,01 % natriumazid). 10X koncentrat af Trillium-lyseringsopløsning (indeholder Reagens B ammoniumchlorid) Suspension af polystyrenperler på 5-6 µm mærket med StarFire Reagens C Red TM og fluoresceinisothiocyanat (FITC) (indeholder <0,1 % natriumazid og 0,01 % Tween 20). Bruges til at analysere flowcytometriske filer i listemodus og Leuko64 TM beregne CD64-indekser på leukocytter. Den vedlagte Software CDindeholder også læreprogrammer til brugerundervisning og optimal brug af Leuko64 TM -analysesættet. NØDVENDIGE REAGENSER og MATERIALER, SOM IKKE ER INKLUDERET Destilleret vand 12x75 polystyrenrør til engangsbrug Flowcytometer Mikropipette(r), som kan dispensere 5 µl, 50 µl og 1 ml Vortex Mixer Computer til analyse af filer i listemodus PRØVE Leuko64 TM -analysen bruger kun 50 µl antikoaguleret fuldblod. EDTA, heparin, natriumcitrat eller ACD er alle antikoagulanter, som er forenelige med dette testsystem. Blodprøver er acceptable i op til 8 timer, når de opbevares ved stuetemperatur (18-22 C), eller i 48 timer, hvis de kommer i køleskabet (2-8 C). PRÆPARATION AF PRØVE 1. Fortynd 10X Trillium-lyseringsopløsningen (reagens B) 1:10 ved at blande 1 del koncentreret reagens B med 9 dele filtreret destilleret vand. Denne opløsnings endelige ph bør være 7,40 + 0,05. Lav opløsning nok til det forventede antal tests (der skal bruges 1,0 ml til hver prøve). Fortyndet eller 1X Trilliumlyseringsopløsning er stabil i 1 uge ved stuetemperatur (20-26 C) eller 30 dage i køleskabet (2-8 C). 2. Fortyndet Trillium-lyseringsopløsning skal være mellem 20 C og 37 C, når den bruges. Hvis opløsningen er kold, kan det resultere i dårlig lysering og suboptimale analyseforhold. 3. Mærk et 12 x 75 mm polystyrenrør til hver prøve, der skal analyseres. 4. Pipettér 50 µl Leuko64 TM -reagens A i alle mærkede rør. LK64-V11-2013 A4 EN Side 2 af 9
5. Pipettér 50 µl af den godt blandede antikoagulerede blodprøve med <25 x 10 9 celler/l af hvide blodlegemer (fortyndes efter behov) over i det tilsvarende rør, som indeholder reagens A. Bland forsigtigt eller benyt Vortex mixer, og inkubér i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur (18-22 C). 6. Tilsæt 1 ml 1X Trillium-lyseringsopløsning (fortyndet reagens B) til hvert rør, og bland det grundigt på Vortex mixer. Inkubér i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur. Periodisk blanding på Vortex mixer forbedrer lysering. 7. Tilsæt 5 µl Leuko64 TM -perler (reagens C) til hvert rør, bland på Vortex mixer, og analysér på flowcytometer ved at bruge nedenstående instrumentopsætning og analyseprotokol. Præparerede prøver, som ikke analyseres med det samme, skal opbevares ved 2-8 C og beskyttes mod lys, indtil de er blevet analyseret. Analyse ved flowcytometri skal udføres i løbet af 4 timer efter farvning. OPSÆTNING AF FLOWCYTOMER Før analyse af den første prøve skal der sættes en erhvervelsesprotokol op på flowcytometret. Leuko64 TM -perlerne (reagens C) fungerer som en kalibrator for instrumentets forstærknings- og spændingsindstillinger. For at den automatiserede software fungerer korrekt, er det yderst vigtigt, at trinene nedenfor følges præcist. Se læreprogrammer på CD'en med Leuko64 TM QuantiCALC software for yderligere instrukser. 1. Præparér et 12 x 75 mm polystyrenrør med 5 µl Leuko64 TM -perler (reagens C) i 0,5 ml 1X Trillium-lyseringsopløsning (reagens B fortyndet 1:10 med filtreret destilleret vand, ph 7,40 + 0,05). Denne perlesuspension bruges til at etablere de optimale indstillinger for PMT-spænding og lysspredning på flowcytometret. 2. I cytometrets erhvervelsesmodus (Beckman Coulter XL, FC500 eller Navios brugere - se nedenfor) opsættes 5 histogrammer med to parametre: FS (lin) vs SS (log) CD64 FITC vs SS (log) CD163 PE vs SS (log) FL3 (perler) vs SS (log) CD163 PE vs CD64 FITC Og 3 histogrammer med en parameter: FL1 - CD64 FITC FL2 - CD163 PE FL3 (eller PMT med filteret indstillet til at kunne detektere 685 nm lys) BEMÆRK: På Beckman Coulter XL-, FC500- og Navios-instrumenter skal erhvervelsesparametrene vælges i følgende rækkefølge: P1 = FALS P4 = log PE P2 = log sidespredning P3 = log FITC P5 = log PMT for 685 nm signal (som regel FL4) 3. Fjern alle kompensations- og tærskel-indstillinger. LK64-V11-2013 A4 EN Side 3 af 9
