Godkendelse produktionslokale genetisk modificerede Escherichia coli

Transkript

1 Immunitrack ApS Københavns Biocenter Ole Maaløes Vej København N Pesticider og Genteknologi J.nr. MST Ref. johpe Den 04. august 2015 Godkendelse af produktionslokale og genetisk modificerede Escherichia coli BL21 til fremstilling af Major Histocompatibility Complex II receptorer på Immunitrack ApS, 2200 København N. Miljøstyrelsen godkender hermed lokalet til produktion af Major Histocompatibility Complex II (MHCII) receptorer med genetisk modificerede Escherichia coli (E.coli) BL21. Miljøstyrelsens afgørelse Denne afgørelse meddeles ifølge 8, stk. 1, i lov om miljø og genteknologi 1 og 3, stk. 3, i bekendtgørelsen om indesluttet anvendelse 2 og omfatter alene forhold, der er omfattet af godkendelse efter genteknologiloven. Der er således ikke taget stilling til andre relevante tilladelser i henhold til miljøbeskyttelsesloven eller anden lovgivning. Afgørelsen meddeles på følgende vilkår: 1. Produktionslaboratoriet til fremstilling af MHCII receptorer ved brug af genetisk modificerede E.coli BL21, ligger hos Immunitrack ApS, Københavns Biocenter, Ole Maaløes Vej 5, 2200 København N. 2. Den samlede godkendelse af den genetisk modificerede E.coli BL21 og produktionen klassificeres i klasse 1, jf. bilag 2 i bekendtgørelsen om indesluttet anvendelse. 3. Anvendelse, indretning og drift 3.1 Til produktionen må kun anvendes den genetisk modificerede E.coli BL21, der er beskrevet i ansøgningen, eller andre produktionsorganismer, som fremgår af senere anmeldelser. 4. Sikkerhedsforanstaltninger 4.1 Produktionen og apparaturet skal indrettes, anvendes og vedligeholdes på en hensigtsmæssig måde, så spild og udslip forebygges. 1 Se lovbekendtgørelse nr. 869 af 26. juni 2010 med senere ændringer 2 Bekendtgørelse nr. 225 af 19 marts 2009 om godkendelse af produktion med genetisk modificerede mikroorganismer Miljøstyrelsen Strandgade København K Tlf CVR EAN (drift) (tilskud) mst@mst.dk

2 4.2 Alt biologisk materiale destrueres ved hjælp af Virkon eller autoklavering før det bliver frigivet i kloaksystemet. 4.3 Fast affald, der indeholder eller kan indeholde levende produktionsorganismer, skal enten autoklaveres eller bortskaffes som specielt sygehusaffald (det gule affaldssystem). 5. Tilsyn 5.1 Miljøstyrelsen fører tilsyn med, at virksomheden overholder vilkårene i denne afgørelse og med, at produktionen foregår på en hensigtsmæssig måde. 5.2 Tilsynsmyndigheden kan bestemme, at der skal udføres kontrolmålinger der dokumenterer effektiviteten af indeslutningsforanstaltningerne samt kontrolmålinger af indholdet af levende produktionsorganismer i spildevand, fast og flydende affald samt luftafkast. Udgifter hertil afholdes af virksomheden. 6. Virksomhedens egenkontrol 6.1 Virksomheden skal løbende kontrollere effektiviteten af indeslutningsforanstaltningerne, jf. målinger i afsnittet vedrørende Påvisnings- og identifikationsmetode. 6.2 Virksomheden skal registrere egenkontrol og driftsuheld. Registreringen skal indeholde resultaterne af egenkontrollen jf. vilkår 6.1, og en beskrivelse af foretagne afhjælpende foranstaltninger. Registreringerne skal være tilgængelige for tilsynsmyndigheden i 5 år. 7. Tidsbegrænsning 7.1 Godkendelsen gælder indtil den 04. august Klagevejledning Denne afgørelse kan påklages til Natur- og Miljøklagenævnet, jf. 34 i lov om miljø og genteknologi. Klage til nævnet indgives skriftligt til Miljøstyrelsen ved anvendelse af digital selvbetjening, jf. dog 18 b, stk. 2-4, i lov om Natur- og Miljøklagenævnet 3. Efterfølgende kommunikation om klagesagen skal ske ved anvendelse af digital selvbetjening. Klagefristen er 4 uger fra den dag, afgørelsen er meddelt, jf. samme lovs 31. Ved annoncering regnes klagefristen fra annonceringsdatoen. Hvis klagefristen udløber på en lørdag, en søndag eller en helligdag, forlænges klagefristen til den følgende hverdag. Afgørelsen bekendtgøres ved elektronisk annoncering den 05. august En klage anses for indgivet, når den er tilgængelig for myndigheden. Immunitrack ApS kan under iagttagelse af de fastsatte vilkår udnytte godkendelsen fra datoen for afgørelsen. 3 Se lovbekendtgørelse nr. 736 af 14. juni 2013 med senere ændringer 2

