Proteomik kit II. Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen, Nærum Gymnasium, oktober 2007

Transkript

1 1 Proteomik kit II Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen, Nærum Gymnasium, oktober 2007

2 2 Indledning Formålet med denne danske version af vejledninger til de to kits Proteomics I og Proteomics II har været at få de vigtigste dele bearbejdet til danske forhold og at få specielt siderne, der beskriver lærerens forberedelser og elevvejledningerne skrevet på dansk. Da ikke alle skoler råder over lodrette elektroforesekar er den vandrette proteinelektroforesemetode også beskrevet. På lignende vis er immunoblottingen beskrevet dels hvor der bruges en immunoblottingenhed og dels metoden, hvor der blottes ved hjælp af kapillærkræfter. Rettelser modtages med glæde, og vil blive bearbejdet hurtigst muligt, så de kan komme andre til gavn. Skriv til BirgitJustesen@gmail.com. Proteomik Proteomik er studiet af proteiner, specielt deres struktur og funktion. Området dækker over hele det vidensfelt, der analyserer proteiner og deres anvendelsesmuligheder. I de to kit, der omhandler proteomik arbejdes der med analyse af fiskeproteiner og specielt aktin og myosin. I musklerne er der en hel række proteiner, der alle medvirker til at få musklen til at trække sig sammen. Nogle proteiner er bevarede og ens i hele dyreriget, mens andre er specielle og kun findes hos bestemte dyrearter. Disse varianter kan betragtes som raffinementer, der tilpasser musklen til en speciel funktion bestemt af dyrets levevis fx i forhold dets niche, fysiologiske påvirkninger og andet. De mest almindeligt forekommende muskelproteiner ses i nedenstående tabel. Proteiner er sammensat af aminosyrer. Aminosyrer indeholder en aminogruppe og en carboxylgruppe, der begge bruges til binding, når aminosyrer sættes sammen til proteiner. Derudover indeholder aminosyrer også en sidekæde. Det er i høj grad denne sidekæde, der giver aminosyrerne og dermed proteinet dets egenskaber. Aminosyresammensætningen i et protein bestemmes af organismes DNA og det er netop denne arvelighed, der arbejdes med i dette kit. Kendskabet til proteinernes arvelighed kan også bruges til at studere bestemt egenskaber eller rettere påvise aktive gener i organismer. Eksempelvis kan man påvise et bestemt protein, vitellogenin, i dyr, der er under påvirkning af hunligt kønshormon, og det kan derfor bruges til at påvise begyndende kønsskifte hos hanfisk i hormonforurenede vandløb. Ligeledes kan proteiner bruges til at bestemme slægtskab, fordi ét bestemt protein, fx det kontraktile element i en muskel har lidt forskelligt udseende fra dyr til dyr, men jo nærmere beslægtede to dyr er, desto mere ens er deres DNA og jo mere ens er deres proteiner dermed også.

3 3 Wester Blotting/immunoblotting og monoklonale antistoffer Med Western blot teknikken eller immunoblotting er det muligt at detektere et bestemt protein blandt mange andre proteiner i en blanding. I forsøget her bruges immunoblottingen til at detektere den lette kæde i myosinmolekylet og dette proteins variation med hensyn til forskellige og ligheder. For at finde myosinmolekylets lette kæde blandt de andre proteiner, der forekommer i fiskeprøverne benyttes et monoklonalt antistof, der specifikt binder sig til myosinmolekylet For at fremstille monoklonale antistoffer mod et bestemt antigen X benytter man forsøgsmus. Musene injiceres med antigen X (et protein)og vil derefter begynde at danne antistoffer mod det injicerede antigen. Derefter udtages der antistofproducerende celler fra musens milt. Disse celler vil producere mange forskellige antistoffer. I næste trin adskilles de enkelte miltceller og disse blandes nu med specielle tumor-inducerende celler. Herved fås såkaldte hybridomaceller, der dels har miltcellernes antistofproducerende evne og dels har tumorcellens evne til at dele sig. Man lader nu hybridomacellerne vokse i et stykke tid, hvorved hver celle vil danne en lille klon. Hver klon danner et bestemt antistof. I næste trin adskilles af klonerne ved hjælp af selektive medier. Produktionen af monoklonale antistoffer er nu færdig og man kan bruge det monoklonale antistof som probe til at spore det specifikke protein (antigen X). Animation af fremstilling af monoklonale antistoffer: Tryk på Monoclonal Antibody Production