4. Spændingsindstilling for alle instrumenter, bortsetfra BDB FACSCanto II. (FACSCanto II-brugere, se instrukser nedenfor) Bemærk: Sæt alle logparametre til et 4-dekades-display på flowcytometrets indsamlingssoftware før erhvervelse. Kør perlesuspensionen og udfør følgende justeringer på histogrammerne med en parameter (se diagram). Midten af toppen på FL1-aksen (FITC) skal være centreret ved kanal 100 (ved starten af tredje dekade af fluorescensintensitet. Midten af toppen på FL2-aksen (PE) skal være centreret ved ca. 20 (det første skalamærke i anden dekade af fluorescensintensitet). Midten af toppen på FL3-aksen skal være centreret ved kanal 100 eller ved starten af tredje dekade af fluorescensintensitet. På FS vs log SS-histogrammet skal perlepopulationen være anbragt ved enden af tredje dekade for log sidespredningssignal og tæt ved kanal 200 for fremadsprednings- eller lav vinkelspredningssignal (på 256-skalaen bruges kanal 25-50). Til alle brugere af Beckman Coulter-modeller, FACSCalibur og FACScan : CD64 FITC CD163 PE Starfire Red SSC log **Spændingsindstillinger kun for BDB FACSCanto II? -brugere: Der skal bruges anden opsætningsvejledning til BD FACSCanto II-flowcytometre pga. forskelle i displayet af log fluorescensskalaen, som er enestående for den BD FACSDivaindsamlingssoftware, der bruges på Canto II. Bemærk: Sæt alle logparametre til et 4-dekades-display på flowcytometrets indsamlingssoftware før erhvervelse. Kør perlesuspensionen, og udfør følgende justeringer på histogrammerne med en parameter (se diagram). Midten af toppen på FL1-aksen (FITC) skal være centreret ved kanal 3000 (det andet skalamærke i tredje dekade af fluorescensintensitet. Midten af toppen på FL2-aksen (PE) skal være centreret tæt ved enden af anden dekade af fluorescensintensitet. Midten af toppen på FL3-aksen (FITC) skal være centreret ved kanal 3000 (det andet skalamærke af tredje dekade af fluorescensintensitet). På FS vs log SS-histogrammet skal perlepopulationen være anbragt ved enden af tredje dekade for log sidespredningssignal og i kanal 25-50 for fremadsprednings- eller lav vinkelspredningssignal. LK64-V11-2013 A4 EN Side 4 af 9
Kun for brugere af BD FACSCanto II: CD64 FITC CD163 PE Starfire Red SSC log 5. Lymfocytter bruges til at indstille tærsklen for ekskludering af blodplader og rester af røde blodlegemer på log SS. Diskriminatoren på log SS skal sættes lige til venstre for populationen af lymfocytter. Brug ikke en diskriminator, der er sat til fremadspredning, da perler så vil blive ekskluderet fra erhvervelse. 6. Erhvervelse- og opbevaringsindstillingerne skal justeres, så der åbnes mulighed for indsamling af 50.000 ikke-gatede hændelser. Det anbefales normalt at sætte opløsningen til 1024, men det ernødvendigt at gøre det, når man bruger Beckman Coulter Cytomics? FC500- eller BD Biosciences FACSCanto-cytometre. 