3 Retsbeskyttelse Virksomhedens retsbeskyttelse efter 17 i lov om miljø og genteknologi medfører, at godkendelsesmyndigheden, indtil 4 år efter at afgørelsen er truffet, kun kan give påbud eller forbud, hvis der er fremkommet nye oplysninger om de genetisk modificerede cellers skadelige virkning, eller de genetisk modificerede celler medfører uønskede virkninger på miljø, natur eller sundhed, der ikke kunne forudses, da godkendelsen blev givet, eller påvirkningen af miljø, natur eller sundhed i øvrigt går ud over det, som blev lagt til grund ved godkendelsen. Produktionslaboratoriets indretning og drift Miljøstyrelsen har truffet denne afgørelse på baggrund af virksomhedens beskrivelse af indretning af og produktion i det godkendte lokale. Immunitrack ApS skal forudgående underrette godkendelsesmyndigheden om væsentlige ændringer i laboratoriets indretning og drift samt udvidelser af produktionen i forhold til de oplysninger, der fremgår af den fremsendte ansøgning. Godkendelsesmyndigheden tager derefter stilling til, om ændringen eller tilføjelsen kræver fornyet godkendelse, jf. 15, stk. 2, i loven om miljø og genteknologi. Produktionsaktiviteter med genetisk modificerede produktionsorganismer er nævnt under punkt J 208 på bilag 2 i Miljøministeriets bekendtgørelse nr. 669 af 18. juni 2014 om godkendelse af listevirksomhed. Produktionen skal derfor også godkendes efter reglerne i kapitel 5 i miljøbeskyttelsesloven. Redegørelse for sagen Immunitrack ApS har med ansøgning af 18. maj 2015 anmodet Miljøstyrelsen om godkendelse til at producere MHCII receptorer ved hjælp af genetisk modificeret E.coli BL21 i virksomhedens produktionslaboratorium, rum , Københavns Biocenter, Ole Maaløes Vej 5, 2200 København N. Virksomheden afholdt den 30. september 2014 fælles orienteringsmøde med besigtigelse af produktionslaboratoriet for Københavns Kommune, Arbejdstilsynet og Miljøstyrelsen. Virksomheden har efterfølgende den 25. juni 2015 fremsendt redigerede oplysninger om vært, donor og produktionsorganismen. Den 30. juni 2015 fremsendte virksomheden yderligere information vedrørende produktionslaboratoriets indretning og drift, imødegåelse af driftsforstyrrelser og uheld samt håndtering af spild. Virksomhedens risikovurdering blev modtaget den 2. juli Den 6. juli afholdte virksomhed et møde med Miljøstyrelsen, hvor der blev foretaget en besigtigelse af lokalet. I den forbindelse gjorde virksomheden Miljøstyrelsen opmærksom på, at den ønsker at anvende en -80 C fryser i kælderen (rum og backup-fryser i lokale ) til opbevaring af cellebanken. Som aftalt ved mødet, eftersendte virksomheden den 7. juli 2015 en beskrivelse af påvisnings- og identifikationsmetoden af produktionsorganismen. 3