4 Muskelproteiner I forsøget ekstraheres der ikke kun aktin og myosin, men også mange andre proteiner, som findes i muskelvæv: 4

5 5 Tabel 1 Muskelproteiner ordnet efter størrelse: Protein MW(i kd) Funktion Titin 3000 centrerer myosin i sarcomererne Dystrophin 400 fæstner til plasmamembranen Filamen 270 krydsbinder aktinfilamenterne i en gel Myosin tung kæde 210 bevæger aktinfilamenterne Spektrin 265 påhæfter filamenterne til plasmamembranen M1/M2 190 nedbrydningsprodukt fra myosin M3 150 nedbrydningsprodukt fra myosin C protein 140 nedbrydningsprodukt fra myosin Nebulin 107 regulere samlingen af aktin α-aktinin 100 bundter aktinfilamenterne gelsolin 90 adskiller aktinfilamenterne fimbrin 68 bundter aktinfilamenterne aktin 42 former filamenterne tropomysin 35 forstærker aktinfilamenterne troponin (T) 30 regulerer kontraktionen myosin let kæde snoet omkring den tunge myosinkæde hjælper ved kontraktionen troponin (I) 19 regulerer kontraktionen troponin (C) 17 regulerer kontraktionen thymosin 5 isolerer aktinmonomerer Kaleidoskopstandarden: Kaleidoskopstandarden består af ti proteinbånd på10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 og 250 kd. De ti bånd har fem forskellige farver se den lille folder der følger med kaleidoskopstandarden. Proteinstandarderne er specialudviklede, så de har en præcis molekylvægt. Standarden er specielt udviklet til at køre i Laemmli SDS lodret elektroforese i polyacrylamidgeler. Læs nærmere om kaleidoskopstandarden i den lille folder, der følger med standarden

6 6 Sikkerhed: Der arbejdes i laboratoriet og det anbefales, at alle bærer kittel og handsker. Eleverne skal vaske hænder før og efter eksperimentet. Får man noget i øjnene skylles der straks og efterskylles med vand i 15 minutter. Kontakt lægen. Blandingen af farvereagenset til immunoblotreaktionen skal udføres af læreren! HRP farve reagens A er giftigt ved indtag og der skal straks søges lægehjælp. Nitrocellulosen er meget brandbar og må derfor ikke komme i nærheden af åben ild. Coomassiefarven er ikke giftig, men da den farver tøj og fingre blå, anbefales det, at man bærer handsker under denne del af forsøget. Affaldsbehandling: Tjekliste: I kittet: Primært antistof (anti-myosin light chain mouse monoclonal) (monoklonalt antistof) Frysetørret 1 glas Sekundært antistof (goat anti-mouse polyclonal antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)) frysetørret 1 glas HRP farve reagens A 1 flaske HRP farve reagens B 1 glas 10x Tris-glycin 1 flaske Skummetmælks blokker (non fat milk blocker) 1 pakke 10x PBS (fosfatbuffer) 2 flasker 10% Tween 20 1 flaske Nitrocellulosemembran, 0,45 µm 8 ark Blotting papir 16 ark Reagensglas 1 pakke Manual/vejledning 1 Nødvendigt udstyr på skolen: Proteomik kit I 1 Ready Gel færdigstøbte polyacrylamidgeler, 15 %, 10 brønde 8 Lodret gelelektroforeseapparat 4 Mikropipetter 0-20 µl 8 Strømforsyning Vandbad 95 o C Eventuelt et rystebord/vippebord 96 % ethanol eller denatureret sprit 2L Demineraliseret vand 8-12 L Fiskeprøver Skalpeller Klemmer til at tage på varme ting med

