renseanlæg: Slamflokkenes fysiske egenskaber bestemmes af få vigtige bakteriegrupper En god adskillelse af renset spildevand og det aktive slam er helt afgørende for et velfungerende renseanlæg. Ny forskning har vist, at mindst 60-70 % af alle bakterier i næringssaltfjernende aktiv slam renseanlæg udgøres af overraskende få bakteriearter. Disse arters flokegenskaber er betydende for bundfældning og afvanding, så med kendskab til artssammensætningen i et givent anlæg kan man bedre kan manipulere med flokegenskaberne og dermed driften. I denne artikel opsummeres de nyeste resultater om vigtige bakteriearter i aktiv slamanlæg og disse arters flokegenskaber. Poul Larsen Jeppe Lund Nielsen Per Halkjær Nielsen Biologisk rensning af spildevand i Danmark og på verdensplan udføres langt overvejende ved anvendelse af aktiv slam processen. Princippet bag processen er grundlæggende som for ca. 100 år siden, da denne rensemetode blev opfundet. Vandet renses af bakterier, som gror i små klumper (aktivt slam, slamflokke), det aktive slam bundfældes og det rene vand kan udledes til en recipient, fx en å eller fjord. I figur 1 er opbygningen af et typisk renseanlæg skitseret. Formålet med de første aktiv slam anlæg var udelukkende fjernelse af iltforbrugende stoffer (kulstoffjernelse), men stadig strengere krav til rensning af spildevand siden 80 erne har medvirket til, at der nu renses for både kulstof, kvælstof, fosfor, mange miljøfremmede stoffer og sygdomsfremkaldende bakterier. Udvikling og optimering af aktiv slam processen har hidtil overvejende foregået gennem et øget kendskab og styring af de processer, der foregår i det aktive slam, fx nitrifikation og denitrifikation. Derimod har kendskabet til de mikroorganismer, som rent faktisk udfører processerne været meget lille, og på mange måder kan man i denne sammenhæng betragte aktivt slam som en black box. Årsagen har været, at langt de fleste bakteriearter i aktivt slam ikke har kunnet dyrkes i renkultur, hvilket har gjort det meget vanskelig både at identificere dem og at få kendskab til deres levevis. Imidlertid har den mikrobiologiske forskning med fokus på bakterier, der er vigtige for aktiv slam processen, taget fart de sidste 5-10 år med indførsel af dyrkningsuafhængige metoder (se boks 1). Derfor har vi nu fået en langt bedre viden om de bakterier, som rent faktisk udfører processerne i aktiv slam anlæg. I projektet Den mikrobiologiske database for Danske renseanlæg arbejder Aalborg Universitet i samarbejde med Spildevandsteknisk forening, rådgivende virksomheder og ca. 50 forskellige renseanlæg på at kortlægge mikrobiologien i danske aktiv slam anlæg /1/ og boks 2. Projektet går ud på at identificere og kvantificere bakterierne med anvendelse af dyrkningsuafhængige metoder, at undersøge årstidsvariationer samt finde sammenhænge mellem anlægsdesign, drift og bakteriesammensætning. Et interessant og overraskende resultat ved denne analyse er, at over 60-70 % Figur 1: Principskitse af aktivt slam anlæg. 16. årgang nr. 1, februar 2009 23
og partikler fra spildevandet, så sammensætningen af dette har også en betydning for flokkens sammensætning og egenskaber. Den artsspecifikke produktion af EPS betyder, at forskellige bakteriearter drager nytte af forskellige adhæsionsmekanismer. Af kendte adhæsionsmekanismer i aktiv slam er de vigtigste krydsbinding af negativt ladede polymerer med di- eller trivalente kationer, overfladeneutralisering med kationer, hydrofobe sites samt fysisk sammenfiltring af polymere og fibrøse cellulære overfladestrukturer. Slamflokke er grundlæggende meget stærke Figur 2: Opbygning af aktiv