4 Virksomhedens oplysninger Produktionslaboratoriet er indrettet i rum og fryseren til cellebanken er placeret i kælderen rum (backup-fryser i lokale ). Laboratoriets adresse er Immunitrack ApS, Københavns Biocenter, Ole Maaløes Vej 5, 2200 København N. Immunitrack ApS har anmodet Miljøstyrelsen om godkendelse af produktionslaboratoriet og fremstilling af MHCII receptorer ved brug af genetisk modificeret E.coli BL21. De producerede proteiner vil blive solgt som reagenser til andre laboratorier. I februar 2015 blev Immunitrack miljøgodkendt, og Teknik- og Miljøforvaltningen, Center for Miljøbeskyttelse, Københavns Kommune vurderede, at aktiviteterne ikke var omfattet af VVM-pligten. Oplysninger om produktionslaboratoriet Beliggenhed Immunitrack ApS søger om tilladelse til GMO-produktion ved produktionslaboratoriet i rum og opbevaring af cellebanken i en fryser i kælderen rum (backup-fryser i lokale ), Københavns Biocenter, Ole Maaløes Vej 5, 2200 København N. Virksomheden er beliggende på en del af Københavns Universitet. Personale De ansvarlige for den daglige drift er Stephan Thorgrimsen, PhD i Biokemi fra Københavns Universitet og Sune Justesen, PhD i Biokemi fra Københavns Universitet. Sikkerhedsrepræsentanten er Hein Phan. Beskrivelse af produktionslaboratoriet Produktionslaboratoriet er indrettet som et traditionelt laboratorium med borde, skabe samt et stinkskab med udsug. Der er håndvaske, men intet gulvafløb. Produktionslaboratoriet er indrettet med følgende udstyr: -80 C fryserne i kælderen, rum og (backup-fryser), anvendes til opbevaring af cellebank. Inkubator bruges til at gro E.coli BL21 bakterier, enten på plader i inkubatoren eller i rystekultur i ryste-inkubatoren. Fermentorer anvendes der to af, til opformering af produktionscellerne. Begge har en kapacitet på 5 liter. Al luft ind og ud af fermenterne filtreres igennem faste filtre, der ikke udskiftes, men rengøres med 70 % ethanol. Centrifuger af forskellige volumener. Den ene er en sorval centrifuge, som anvendes til at spinde celler indeholdende det ønskede protein ned. -20 C fryser bruges til opbevaring af nedspundne cellepelleter fra centrifugering. Cell disrupter til at lysere cellerne under højt tryk (1000 bar) efter de er blevet resuspenderet i en protein ekstraktion buffer. 4

5 Autoklave i stinkskab anvendes til at autoklavere medium. Transport Cellebanken opbevares i -80 C fryser i kælderen i lokale (alternativt i backupfryseren i lokale ). Ved transport op til produktionslaboratoriet lokale , bruges lukkede, brudsikre termobeholdere med flydende nitrogen. Transportbeholderen er mærket genteknologisk materiale, klasse 1. Tilrettelæggelse af produktionen Produktionsprocessen består af følgende trin: 1) podning og opformering af genetisk modificerede E.coli BL21 enten på plader eller i ryste kulturer i inkubator 2) dyrkning af genetisk modificerede E.coli BL21 i fermentorer 3) høst af genetisk modificerede E.coli BL21 efter 24 timer i køleskab, medie hældes fra i en 10 liter flaske indeholdende virkon ned til 1 liter, som centrifugeres i 2 x ½ liter beholdere, hvor medie igen hældes fra, 4) Cellerne optøs og resuspenderes i en protein ekstraktions buffer, 5) hvorefter de lyseres undre højt tryk (1000 bar) i cell disrupter. 6) celleekstraktet køres på søjle (Protein A søjle, Sepharose søjle, Nikkel søjle) ved hjælp af HPLC maskine (AKTA start) for at isolere proteinet. Forventet kulturomfang af mikroorganismer På nuværende tidspunkt har virksomheden kapacitet til at producere i 2 x 5 liter fermentorer. Påvisnings- og identifikationsmetode Prøven kan tages med en vatpind, som derefter stryges på en agarplade med kanamycin. Kun E.coli som indeholder et konstrukt, der koder for neomycin phosphotransferase, vil kunne gro på de pågældende plader ved 37 C. Efter 15 timers inkubation vil eventuelle kolonier være synlige. Metoden er særdeles sensitiv idet, en enkelt bakterie vil formere sig til en koloni på agar pladen. For at verificere, at der er tale om produktionsorganismen, kan DNA ekstraheres fra bakterierne på pladen og sekvenseres. Foranstaltninger til imødegåelse af driftsforstyrrelser og uheld Driftsforstyrrelser vil typisk være på grund af spild eller udstyr, som er gået i stykker. Ved spild desinficeres overfladerne med 70 % ethanol. Kontamineret glasudstyr desinficeres med 1 % rodalon/virkon anbragt i beholder i stinkskab natten over. Muligheder for uheld, der medfører spild: Spild ved fermentering eller arbejde med bakterie vil medføre kontaminering af overfladerne og håndteres ved at påføre 70% ethanol, tør overfladerne med papir, og smide papiret i en GMO affaldspose. Virksomhedens oplysninger om donor-, værts- og produktionsorganisme Donor Insertet udtrykker Major Histocompatibility Complex II (MHCII)-receptorer. Der anvendes ikke en donororganisme, da alt DNA materialet syntetiseres kunstigt. 5

