Page1 Udarbejdet i samarbejde mellem: Kåre Lehmann, Annabeth Høgh Petersen, Anne Rusborg Nygaard og Jørn M. Clausen
Page2 VIGTIGT: SKIFT PIPETTE SPIDSER/TIPS EFTER HVER GANG!! Så undgår du at forurene dine prøver og de forskellige reagenser :-) God fornøjelse
Page3 A) Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid) 1. Høst celler fra mundhulen med en steril vatpind ved at gnide vatpinden mod indersiden af kinden. Se figur 1. 2. Klip træpinden over ved bomuldskanten og kom træpind med bomuld i et 2 ml rør. Skriv jeres gruppe nummer på røret. Figur 1 Udtagning af prøve og afklipning i mikrocentrifugerør. Til oprensning af genomisk DNA anvendes QIAamp DNA Investigator Kit 3. Tilsæt 400 µl Buffer ATL og 20 µl proteinase K til hvert rør med prøve. Buffer ATL nedbryder (lyserer) cellemembraner og kernemembraner, da det indeholder natriumdodecylsulfat, der er et sæbestof. Dette frigør DNAet. Proteinase K, er et proteinspaltende enzym, der fordøjer DNA-nedbrydende proteiner, således DNAet ikke bliver nedbrudt. 4. Vortex prøven i 10 sekunder. 5. Inkuber prøven ved 56 C i 60 min. Vortex prøven i 10 sekunder hvert 10. min under inkuberingen. 6. Efter endt inkubering centrifuges prøven kort. 7. Tilsæt 400 µl Buffer AL og vortex prøven i 15 sekunder og centrifuger prøven kort. Buffer AL indeholder guanidinhydrochlorid, der er et salt, der ødelægger proteinerne, og herved beskytter DNAet imod at blive nedbrudt.
Page4 8. Inkuber prøven ved 70 C i 10 min. Vortex prøven i 10 sekunder hvert 3. min under inkuberingen. (Imens prøven inkuberer kan man med fordel støbe gelerne under punkt B). Figur 2 Oprensningens hovedtrin. 9. Efter endt inkubering centrifuges prøven kort. 10. Tilsæt 200 µl 100 % ethanol og vortex prøven i 15 sekunder. Centrifuger kort. DNAet vil udfælde ved tilsætningen af ethanol. 11. Overfør lysatet (væsken) til en QIAamp MinElute kolonne. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. Dna et fra prøven vil nu bindes til membranen, som sidder i kolonnen. Efter centrifugeringen overføres kolonnen til et nyt opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 12. Tilsæt 500 µl Buffer AW1 til kolonnen. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. (Det bundne dna vaskes rent for andre stoffer). Herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. Buffer AW1 indeholder også et guadinium salt samt ethanol. 13. Tilsæt 700 µl Buffer AW2. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. (Endnu en vask af det bundne dna). Herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud.
Page5 14. Tilsæt 700 µl 100 % ethanol. Centrifuger ved 8000 rpm i 1 min. (Sidste vask af det bundne dna!)herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 15. Centrifuger ved 14.000 rpm i 3 min (gøres for at trække al ethanolen ud af membranen, så den lettere tørrer) 16. Overfør kolonnen til et 1,5 ml eppendorf rør og inkuber minimum 10 min. ved stuetemperatur eller 3 min. ved 56 C. (Tørring af membranen) Det gl. opsamlingsrør smides ud. 17. Tilsæt 30 µl Buffer ATE til kolonnen og inkuber i 5 min. ved stuetemperatur. Det bundne dna genopløses nu. 18. Centrifuger ved 14.000 rpm i 1 min. Dna et befinder sig nu i væsken igen. 19. Gentag trin 17 og 18 for at sikre, at mest mulig dna bliver elueret. B) Gelelektroforese af oprenset genomisk DNA. Støbning af en 1 % agarose gel (nok til 3 stk.) Hvis der går mere end 1 uge mellem i skal bruge DNA-gelen og PCR-gelerne, er det bedst i støber gelerne ad 2 omgange. Hvis I gør det, husk da at korrigere mængden af agarose og buffer. 1. Rengør 3 gelkar og tilhørende kamme i 70 % ethanol. 2. Spænd gelbakkerne fast i de medfølgende klemmer, så de tætnes i begge ender. Se figur 3. Figur 3 Støbeklemme til gelbakker.