7 7 Diverse kar Mærkepenne Køkkenrulle Elektroblottermodul til lodret elektroforesekar Borddækningspapir Bemærk: Det er muligt at købe de fleste enkeltdele til kittet som refill. Se nærmere i den engelske manual. Bemærk: I begge kit er der temperaturfølsomme ingredienser åbn derfor straks pakken og læg posen med de temperaturfølsomme dele i fryseren ved 20 o C. Alle andre dele opbevares ved stuetemperatur. Tidsforbrug (1 lektion er 45 minutter): 1.lektion: Klargøring af muskelproteiner 2.lektion: Elektroforese og farvning af geler 3. lektion: Immunoblotting Bemærk: Det er vigtigt at lektion 2 og 3 følger straks efter hinanden 4. lektion: Overførsel til membran for tjek af myosin og aktin Bemærk. Kit I og II kan køres over en samlet 3-4 timers blok. Lærerens forberedelser til 1. lektion (½ time): Indkøb 5 forskellige fiskeprøver. 100g af hver art er rigeligt. Klargøring af laemmlibuffer med DTT: Tag 30 ml Laemmlibuffer og tilsæt hele indholdet af glasset med DTT (det totale volumen vil blive ca 50 ml). Mærk 8 1,5 ml mikrocentrifugerør med PB for prøvebuffer. Fordel 1,5 ml Laemmlibuffer med DTT til hvert af de 8 rør. Rørene stilles i fryseren til de skal bruges. Rørene med den færdigblandede laemmlibuffer kan opbevares i fryseren i op til 3 måneder. Bemærk: På grund af det ustabile DTT opbevares prøverne i fryseren. Den lave temperatur vil til gengæld betyde at den SDS, der er i prøven udfældes. Det er derfor nødvendigt at varme prøven op til stuetemperatur og ryste grundigt før brug. Klargør lokalet og gruppebordene Materialer til hver gruppe. Mikrocentrifugerør, 1,5 ml 5 skruelågsrør, 1,5 ml 5 1 ml engangssprøjter (fra kit I) 1 Laemmlibuffer med DTT mærket PB 1,5 ml Skalpel 5 vejeskåle Skumholder til mikrocentrifugerørene Mærkepen Klemme til varme ting Fælles: Vandbad på 95 o C

8 8 Lærerens forberedelser til 2. lektion (½ time): Inden der kan fortsættes med elektroforese skal proteinekstrakterne fra de forskellige fiskeprøver gøres klar. Det betyder blandt andet at prøverne fra kit I skal behandles med DTT (dithiothretiol). DTT tilsættes for at undgå sammenklumpning af myosin med andre proteiner. Aktin og myosinstandarden. Tilsæt 500 µl Laemmli buffer til det lille glas med den frysetørrede aktin-myosin standard og opløs proteinerne. Lad glasset stå i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør hele aktin-myosin standarden til et mærket skruelågsrør og stil det i vandbadet ved 95 o C i 5 minutter. Mærk 8 1,5 ml skruelågsrør AM og fordel 10 µl aktin-myosinstandard til hvert rør eller hav standarden klar ved et fællesbord, hvorfra en fra hver gruppe kan afpipettere den nødvendige mængde. Den klargjorte aktin-myosinstandard kan opbevares i op til 12 måneder ved -20 o C. Elektroforesebuffer til polyacrylamidgeler (TGS-geler) Der er brug for ca. 500 ml elektroforesebuffer pr. lodret elektroforesekar. Hvert kar kan tage 2 geler. For at fremstille 2L elektroforesebuffer tages 200mL 10x Tris-glycin-SDS med ml demineraliseret vand. Den færdige buffer kan opbevares i op til 6 måneder ved stuetemperatur. Tips: Det er en god ide, at fremstille 1-2 L ekstra buffer i tilfælde af, at et af elektroforesekarret lækker. Alternativt kan man lade karret stå i en bakke e.l. under påfyldningen, så man kan samle eventuelt spild op. Kaleidoskopstandarden Mærk 8 1,5 ml mikrocentrifugerør med K og fordel 6 µl Kaleidoskopstandard til hvert rør Klargør lokalet og gruppebordene Materialer til hver gruppe: Muskelekstrakt fra 1. lektion 5 rør pr. gruppe Aktin-myosinstandard 10 µl 1 Kaleidoskopstandard 6µL 1 15 % 10 brønds Ready Gel (precast (færdigstøbt)) 1 Skalpel 1 Mikropipette 0-20 µl 1 Pipettespidser Affaldsbøtte til spidser mm. Holder til mikrocentrifugerørene Kar til gelfarvning Fælles: Lodret elektroforesekar 1 pr. 2 grupper Strømforsyning Gelloading-hjælper Coomassiefarve Vandbad på 95 o C Rystebord/vippebord Demineraliseret vand eller vandhanevand til affarvning