7. Gem indstillingerne og erhvervelsesskabelonen. Gentag trin 4-7 for hvert nyt parti Leuko64 TM, eller hvis instrumentet er blevet serviceret. ANALYSE AF FIL I LISTEMODUS Installér vedlagte Leuko64 QuantiCALC software på den MacIntosh-computer eller PC, der skal bruges til dataanalyse Følg de brugervenlige instrukser for listemodusdataanalyse i softwarens Hjælp-fil. BEMÆRK: Softwaren er partispecifik, og de protokoller, der bruges, er specifikke for instrumentmodellen. Du vil blive bedt om at bekræfte det rigtige valg. KVALITETSKONTROLSTRATEGI FOR LEUKO64 TM -ANALYSE Analysen bruger autologe cellepopulationer i patientprøven til både positive og negative kontroller, hvilket optimerer vurderinger af præ-analytiske variabler. Lymfocytpopulationen, der mangler ekspression af både CD64 og CD163, fungerer som en negativ kontrolpopulation og sikrer tilsætning af de rigtige reagenser og kan evt. detektere tilstedeværelsen af fluorescerende stoffer i den diagnostiske prøve. Monocytpopulationen, der har konstitutiv ekspression af både CD64 og CD163, fungerer som en positiv kontrol til at sikre, at prøven farves korrekt med reagens A. Følg de brugervenlige instrukser for listemodus-dataanalyse i Hjælp-filen i Leuko64 TM -softwaren for yderligere oplysninger om analysens negative og positive kontroller. BEMÆRK: Softwaren har kontrol-relaterede flag og direktiver. t l H Y C HÅNDTERING OG OPBEVARING Opbevar hætteglas opretstående og med lågene strammet godt til ved 2-8 C, når de ikke er i brug. Uåbnede hætteglas er stabile indtil den udløbsdato, der er LK64-V11-2013 A4 EN Side 5 af 9
indikeret på hvert hætteglas og analyseark. Undgå unødvendige cyklusser med opvarmning og nedkøling, da analysen er valideret til tredive (30) eller færre termocyklusser. Beskyt produktet mod frost, mod temperaturer på over 30 C og mod lang tid ved stuetemperatur (18-26 C) eller udsættelse for lys. ADVARSEL Alle komponenter i dette sæt indeholder natriumazid (<0,1 % vægt/volumen). Dette kemikalie er en giftig og farlig forbindelse, når det kombineres med syrer eller metaller. Behandles forsigtigt. Opløsninger, der indeholder natriumazid, skal bortskaffes på passende vis. PRODUKTKVALITETSKONTROL Ydeevnen og specificiteten af de reagenser, der er indeholdt i dette sæt, er blevet testet ved at bruge Trilliums interne kvalitetskontrolmetoder. Dette produkt er fremstillet ved hjælp af retningslinjer for kvalitetssystemer og fremstillingsproduktion og overholder FDA QSR og ISO 13485:2003. PRODUKTBEGRÆNSNINGER Terapeutisk brug af interferon-gamma, G-CSF eller andre agenser, som modulerer den naturlige immunrespons, vides at påvirke op-reguleringen af leukocyt-cd64-ekspression og vil derfor påvirke fortolkningen af analysen. Leuko64 TM -analyseresultater bør ikke bruges som det eneste mål for inflammation hos disse patienter, men de kan bruges til at overvåge virkningen af sådanne behandlinger. Passende opbevaring af og brugsbetingelser for dette produkt og de prøver, der skal testes, skal overholdes for optimal ydeevne og for at undgå falske eller unøjagtige resultater. Ufuldstændig blanding af reagens C før brug kan ugyldiggøre både alikvoten, som udtages, og resten af materialet i hætteglasset. Hvis man vælger den forkerte instrumentprotokol eller det forkerte sætpartinummer, når man starter softwaren, kan det resultere i nedsat præcision af listemodus-dataanalysen. Softwaren er partispecifik, og de protokoller, der bruges, er specifikke for instrumentmodellen. Foretag det passende valg, når du bliver bedt om det. En fil fra en blodprøve med kraftig leukopeni eller neutropeni, som viser færre end 200 hændelser med hvide blodlegemer, der er gatet af Leuko64 TM -softwaren i en af de tre kategorier (PMN, lymfocyt eller monocyt), kan ikke analyseres af Leuko64 TM -analysen uden betydelig nedsættelse af nøjagtighed og præcision af PMN CD64-indekset. En fil, som har færre end 1000 perlehændelser, skal evalueres, så man kan bestemme årsagen til det lave antal perler, hvilket kan være forårsaget af forkerte instrumentindstillinger eller en ufortyndet blodprøve med et antal af hvide blodlegemer på >25 x 10 9 celler/l. I sjældne tilfælde kan filtre på flowcytometriinstrumenter være anbragt i en atypisk konfiguration, hvor FL1 ikke er CD64 FITC-signalet, og FL2 ikke er CD163 PEsignalet, og derved kompromitteres ydeevnen af Leuko64 TM -softwaren. Kontakt din instrumentforhandler og Trillium Diagnostics tekniske support for hjælp til at LK64-V11-2013 A4 EN Side 6 af 9