Page6 3. Tag en 250 ml bluecap flaske og vej 1,5 g agarose af i flasken. 4. Tilsæt 140 ml 1xTAE buffer til bluecap flasken, læg en omrører-magnet i og sæt låget løst på. 5. Sæt flasken med agarose-opløsningen på varmepladen og varm til kogepunktet under omrøring. Se figur 4. Opløsningen skal koge et par minutter før al agarosen er opløst. Hvis jeres laboratorie har en mikroovn kan denne anvendes i stedet for varmepladen. Figur 4 Varmeplade med bluecap til smeltning af agarosen. 6. Check at opløsningen er helt klar (intet uopløst agarose må være tilbage). 7. Tag omrører-magneten op. (Gøres bedst med en magnet-henter og pas på den meget varme opløsning!) 8. Tag nitrilhandsker på. 9. Tilsæt 10 ml 1xTAE+EtBr opløsning til de 140 ml opløst agarose, og bland ved at svinge flasken rundt nogle gange. EtBr (Ethidium bromid) anvendes til farvning af DNA og fluorescerer i UV lys. Husk at bruge handsker (nitrilhandsker, de er blå) ved håndteringen af EtBr, da det er mutagen! 10. Lad gelopløsningen køle af i 5 min. 11. Hæld blandingen op i gelkarrene (ca. 40-50 ml per gel). Undgå luftbobler. Kom kammen i toppen af gelen. Lad gelen størkne. (20-30 min). Hvis I ikke bruger al agarose-opløsning til at støbe geler med, kan resten hældes i en pose, som smides i skrald når det er størknet. Husk at skylle flasken ren med vand mens den er varm.
Page7 12. De geler, som ikke skal bruges samme dag, kan gemmes i en plasticpose i køleskabet i op til 1 uge. Gelelektroforese 1. Brug Nitrilhandsker ved håndteringen af gelen. 2. Løsn støbeforms-klemmen, tag kammen op af gelen og kom gelkaret over i et elektroforesekar. Brøndene fra kammen skal vende mod den negative pol i elektroforesekaret, og bunden af gelen skal vende mod den positive pol i elektroforesekaret. DNAet er negativladet og vil derfor vandre mod den positive pol. 3. Hæld 1xTAE Buffer i elektroforesekarret, så brøndene og gelen er dækket med bufferen. 4. Bland 2 µl DNA loading buffer med 10 µl oprenset DNA prøve. 5. Tilsæt 3 µl 1 kb DNA markør til den første brønd. 6. Tilsæt 10 µl af blandingen fra pkt.4 til den næste brønd osv. Der er plads til i 14 prøver/gel. 7. Når DNA markøren og alle prøverne er tilsat gelen sættes gelelektroforese-låget på. 8. Tilslut strømforsyningen til gelelektroforesekaret. VIGTIGT: Husk at sætte rødt stik i rødt hul og sort stik i sort hul i strømforsyningen. 9. Strømforsyningen indstilles på 90 V i 45 min. 10. Tryk start (RUN). 11. Læg gelen på en UV-bakken (se figur 5)og tag et billede (anvend den medfølgende Geldoc)
Page8 Figur 5 UV-tray til Gel Doc'en med gel på. Gel Doc en tilsluttes den medfølgende labtop med USB kablet. Tænd for Gel Doc en strømforsyning og start softwaren på labtoppen Image Lab.