9 9 Lærerens forberedelser til 3. lektion (½-1 time): Såfremt man ikke har adgang til elektroblotting udstyr er der stadig mulighed for at lave en western blotting. Den alternative metode findes bagest i denne vejledning. I denne lektion overføres eller blottes proteinerne ved hjælp a strøm fra gelerne over på en nitrocellulosemembran. Den blottede membran placeres derefter i en blocking solution (består af skummetmælksproteiner, som blokerer de sidste pladser i membranen dvs. der hvor der ikke er overført proteiner) og derefter, i lektion 4, sporer man ved hjælp af monoklonale antistoffer bestemte proteiner. Hvis man ikke skal udføre det sidste trin i lektionen direkte efter 3. lektion kan man lade membranen ligge i blocking solution til næste dag. Man kan i realiteten ikke overblokke, men mælken kan blive ødelagt ved at stå for længe og der kan opstå mikrobiel vækst, som kan ødelægge membranen. Det er nødvendigt at blokke mindst 15 minutter. Har man ikke mulighed for at gå videre med lektion 4 den følgende dag, men først senere kan man lade den blottede membran stå i blotting buffer eller vaskebuffer ved 4 o C (køleskab) i op til en uge. For at foretage en western blotting eller en immunoblotting laves en såkaldt sandwich ved at en gel og en nitrocellulosemembran placeres mellem 2 lag tykt filtrerpapir (blotting paper). Når sandwichen er samlet og placeret i tanken, sendes en elektrisk strøm gennem sandwichen, som derved får de negativt ladede proteiner til at bevæge sig ud af gelen og over på den proteinbindende nitrocellulosemembran. Tip: Det er vigtigt, at det er en tæt sandwich uden luftbobler! For at vise effektiviteten af blottingproceduren kan man, efter at processen er overstået, farve gelen med coomassie blå. Ikke-farvede geler blotter man i 2½ time ved 20V. Har man en speciel stærkstrøms strømforsyning beregnet til blotting, i 30 minutter ved 100V. Men da der udvikles stærk strøm under blottingen, er det kun specielle strømforsyninger, der kan klare den høje spænding. Farvede geler derimod blottes i 15 timer ved 20V. Hvis blotting tiden forkortes kan det resultere i at ikke alle proteiner med høj molekylvægt bliver overført, idet en polyacrylamidgeler med højt indhold af acrylamid har en tendens til at holde på de større proteiner. På tilsvarende vis, vil man ikke få de mindste proteiner med, hvis der blottes i for kort tid. Tip: Det er utroligt nødvendigt at membran og gel placeres korrekt i forhold til hinanden! Den negative elektrode (sort) skal være tættest på gelen og den positive elektrode skal være tættest på nitrocellulosemembranen. Ligeledes er det meget vigtigt at sikre at blotting modulet er placeret korrekt i buffertanken! Følg anvisningen nøje. Efter blottingen sikres det, at der er synlige farvede standarder. Hvis ikke, kan det skyldes at strømmen er kørt den forkerte vej. Strømforsyning Da der udvikles en relativ stærk strøm ved immunoblotting er det nødvendigt, at undersøge om man har de optimale muligheder. Hvis man bruger for stærk spænding, vil der udvikles for stærk strøm og gelen kan risikere at smelte. Det anbefales at der blottes i 2½ time ved 20 V. Blottes de hurtigere fx i 30 minutter ved 100V kan man risikere at strømforsyningen ikke kan klare det. Der kan dannes en strøm på op til 230mA hvis spændingen sættes til 100V.

10 10 Problemet kan afhjælpes en lille smule ved at køle bufferen før start, men generelt anbefales det kun at køre ved 20V frem for at overbelaste strømforsyningen. I den engelske manual findes der en tabel, der viser anbefalede blotting forhold for BioRads forskellige strømforsyninger. Fremstilling af blotting buffer 1x Tris-glycinbuffer med 20% ethanol: Bufferen bruges i buffertanken, når der blottes. Bland: 2,8 L Demineraliseret vand 400 ml 10x Tris-glycin 800 ml ethanol (der kan også benyttes methanol eller isopropyl, hvis man ikke har ethanol) Den færdige buffer kan opbevares ved stuetemperatur eller i køleskab i op til 6 måneder Fremstilling af blokker 5% tørblokker, dvs. Skummetmælkspulver, i vaskebuffer: Blokkeren bruges til at blokere ledige pladser på nitrocellulosemembranen og til at fortynde antistofferne. Bland: 359 ml demineraliseret vand 40 ml 10x PBS 1 ml 10% Tween 20 20g dry blocker (tørblokker) (skummetmælkspulver) Tjek at tørblokkeren er fuldstændig opløst før blokkeren bruges. Den færdige blanding kan opbevares i op til 48 timer i køleskab Bio-Ice units Bio-Ice enhederne fyldes med vand og stilles i fryseren mindst 1 time før forsøgets start. Klargør lokalet og gruppebordene Materialer til hver gruppe: Blottingbuffer 500 ml Kraftigt filtrerpapir (blotting papir) 2 Nitrocellulosemembran 1 Frossen Bio-Ice unit 1 pr. 2 grupper Rulle (fx en rund blyant, et reagensglas e. l) 1 Blød blyant 1 Beholdere til at samle gel og membran i 2 Blokker 25 ml Fælles: Mini Trans-blot enhed Rystebord/vippebord Strømforsyning (se note nedenfor)