løse denne situation eller eventuelle problemer forbundet med brugen af softwaren. KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE Alle laboratorier skal selv etablere et acceptabelt referenceområde for hvert parti af Leuko64 TM. Referenceområdet for PMN CD64-indekset for raske normale blodprøver forventes at være 1,00. Jo kraftigere den systemiske akutte inflammatoriske respons er, jo højere vil indeksværdien for PMN (og monocyt) CD64 generelt blive målt til at være. De forventede referenceområder for indekserne for monocyt CD64 og CD163 er endnu ikke blevet etableret. REFERENCER 1. Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diag 2005;5:193-207. 2. Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fcreceptor mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon- Ɣ treatment of normal human subjects. Blood 1997;90:2987-94. 3. Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol 1988;140:3467-72. 4. Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of interferon- therapy. Lab Hematol 1995;1:3-12. 5. Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 1990;86:1892-1. 6. Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18:125-31. 7. Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab Hematol 2005;11:137-47. 8. Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107:37-43. 9. Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5):654-61. 10. Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin Res 2007;13:94-100. 11. Groselj M, Ihan A, Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 and CD163 expression in critically ill neonates and children with sepsis: comparison of fluorescence intensity and calculated Indexes. Mediators Inflamm 2008; 2008:202646. 12. Bhandari V, Wang C, et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics 2008;121:129-134. LK64-V11-2013 A4 EN Side 7 af 9
13. Hoffmann JJ. Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemica Medica 2011;21:282-90. 14. Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al. CD64 Index provides simple and predictive testing for detection and monitiroing of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol 2009;47:3914-19. 15. US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 29 CFR Parts 1910. 1030, Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register 235:64175-82. 1991. 16. US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS publikation (NIH) 93-8395.Washington: US Government Printing Office. 1993. VAREMÆRKER Leuko64 QuantiCALC-software er ophavsretsligt beskyttet og blev samudviklet af VERITY SOFTWARE HOUSE Topsham, Maine, USA www.vsh.com og, LLC Brewer, Maine, USA www.trilliumdx.com FACSCanto og FACScan er varemærker, der tilhører BD Biosciences San Jose, CA, USA www.bdbiosciences.com Navios, Gallios Cytomics FC500 og XL er varemærker, der tilhører Beckman Coulter, Inc Brea, CA, USA www.beckman.com Leuko64 er en patenteret analyse, der er dækket af amerikansk patent nr. 8.116.984, japansk patent nr. 5047803 og EPO-ansøgning nr. 05851842.4. KUNDESUPPORT M Trillium Diagnostics, LLC PO Box 67 Brewer, Maine, USA 04412 Tlf. 1-207-945-0900 Fax 1-207-942-0346 Teknik info@trilliumdx.com Ordrer via telefon, fax eller hjemmeside på www.trilliumdx.com LK64-V11-2013 A4 EN Side 8 af 9
P IQ Products BV Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen, Holland Tlf. +31(0) 50 57 57 000 Fax +31(0) 50 57 57 002 Teknik marketing@iqproducts.nl Ordrer orders@iqproducts.nl Hjemmeside www.iqproducts.nl LK64-V11-2013 A4 EN Side 9 af 9