slamflok. af alle bakterierne i almindelige renseanlæg med biologisk C, N og P-fjernelse udgøres af relativt få arter (se tabel 1), som alle er impliceret i C, N og/eller P-fjernelse. De samme arter er til stede i stort set alle de undersøgte anlæg, omend i varierende antal. På baggrund af denne viden er det nu muligt at bestemme vigtige procesrelevante parametre såsom optimale forhold for omsætning af kulstof (C), kvælstof (N) og fosfor (P) specifikt for de forskellige (ikke-dyrkbare) bakteriearter, hvilket i sidste ende betyder forbedrede muligheder for at optimere design og drift af aktiv slam anlæg. Også kendskabet til bakteriearter, som er problematiske er blevet betydelig bedre. Her tænkes specielt på trådformede bakterier, som kan forhindre en effektiv bundfældning eller forårsager dannelse af skum. Ud fra et kendskab til identiteten af de forskellige trådformede bakteriearter kan der nu stilles en diagnose og ydes en markant bedre rådgivning om kontrolmetoder end tidligere. Et begrænset antal bakteriearter i renseanlæggene betyder, at man kan få en mere nuanceret viden også om slamflokkenes egenskaber, end man hidtil har haft. Relativt få arter er med deres flokegenskaber således med til at bestemme om slamflokkene er stærke, let bundfældelige og nemt afvandelige eller om de giver problemer for driften. I denne artikel vil vi kort beskrive de nyeste resultater vedrørende de forskellige bakteriearters flokegenskaber, sammenklæbningsegenskaber eller adhæsionsegenskaber, samt komme ind på de perspektiver denne ny viden bringer med sig. 2). De består overvejende af bakterier, som er klistret sammen af forskellige ekstracellulære polymere (EPS, extracellular polymeric substances) primært bestående af proteiner, polysakkarider, fedtstoffer og extracellulært DNA. Det meste EPS udskilles af bakterierne, så de forskellige arters evne til at producere EPS i forskellig mængde og med specifikke egenskaber er en afgørende parameter for hele slamflokkens egenskaber og dermed for bundfældningsegenskaber, flokstyrke og afvandingsegenskaber. Ofte danner trådformede bakterier en rygrad i slamflokken, hvorpå andre bakterier kan fasthæfte sig, og hvor mange af dem gror og danner mikrokolonier bestående af enkelte arter /2/. På denne måde dannes mikrosamfund lokalt i slamflokken, hvor de udfører forskellige omsætningsprocesser. Foruden bakterier består flokken også af uorganiske og organiske fibre Styrken (bindingsenergien) hvormed de enkelte flokkomponenter (enkeltceller, mikrokolonier og flokfragmenter) hænger sammen kan overordnet beskrives som afbilledet i figur 3. Denne figur opsumerer resultater fra studier, hvor styrken af slamflokke er undersøgt ved omrøringstest. Her er flokstyrken kvantificeret ud fra forholdet imellem omrøringshastigheden (her omregnet til shear-raten G) og fraktionen af fragmenter, som separeres fra flokken (eroderet fraktion). Det ses, at ved meget lave omrøringshastigheder induceres flokkulering. Dette skyldes, at energiinputtet er for lavt til at adskille partikler fra flokkene, så i stedet medfører det, at partikler og flokke støder sammen og bindes svagt til hinanden. Øges omrøringshastigheden begynder store aggregater bestående af enkeltflokke, som er bundet sammen med relativt svage bindinger, at adskilles. Efterfølgende forekommer den egentlige deflokkulering, hvor de svagest bundne partikler på flokkene eroderes væk. Det interessante er, Slamflokken Aktivt slam består af slamflokke med en gennemsnitsstørrelse på 60-100 µm (se figur 24 Vand & Jord Figur 3: Fragmentering og erosion af flokke som følge af stigende turbulens forhold.