11 11 Lærerens forberedelser til 4. lektion (1 time): Ved hjælp af monoklonale antistoffer specifikt rettet mod proteinerne i den lette kæde i myosin er det nu muligt at undersøge for dette proteins tilstedeværelse. Efter at det monoklonale antistof har bundet sig myosin bindes et sekundært polyklonalt antistof, bundet til HRP-enzymet, sammen med det monoklonale antistof. Efterfølgende behandles med et substrat, der binder sig til HRP-enzymet og der opstår en farvereaktion netop der, hvor myosin befinder sig. Vaskebuffer Vaskebufferen bruges til at vaske nitrocellulosemembranen og til rehydrering (opløsning) af antistoffer. Bland: 1,35L demineraliseret vand 150 ml 10x PBS 3,75 ml 10% Tween 20 Blandingen kan opbevares ved stuetemperatur i op til 2 uger. HRP farve reagens Dette reagens klargøres lige før forsøgets start og helst ikke før 1 time før brug. Reagenset er lysfølsomt og skal derfor opbevares i en mørk eller foliedækket beholder Bland: 90 ml demineraliseret vand 10 ml 10x PBS 10 ml HRP color detection reagent A 0,6 ml HRP color detection reagent B Fordel farvereagensen i 8 foliedækkede reagensglas. Der skal være 10 ml i hvert reagensglas Primært antistof 1. Fremstil først en 200x stamopløsning* af det primære antistof ved at tilsætte 0,5 ml vaskebuffer til det frysetørrede anti-myosin light chain antibody (antistof). Luk beholderen og ryst. 2. Mærk 8 14 ml s rør PA (for primært antistof) 3. Bland 0,5mL af 200x stamopløsningen med 100mL blokker. Bland godt 4. Fordel det primære antistof med 10 ml til hvert af de mærkede 14 ml s rør. Sekundært antistof 1. Fremstil først en 200x stamopløsning* af det sekundære antistof ved at tilsætte 0,5 ml vaskebuffer til det frysetørrede goat anti-mouse-hrp secondary antibody (antistof). Luk beholderen og ryst. 2. Mærk 8 14 ml s rør SA (for sekundært antistof) 3. Bland 0,5mL af 200x stamopløsningen med 100mL blokker. Bland godt 4. Fordel det primære antistof med 10 ml til hvert af de mærkede 14mL s rør. Materiale til hver gruppe Blokker (hvis membranen ikke allerede er blokket) Primært antistof Sekundært antistof HRP color detection substrat, farvesubstrat 25 ml 10 ml 10 ml 10 ml

12 12 Vaskebuffer 200 ml Demineraliseret vand 100 ml Kar til inkubering 1 Beholder til affaldsvæske 1 Fælles: Rystebord/vippebord Analyse af immunoblottingen På figuren nedenfor ses, hvordan resultatet ser ud dels af en immunoblotting af en ufarvet gel og dels af en gel farvet med Coomassie blå. Spiret med kaleidoskopstandarden ses i den ene side og det enkelt fremtrædende bånd er den lette myosinkæde. Der kan også forekomme mindre og svagere bånd mellem 20 kd og 15 kd. Det drejer sig om myosins lette kæde nr. 2 et bånd der dog sjældent er synligt. Nogle proteinbånd vil også kunne ses som dobbeltbånd dette skyldes isoformer af de pågældende proteiners subunits. Særlige arter (fx muslinger) reagerer muligvis ikke med antistoffet. Tips og tricks Farvning af gelen eller ej? Hvis det er første gang, at eleverne skal lave en immunoblotting kan det pædagogisk set være en god ide, først at farve gelerne med Coomassieblå og dermed se alle de forskellige bånd inden man ved hjælp af antistoffer begynder at lede efter ét bestemt protein. Ekstra bånd Selvom man tilsætter DTT til laemmlibufferen kan der af og til opstå ekstra bånd på nitrocellulosemembranen. Det kan skyldes at man enten ikke har fået varmet muskel ekstraktet op til 95 oc eller at der er taget et for stort stykke muskel. For at undgå disse ekstra bånd anbefales det derfor kun at sætte 5 µl på gelerne, når man skal blotte straks efter elektroforesen. Der forekommer lodrette linjer, når der farves Disse lodrette linjer kan skyldes, at der er mikroskopiske muskelrester i skruelågsrørene. Det anbefales derfor at skruelågsrørene centrifugeres efter opvarmningen og før prøverne sættes på gelen. Man kan hverken se kaleidoskopstandarden eller nogle bånd på membranen efter blotting Årsagen til dette kan skyldes flere ting: a)sandwichen er ikke samlet korrekt, b) kassetten er ikke sat korrekt i mini-trans-blotmodulet, c)låget er blevet sat forkert på elektroforesekarret eller d) ledningerne er forbundet forkert til strømforsyningen.