6 Vektor Plasmidet hedder Pet28a+ og indeholder et BL21 kanamycin-resistensgen, hvilket induceres ved hjælp af T7 polymerase og laktose eller IPTG. Insert De anvendte gener udtrykker MHCII-receptorerne. Disse spiller en central rolle i det adaptive immune system i mennesker. I bakterien bliver de udtrykte proteiner transporteret i vesikler, kendt som inklusionslegemer, hvori proteinerne ikke er foldet og dermed ikke besidder nogen biologisk aktivitet. Vært Den genetisk modificerede E.coli er kendt under navnet BL21 (DE3), er designet til at kunne udtrykke proteiner. Den har genotypen: fhua2[ion] ompt gal (λ DE3) [dcm]δhsds λ DE3 = sbamhlo ΔEcoRI-B int::(lacl::placuv5::t7 gene1) i21 Δnin5 Stammen transformeres med Pet28a+plasmidet, som indeholder det ønskede insert. Inserts og genetisk modifikation Genet for MHCII receptoren indsættes i Multiple Cloning Site, hvor det er klonet ind i Ncol/HindIII restriktionssitet. Genet bliver udtrykt under T7 polymerase regulering. Produktionsorganismerne Den færdige produktionsorganisme er E.coli BL21, hvori plasmidet Pet28a+ er indsat, som indeholder genet for MHCII. Dermed udtrykker den genetisk modificerede E.coli BL21 MHCII proteiner der ikke er foldet. Disse proteiner transporteres i inklusionslegemer. Resume af virksomhedens risikovurdering Den genetisk modificerede E.coli BL21 forårsager ikke sygdomme hos mennesker dyr og planter. Ligeledes har den ikke nogen skadelig virkning på miljøet og er ikke i stand til at overføre genetisk materiale til andre organismer. E.coli BL21 er udbredt som molekylærbiologisk værktøj. Stammen har igennem mutationer fået fjernet patogenitet, hvilket har gjort den ude af stand til at overleve udenfor laboratoriet og dermed ikke i stand til at etablere sig i miljøet. Derfor fremkommer der ikke nogen umiddelbart sikkerhedsrisiko ved arbejde med E.coli BL21. Den lever desuden op til US NIH sikkerhedskrav. Proteinproduktet fra det indsatte genetiske materiale, som overføres til E.coli BL21, har ingen biologisk aktivitet i organismen, da det ikke kan foldes korrekt. Desuden udtrykkes kun dele af proteinet (monomer) der arbejdes med, som alene ikke er funktionelt. De udtrykte proteiner bliver samlet i inklusionslegemer i inaktiv form. Pet28a+ vektoren koder for Neomycin phosphotransferase II, som inaktiverer kanamycin. Der findes umiddelbart ikke nogen fare ved kontakt med bakterier, som udtrykker dette gen. Der anvendes ikke en donororganisme, da alt DNA materialet syntetiseres kunstigt. 6