Figur 4: Fraktioner af flokkomponenter med forskellig styrke i aktivt slam. at erosion af flokkene ikke fortsætter proportionelt med stigende energiinput. Ved et højt shearniveau resterer en meget stærk kerne i flokken, som ikke lader sig deflokkulere selv under ekstremt turbulente forhold. Figur 4 viser de forskellige fraktioner. Det ses, at knapt halvdelen af bakterierne stort set er umulige at deflokkulere selv ved meget høje shearniveauer. Resten kan eroderes, men kun ca. 15% eroderes med shear alene. Kun hvis der tilsættes detergenter eller andre kemikalier kan også de resterende 40% eroderes. Det fremgår også af figur 4, at det kun er en meget lille andel af bakterierne (~1%), der er suspenderet udenfor flokkene i aktivt slam, når det ikke er udsat for omrøring. Nærmere undersøgelser af den stabile flokkerne har vist, at bakterierne her typisk vokser i mikrokolonier med en størrelse på typisk 525 µm i diameter (gennemsnit 13 µm). denne gruppe dels vokser i mikrokolonier og dels udgør en stor fraktion af Betaproteobacteria, tilhører denne gruppe af bakterier også de stærke bakterier. Andre typer af bakterier (Alphaproteobacteria, Firmicutes og Bacteroidetes) danner svagere mikrokolonier og kan eroderes ved høj shear. De udgør dog normal kun en lille del af bakterierne. Man kan udføre forskellige fysisk-kemiske behandlinger til at afdække hvilke kræfter, som er vigtige for de enkelte arter /3/. En sænkning af ph til 3 inducerer en positiv overfladeladning på partikler/celler og øget opløselighed af positive kationer såsom Fe3+/Fe2+, Ca2+, and Mg2+. Når ph hæves til ph 9,5 bliver overfladeladningen mere negativ pga. dissociering af karboksylsyregrupper. Tilsætning af sulfid medfører reduktion af trivalent jern og udfældning som FeS, Adhæsionsegenskaber for de vigtigste bakteriearter Tabel 1. Dominerende bakteriearter i danske renseanlæg med biologisk N og P fjernelse Vi har undersøgt de mikrokolonidannende bakteriers adhæsionsegenskaber nærmere ved omrøringstests og identifikation og kvantificering af bakterier i den deflokkulerede fraktion ved dyrkningsuafhængige metoder. Resultatet af disse forsøg er summeret i figur 5. Som det fremgår af figur 5, er der klare forskelle i bindingsstyrken af de forskellige bakteriegrupper til trods for den grove opdeling i bakteriegrupper. Mikrokolonier af nitrifikanter og polyfosfat-akkumulerende bakterier (PAO) tilhører tydeligt den stærkeste fraktion, hvilket betyder, at der ikke umiddelbart er risiko for erodering og udvaskning af disse grupper, som følge af forhøjede turbulente forhold. Der er ikke lavet detaljerede forsøg med denitrificerende bakterier, men da tilsætning af EDTA fjerner krydsbinding af divalente kationer (Mg2+, Ca2+), og tilsætning af detergentet Triton-X 100 medfører øget opløselighed af proteiner og fedt. Ydermere er der udført en kombination af ph 3 og ph 9,5, hvor ph først er sænket til 3 og vasket hvorved der potentielt er fjernet positive kationer, efterfølgende er ph øget til 9,5 med øget negativ overfladeladning til følge da de neutraliserende kationer er reduceret. Figur 7 viser resultatet af sådanne undersøgelser, hvor erosion af hele slamflokken (enkeltceller, tråde, mikrokolonier) er sammenlignet med erosionen af mikrokolonier af en hyppigt forekommende polyfosfatakkumulerende gruppe (Accumulibacter). Det fremgår, at en forøget deflokkulerende effekt primært sker ved tilsætning af EDTA, især for det totale bakterieantal, men Funktionel gruppe Grupper eller arter Typisk andel af alle bakterier Nitrifikanter Nitrosomonasarter, især Nitrosomonas oligotropha 3-5% Arter i slægten Nitrospira 3-5% Denitrifikanter Arter i slægterne: Rhodocyclus, Dechloromonas, Thauera, Azoarcus, Zoogloea, Curvibacter 30-40% Biologisk P-fjernelse Polyfosfatakkumulerende: Arter i slægten Rhodocylus, bl.a. Accumulibacter Tetrasphaera-arter Glykogenakkumulerende: Competibacter 3-6% 3-20% 0-6% Fermenterende bakterier Tetrasphaera-arter Streptococcus 3-20% Proteinhydrolyserende bakterier Epiflobacter, m.fl. 2-10% Skumdannende bakterier Mycolata, Microthrix Andre trådformede bakterier Chloroflexi, Haliscomenobacter m.fl. 16. årgang nr. 1, februar 2009 25