13 13 Man kan se kaleidoskopstandarden, men ingen bånd Den mest tænkelige forklaring på dette problem er at farvesubstratet har været eksponeret for lys og er blevet ødelagt. (Substratet bliver brunt, når det ødelægges). Der er små huller i båndene Skyldes at der har været små luftbobler i systemet. Båndene er buede Skyldes lækage i bufferen ved selve elektroforesen. Sørg derfor altid for at tjekke for evt. lækage før elektroforesen startes. Svage bånd Kan undgås ved at lade inkuberingen med såvel det primære antistof som det sekundære antistof vare så lang tid som muligt.

14 14 ELEVVEJLEDNING Lektion 1: Ekstraktion af muskelproteiner: 1. Mærk et 1,5 ml mikrocentrifugerør og et skruelågsrør for hver af de fisk, der skal undersøges. Mærk eventuelt skumholderen, så du kan huske, hvor hvilket rør sidder. 2. Tilsæt 250 µl Laemmli prøvebuffer til hvert af de mærkede mikrocentrifugerør. 3. Skær en tern, 2,5mm på hver led, fiskekød ud af hver fisk og put dem i hvert af de mærkede mikrocentrifugerør. Luk rørene. 4. Knips ca. 15 gange på røret for at få buffer og kød til at blandes. Knipsen på rørene er også med til mekanisk at ødelægge kødet. 5. Lad rørene inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur. Herved ekstraheres og opløses proteinerne i bufferen 6. Hæld forsigtigt bufferen fra hvert mikrocentrifugerør over i det tilhørende skruelågsrør. Undgå at overføre fiskekødet. Skru låget på 7. Stil skruelågsrørene i varmebad ved 95 o C i 5 minutter. Ved opvarmningen denatureres proteinerne og gøres dermed klar til elektroforesen 8. Lad prøverne stå ved stuetemperatur, hvis der umiddelbart skal fortsættes med elektroforese og gå videre til punkt 9. Hvis elektroforesen først skal laves på et senere tidspunkt kan prøverne opbevares ved -20 o C i adskillige uger. Lektion 2: Proteinelektroforese Hvis dine fiskeproteinprøver har været i fryseren opvarmes de ligeledes i 2-5 minutter. 9. Såfremt aktin/myosin standarden (AM) ikke er frisk fremstillet opvarmes den i vandbadet i 2-5 minutter.

15 Saml det lodrette elektroforesekar med gelerne i. Lad læreren demonstrere og følg derefter tegningen: Først klargøres gelen: Skær med en skalpel langs den sorte linie med teksten cut i bunden af gelen. Træk derefter i slippen pull således, at bundplaststrimlen fjernes. Sæt de to geler fast i den inderste gelholder med de mindste plader ind mod midten af karret. Vær sikker på at gelerne er helt i bund. Sæt gelholderen i inderkarret og luk med vriderne. Placer inderkarret i selve elektroforesekarret. Skal der kun køres en gel sættes erstatningspladen i der, hvor den anden gel skulle have været placeret. 11. Tjek at karret er samlet korrekt, så det ikke lækker. Fyld det indre kammer med elektroforesebuffer til et stykke op over toppen af den mindste plade (ca. 150 ml). Træk derefter meget forsigtigt kammen op. Dette skal ske helt lodret. Fyld derefter 200 ml elektroforesebuffer i det ydre kammer. Tjek at systemet ikke lækker. Lækker det alligevel, kan man fylde det ydre kammer op med elektroforesebuffer til de to vandstande står lige højt Placer prøvepåsætningshjælperen over gelerne 12. Noter, hvad der skal puttes i hver brønd Brønd Volumen Prøve 1&2 tomme Tomme 3 5 µl Kaleidoskopstandarden (K) 4 5 µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Aktin-myosinstandard (AM) 10 tom tom