7 Det er ikke lykkedes forskerne at finde information om en potentiel fare ved at arbejde med E.coli BL21 og derfor må sandsynligheden for skadelige virkninger være minimale eller ikke eksisterende. Beskrivelse af indeslutningsforanstaltninger og andre beskyttelsesforanstaltninger Indeslutningsforanstaltningerne på al luft ind og ud af fermenterne sikres ved faste filtre, der ikke udskiftes, men rengøres med 70 % ethanol. Spild af biologisk materiale dekontamineres med 70 % alkohol og aftørres med engangspapirservietter. Alt laboratorieaffald bliver behandlet som GMO-affald og dermed afskaffet som klinisk risikoaffald, der behandles som H-affald hos Kommunekemi. Al flydende biologisk affald enten autoklaveres eller inaktiveres ved brug af Virkon, inden det udledes til kloaksystemet. Virksomhedens klassifikation af produktionsaktiviteten Immunitrack ApS vurderer, at den genetisk modificerede E.coli B21 kan håndteres som GMO klasse 1 arbejde jf. bekendtgørelse 910 af 11. september 2008, idet klasse 1 er arbejde, som ikke indebærer nogen risiko eller kun en ubetydelig risiko, dvs. arbejde, hvor klasse 1-indeslutning er tilstrækkelig til at beskytte menneskers sundhed og miljøet. Alle patogene gener i E.coli B21-stammen, der arbejdes med, er fjernet. Dette medfører, at stammen ikke kan overleve udenfor laboratoriet. Miljøstyrelsens verificering af virksomhedens vurdering og klassifikation Miljøstyrelsen finder, at virksomhedens ansøgning af 18. maj 2015 er i overensstemmelse med 4, stk. 1, i bekendtgørelsen om indesluttet anvendelse, og at den indeholder de oplysninger, der er anført i bekendtgørelsens bilag 5, del A og B. Ansøgningen indeholder oplysninger om produktionsområdets indretning og drift, herunder indeslutningsforanstaltninger, samt beskrivelse af de genetisk modificerede E.coli som anvendes til fremstilling af MHCII receptorer. Virksomheden har endvidere udført en miljø-, natur- og sundhedsmæssig risikovurdering af produktionsaktiviteten i overensstemmelse med 3, stk. 1, i bekendtgørelsen om indesluttet anvendelse. Vurderingen er udført efter bekendtgørelsens procedurer for udarbejdelse af en risikovurdering og omfatter en samlet vurdering i forhold til produktionsaktivitetens omfang, karakter og det ydre miljø, jf. bekendtgørelsens bilag 3 om principper for risikovurdering. De fremsendte oplysninger beskriver produktionsforhold, indeslutningsforanstaltninger, og bortskaffelse af fast og flydende affald. Miljøstyrelsen har vurderet de enkelte trin i fremstillingsprocessen, herunder de indeslutningsforanstaltninger, virksomheden har etableret. Styrelsen vurderer, at virksomheden har udarbejdet procedurer og sikkerhedsanordninger, der begrænser risikoen for spild og udslip af den genetisk modificerede produktionsorganisme. 7

8 Miljøstyrelsen konkluderer, at produktionsaktiviteten følger de generelle principper for god mikrobiologisk produktionspraksis, og at indretningen og driften er i overensstemmelse med de indeslutnings- og beskyttelsesforanstaltninger, der er fastsat for produktionsaktiviteter i klasse 1, jf. bekendtgørelsens bilag 4 om generelle principper og relevante indeslutnings- og beskyttelsesforanstaltninger. Virksomheden har ud fra risikovurderingen, jf. bekendtgørelsens bilag 3 samt kriterierne for klassifikation af produktion med genetisk modificerede mikroorganismer i bekendtgørelsens bilag 2 klassificeret produktionen i klasse 1. Miljøstyrelsen kan verificere, at udarbejdelsen af risikovurderingen er i overensstemmelse med bekendtgørelsens bilag 2 og 3, og styrelsen finder, at risikovurderingen fører til en korrekt klassifikation af aktiviteten. Med venlig hilsen Josefine Hvidkjær Pedersen Kopi til: Sundhedsstyrelsen Danmarks Sportsfiskerforbund Danmarks Fiskeriforening Forbrugerrådet Arbejderbevægelsens Erhvervsråd Danmarks Naturfredningsforening Københavns Kommune Arbejdstilsynet Natur- og Miljøklagenævnet 8