Figur 5: Overordnet billede af den relative bindingsstyrke af forskellige mikrokolonidannende bakteriegrupper og mere specifikt for udvalgte hyppigt forekomne nitrifikanter og polyfosfat-akkumulerende bakterier. også i en vis grad for Accumulibacter (20%). Det indikerer, at kationernes evne til krydsbinding af negativt ladede overfladepolymerer er en vigtig adhæsionsmekanisme for slamflokken og måske også for mikrokolonier af Accumulibacter. En anden mulighed er at Accumulibacter mikrokolonier bliver mere blotlagte og udsatte for turbulensen i vandet når andet flokmateriale forsvinder. Ved lignende forsøg udført på nitrifikanter var resultatet stort set det samme, blot var deflokkuleringen endnu mindre /5/. Så vort bud lige nu er, at hverken fjernelse af kationer eller brug af detergent rigtigt kan erodere disse stærke mikrokolonier, så det er sandsynligt, at den dominerende adhæsionsmekanisme kan være fysisk sammenfiltring af cellulære overfladestrukturer. Det er ikke umiddelbart muligt at neutralisere eller påvirke disse overfladestrukturer med kendte fysisk/kemiske behandlinger. I et andet studie har vi undersøgt hvilke bakteriegrupper, som sidder løst bundet til slamflokkene, og som under almindelige om- røringsforhold i renseanlæg nemt bliver afrevet med potentiel udledning til recipienter til følge /6/. Dette viste, at specielt arter som tilhører Planctomycetes, Firmicutes, samt nogle Beta- og Deltaproteobacteria var betydelig lettere at afrive end andre arter. Det vil sige, at artssammensætningen i udløbsvandet ikke er helt identisk med den gennemsnitlige sammensætning i renseanlægget. En interessant observation var desuden, at de afrevne bakterier generelt var mindre fysiologisk aktive end bakterierne i den intakte flok. Det tyder på, at en del af de dårligst flokkulerende bakterier i vandfasen måske kommer med spildevandet og ikke specielt gror i anlægget. Perspektiver for optimering og nye designs af aktiv slam anlæg Vore detaljerede studier af slamflokkenes sammensætning og funktion giver flere interessante resultater af betydning for drift og optimering af aktiv slam anlæg. Først og fremmest er det en vigtig observation, at der er relativt få arter, som er dominerende og Boks 1. Ved dyrkningsuafhængige metoder til analyse af komplekse mikrobiologiske økosystemer forstås metoder, som identificerer bakterierne via deres specifikke DNA-sekvens i udvalgte gener, og det kan ske uden, at de skal dyrkes først. Disse metoder kan kombineres med en række andre in situ metoder, som afdækker forskellige funktionelle egenskaber for bakterierne. Ved anvendelse af disse metoder kommer man langt tættere på den rigtige artsammensætning og funktion end ved anvendelse af almindelige dyrkningsbaserede metoder, idet kun en meget begrænset fraktion af bakterier kan dyrkes med kendte dyrkningsmetoder. 26 Vand & Jord derfor betydende for slamflokkenes egenskaber i de fleste danske anlæg og at vi nu kender disse. Dernæst har de forskellige arter i et vist omfang forskellige flokegenskaber og især forskelle i deres evne til at danne stærke mikrokolonier er vigtig. Endelig er det også interessant, at bakteriesammensætningen i den ikke-flokkulerede fraktion (enkeltceller og små flokke) ikke har helt samme artssammensætning, som den normale gennemsnitsflok. Trouble-shooting af problemer forårsaget af dårlige flokke kan nu gøres på en mere viden-baseret måde, ligesom når man har problemer med trådformede bakterier eller skumdannende bakterier. En identifikation af de problemvoldende bakterier er første skridt, hvorefter dårlige flokdannere kan fjernes med ændringer i drift, eller problemet kan søges løst ved tilsætning af fældningsmidler. Et eksempel er forekomst af slimede slamflokke, som bundfælder og afvander dårligt. En mikroskopering og identifikation kan afgøre om det skyldes arter af Zoogloea eller Thauera og de kan normalt kontrolleres ved mindre omlægninger i driften. Helt generel kan vi nu bedre begynde at designe renseanlæggene med henblik på selektion for de gode flokdannere, som samtidigt opretholder den biologiske omsætning af N og P. Et spændende nyt design, hvor man udnytter dannelsen af stærke flokke, er ved produktion af såkaldte granuler /7/. Her sele-