16 I brønd nr. 3 påsættes 5 µl kaleidoskopstandarden. Dette skal gøres meget langsomt, da prøven ellers ikke falder korrekt ned i brønden. 14. Sæt prøverne på som angivet i skemaet nedenfor. Roligt håndelag og stor tålmodighed er nødvendigt. Der skal skiftes pipettespids imellem hver prøve. Hvis der skal fortsættes med immunoblotting tilsættes der 5 µl til hver brønd ellers 10 µl 15. Tag en ny spids og tilsæt 5 µl af AM til brønd nr Fjern prøvepåsætningshjælperen. Tilslut elektroforeseapparatet til strømforsyningen. Kør gelen ved 200V i 30 minutter. Hold øje med kaleidoskopstandarden. Da alle prøverne er farvede kan elektroforesen følges flot og illustrativt. Lad ikke den blå linje (farven i laemllibufferen) køre længere end til bunden af gelen 17. Sluk strømforsyningen og tag ledningerne ud. Løft låget af og tag elektrodedelen ud. 18. Hæld elektroforesebufferen fra og tag gelen/gelerne ud 19. Det bedste er at gå videre med immunoblottingen straks efter elektroforesen. Hvis der ikke er mulighed for dette farves gelerne med coomasieblå for derved at fiksere og stabilisere proteinerne i gelen i op til 24 timer. Alternativt kan gelerne opbevares i deres kassette 24 timer i køleskabet. Derved vil myosinbåndene dog blive tykkere og mere utydelige, idet proteinerne vil diffundere ud i gelen. Gem 50 ml af elektroforesebufferen til næste lektion. 20. Gelen afmonteres og lægges på bordet med den lille plade opad. Skær tapen væk ved at skære med fast hånd i den lodrette hvide tape langs siderne og vrid forsigtigt den ene plade væk. Gelen hænger oftest fast på den ene af pladerne. Gelen skylles nu i et passende kar med vand for at vaske overskydende buffer væk. Skyl to eller eventuelt tre gange. Pas på, for nu glider gelen let af pladen. 21. Hæld vandet fra og tilsæt 50 ml Coomassie farve pr 2 geler. Farvestoffet binder sig til proteinerne. Lad gelen farve i 1 time. Vip forsigtigt ind imellem 22. Hæld farven fra og fyld karret med postevand. Bemærk farven kan genbruges, ellers skal den bortskaffes med kemikalieaffald. Vip og hæld vandet fra. Gentag skylningen 2-4 gange. Efter ca minutter vil båndene kunne ses. Båndene vil stå tydeligere, hvis gelen ligger i vand natten over. Tag et digitalt billede af gelen og brug fx LoggerPro s software til at analysere gelen.

17 17 Lektion 3: Immunoblotting/Western blotting Om immunoblotting I denne del af forsøget benyttes der antistoffer til at identificere bestemte proteiner, her den lette kæde i myosinmolekylet. For at kunne foretage selve denne immunoblotting flyttes proteinerne nu væk fra gelen og over på nitrocellulosemembranen. Membranen er mere stabil og holdbar end gelen og desuden mere modtagelig for antistofferne. Det antistof, der skal benyttes til at identificere myosinmolekylet er specielt designet dertil og er et såkaldt monoklonalt antistof. Inden behandlingen med antistof dækkes hele membranen med en skummetmælksblokker, dvs. en proteinrig blanding, her skummetmælkspulver, som fylder alle steder på membranen, der ikke er fyldt ud med proteiner fra gelen, ud. Membranen er herefter klar til at blive behandlet med det monoklonale antistof, det primære antistof, der er designet til at binde sig til myosin. Efterfølgende vaskes membranen let og der tilføres et sekundært antistof som er bundet til et enzym, der kan reagere med et substrat og derved fremkalde en farve. Farven viser kun de steder, hvor der er myosin. Se figuren: Nitrocellulosemembranen Nitrocellulosemembranen er let at håndtere og resultatet vil vise tydeligt farvede bånd på en hvid baggrund. Det er vigtigt, at der benyttes handsker, så der ikke afsættes proteinfingeraftryk på membranen. Brug evt. en pincet når der skal holdes på membranen.