Page9 C) Polymerase Chain Reaction (PCR) med AB0 gene specifikke primere 1. Start med at tænde PCR maskinen og anvend følgende program. PCR-maskinen er allerede programmeret med dette program. Det hedder BIOTEK-1 og kan findes under de gemte protokoller. Vælg dette program og tryk RUN når alle PCR rør med prøver er sat i maskinen. Temperatur Tid Cyklusser 95⁰C 11 min 1 95⁰C 30 sec 60⁰C 30 sec 35 72⁰C 1 min 72⁰C 5 min 1 10⁰C Pause For høj koncentration af template-dna i en PCR-reaktion kan give uspecifik binding af primerne. Man kan koncentrationsbestemme DNA spektrofotometrisk, men ældre udstyr kræver tit et alt for stort volumen end hvad vi har elueret. På baggrund af tidligere erfaring med forsøget anbefaler vi derfor: At fortynde de 60 µl eluat 250x. (dvs 4µl + 996 µl DNA-vand) Gør 2 PCR rør pr. prøve klar. Skriv på låget så du kan kende forskel på dine prøver. Grp. 1 navngiver sine rør: 1a og 1b Grp. 2 navngiver sine rør: 2a og 2b Osv. Tallet indikeret gruppens nummer, og bogstavet indikerer, hvilket primer mix der er anvendt (se nedenfor). 1. Sæt PCR rørerne på is. 2. Tilsæt 20 µl genomisk DNA (fortyndet 250x) til hvert rør. 3. Tilsæt 5 µl Exon6 primer mix (10 µm) til rør a
Page10 4. Tilsæt 5 µl Exon7 primer mix (10 µm) til rør b MEGET VIGTIGT: Skift pipette spids HVER GANG, så primer og prøver ikke forurenes eller bliver blandet med hinanden!!! 5. Bland følgende PCR reaktionsmix på is og i den givne rækkefølge (Hvis der blandes til flere prøver, multiplicer da volumenet med antallet af prøver+2, for at sikre der er nok) Pr. reaktion 12,4 µl DNA H2O 5 µl DreamTaq Buffer (10x) 2 µl dntp mix (25 mm) 4 µl MgCl2 (25 mm) 1,6 µl Dream Taq Polymerase 6. Tilsæt 25 µl PCR reaktionsmix til hvert rør. 7. Når ALLES prøver er klar: Tag din isbakke med prøver hen til PCR maskinen. 8. Sæt hurtigt dine prøver i og luk PCR maskinen. Det er vigtigt at prøverne ikke står og venter i PCR-maskinen, fordi alles prøver ikke er klar! 9. Tjek at PCR programmet kører ved at tiden på 11 min tæller op. PCR programmet varer ca. 2 timer. D) Gelelektroforese af PCR produkter. Hvis man støbte 3 geler i begyndelsen af forsøget, tages de sidste 2 nu frem fra køleskabet. Husk at anvende nitril-handsker ved håndtering af gelerne. 1. Kom gelkaret over i et elektroforesekarret. Brøndene fra kammen skal vende mod den negative pol i elektroforesekaret, og bunden af gelen skal vende mod den positive pol i elektroforesekaret. DNAet er negativladet og vil derfor vandre mod den positive pol. 12. Hæld 1xTAE Buffer i elektroforesekaret, så brøndene og gelen er dækket med bufferen. 13. Bland 2 µl DNA loading buffer med 5 µl PCR prøve. 14. Tilsæt 3 µl 1 kb DNA markør til den første brønd.
Page11 15. Tilsæt 6 µl prøve (produktet fra pkt.13) til den næste brønd osv. 16. Når DNA markøren og alle prøverne er tilsat gelen sættes gelelektroforese-låget på. 17. Tilslut strømforsyningen til gelelektroforesekarret. VIGTIGT: Husk at sætte rødt stik i rødt hul og sort stik i sort hul i strømforsyningen. 18. Strømforsyningen indstilles på 90 V i 45 min. 19. Tryk start (RUN). 20. Læg gelen på en UV-bakken og tag et billede. Samme procedure som Produktet af exon 6 forventes at være ca. 460 bp mens exon 7 er 650 bp. 21. Det tilbageværende PCR produkt fra alle prøver, som gav bånd, skal nu markeres som angivet nedenfor og sendes tilbage til Aalborg Universitet for efterfølgende sekventering. 22. Rørene markeres således: Gruppe x, exon 6 Gruppe x, exon 7 23. Sæt alle prøverne i den medfølgende blå frost-box og opbevar denne i fryseren indtil dagen for tilbagesendelse (alternativt dagen før afsendelse). 24. Når prøverne kommer tilbage til AAU vil de gennemgå en PCR-cleanup (proces, hvor taq-pol, dntp s og primer-rester fjernes), hvorefter de sendes til sekventering. (Normalt hos Eurofins i Tyskland.) Begge exons vil af prismæssige hensyn kun blive sekventeret med forward-primeren. 25. Resultaterne bliver returneret til skolen så snart de modtages retur fra sekventeringsfirmaet. For at tolke sekvens-resultaterne, er man nødt til at læse vejledningen grundigt igennem samt at downloade programmet Chromas Lite, som gratis kan downloades fra internettet. Dette gøre i samarbejde med læreren. Rigtig god fornøjelse!