Figur 6: Forskellige fysisk/kemiske behandlingers effekt på deflokkulering af bakterier (totalt celleantal), herunder Accumulibacter. Delvist fra /4/. kteres gennem en særlig drift for slamflokke, som er meget store (0,5-2 mm) og meget tunge og derved bundfælder særdeles godt. Disse granuler udmærker sig ved, ud over gode flokegenskaber, også at have en meget høj omsætningsaktivitet pr. mængde biomasse. Det har også vist sig, at selektion af granuler med de langsomtvoksende nitrifikanter forbedrer flokegenskaberne yderligere. En anden interessant mulighed er at udnytte de stærke flokegenskaber, som nitrifikanter, denitrifikanter og polyfosfat-akkumulerende bakterier har. I princippet kan flokkene strippes for de dårlige flokdannere gennem en ny enhedsoperation baseret på shear som dernæst føres til rådnetanken som overskudsslam. Dermed bliver den fraktion af slamflokken, som har gode flok- og afvandingsegenskaber anvendt som returslam og holdes dermed i anlægget. Dette vil også betyde, at der recirkuleres flere nitrifikanter, hvilket dermed i sidste ende potentielt kan lede til en større kapacitet på renseanlæggene. Dette er dog, så vidt vi ved, endnu ikke testet på et fuld-skala anlæg. Referencer: /1/ Nielsen, PH., Stevenson, M. & Mielczarek. 2007. Den mikrobiologiske database: Dansk standard aktivt slam. Spildevandsteknisk Tidsskrift 5: 46-47. /2/ Nielsen, P.H. 2002. Activated sludge - the floc. The Encyclopedia of Environmental Microbiology. Bitton, G. (ed). P. 54-61. /3/ Klausen, M.M., Thomsen, T.R., Nielsen, J.L., Mikkelsen, L.H., and Nielsen, P.H. 2004. Variations in microcolony strength of probe-defined bacteria in activated sludge flocs. FEMS Microbiology Ecology 50: 123-132. /4/ Larsen, P., Eriksen, P.S., Lou, M.A., Thomsen, T.R., Kong, Y.H., Nielsen, J.L., and Nielsen, P.H. 2006. Flocforming properties of polyphosphate accumulating organisms in activated sludge. Water Science and Technology 54: 257-265. /5/ Larsen, P., Nielsen, J.L., Svendsen, T.C. and Nielsen, P.H. 2008. Adhesion characteristics of nitrifying bacteria in activated sludge, Water Research 42(10-11): 2814-2826. Boks 2. Projektet Den Mikrobiologiske Database er et forskningsprojekt, som udføres af Aalborg Universitet i samarbejde med Dansk Spildevandsteknisk Forening, Krüger AS, Kemira Water og en række renseanlæg. Projektet har løbet siden 2006 med deltagelse af ca. 50 renseanlæg og fortsættes foreløbigt indtil 2010, se projektets hjemmeside på www.bio.aau. dk under Sektion for Bioteknologi. Der er også tilknyttet en konsulenttjeneste, hvor slamprøver kan analyseres, hvis behov opstår. /6/ Morgan-Sagastume, F., Larsen, P., Nielsen, J.L., and Nielsen, P.H. 2007. Characterization of the loosely attached fraction of activated sludge bacteria. Water Research 42(4-5): 843-854 /7/ de Kreuk, M.K., M. Pronk and M.C.M. van Loosdrecht. 2005. Formation of aerobic granules and conversion processes in an aerobic granular sludge reactor at moderate and low temperatures. Water Research 39: 4476-4484. Poul Larsen, ph.d., civilingeniør, Dansk Miljørådgivning A/S, (pla@dmr.dk). Han har i perioden 2002-2007 på Aalborg Universitet i sit ph.d. projekt forsket i anvendelse af dyrkningsuafhængige metoder til kortlægning af artsspecifikke adhæsionsmekanismer i aktivt slam. Jeppe Lund Nielsen, ph.d., Biokemiker og lektor ved Sektion for Bioteknologi på Aalborg Universitet (jeppe@bio. aau.dk). Arbejder med udvikling af molekylære og mikroskopteknikker til bestemmelse af mikroorganismers identitet og deres aktivitet i naturlige og tekniske systemer. Per Halkjær Nielsen, ph.d., er professor ved Sektion for Bioteknologi på Aalborg Univesitet (phn@bio.aau.dk). Han har i en årrække arbejdet med struktur og funktion af mikrobielle samfund, fortrinsvis knyttet til biologisk rensning af spildevand. 16. årgang nr. 1, februar 2009 27