18 18 Blottingpapiret Der benyttes to ark filterpapir/blottingpapir ved selve blottingen. Disse beskytter fiberpuderne fra direkte berøring med membranen men er samtidig med til at sikre en mere jævn blottingproces. Blottingpapiret er fremstillet af 100% bomuldsfibre og indeholder dermed ingen komponenter, der kan påvirke resultatet. Fiberpuderne Fiberpuderne er med til at sikre, at nitrocellulosemembranen og gelen kan presses tæt sammen under blottingen. Samtidig kan fiberpuderne hjælpe med at fjerne eventuelle luftbobler. Skyl fiberpuderne grundigt med demineraliseret vand før brug! Blokkeren Hvis ikke man benytter en blokker før immunoblottingen, kan man risikere, at det primære antistof binder sig til tilfældige ledige pladser på membranen og dermed forvirrer resultatet, dvs. laver svage farvereaktioner på uønskede positioner. Klargøring til blottingen Før man kan gå i gang med selve blottingen skal gelen gøres klar. Overskydende SDS fjernes ved at skylle gelen i blottingbuffer. Når man derefter er klar til blottingen samles sandwichen med fiberpuder, blottingpapir, gel og nitrocellulosemembran som vist på figuren nedenunder. Det er meget vigtigt, at der ikke er nogen luftbobler mellem blottingpapiret, gelen og membranen, idet eventuelle bobler vil forhindre proteinoverførslen. Det er derfor en god ide, hver gang man har lagt et nyt lag på sandwichen, at rulle fx en rund blyant eller et reagensglas hen over laget og dermed skyde eventuelle luftbobler ud. Til sidst klemmes sandwichen sammen i den kassette, der skal bruges til selve blottingen. For at blottingen kan køre rigtigt er det vigtigt, at den sorte kant på kassetten vender nedad. Hele kassetten sænkes nu ned i blottingbufferen i tanken med den klare plastikside mod den røde elektrode og den sorte side mod den sorte. Ligesom ved elektroforesen vil de negativt ladede proteiner nu bevæge sig mod den positive elektrode og dermed over på membranen.

19 19 Hvad skal vi bruge: Blottingbuffer 500 ml Blotting papir 2 Nitrocellulosemembran 1 Frossen Bio-Ice unit 1 pr. 2 grupper Rulle (fx en rund blyant, et reagensglas e.l.) 1 Blød blyant 1 Beholdere til at samle gel og membran i 2 Blokker 25 ml Fælles: Mini Trans-blot enhed Rystebord/vippebord Strømforsyning Sådan gør vi: 1. Klargøring af gelen: Ved ufarvet gel: Fjern gelen fra kassetten og læg den fladt på bordet med den mindste plade opad. Med fingerspidserne adskilles de to plader forsigtigt. Normalt vil gelen stadig hænge fast på den ene plade. eller Ved farvet gel: Inkuber gelen 15 minutter i elektroforesebufferen fra forrige modul. (Der sker ikke noget, hvis der inkuberes i længere tid). 2 For begge geler: Tag en lineal eller et plastikkort e.l. og skær forsigtigt brøndene og den øverste del af gelen lige over brøndene væk. På tilsvarende vis skæres den kant væk, der er nedenfor det blå bånd, som laemmlibufferen har dannet. Hvis gelen brækker samles den igen. Gelen ekvilibreres: Læg gelen over i et lille kar med blottingbuffer. Hvis gelen stadig sidder fast på pladen løsnes den derfra. Lad gelen ligge i blottingbufferen i mindst et kvarter, mens du gør klar til blottingsandwichen. 3. Gennemblød fiberpuderne grundigt med blottingbuffer 4. Med en blyant skrives gruppens navn i hjørnet af nitrocellulosemembranen. Fugt blottingpapiret og nitrocellulosemembranen i blottingbuffer.

20 20 5 Blottingsandwichen laves. Gel-holder Fiberpude Filtrerpapir Nitrocellulosemembran Gel Filtrerpapir Fiberpude Katode i. Hæld så meget ekstra blottingbuffer i karret så plastikholderen kan være der. Placer kassetten i karret med den sorte side neddyppet i bufferen og den klare side udenfor bufferen, som vist på figuren. Filterpude Filtrerpapir Nitrocellulosemembran Gel Filtrerpapir Fiberpude ii. Læg et gennemvædet fiberpude på den sorte plastikkassette iii. Læg et stykke vådt blottingpapir ovenpå fiberpuden og rul eventuelle luftbobler væk. Sørg for at der er så meget buffer, at det lige akkurat dækker blottingpapiret. Væsken er med til at sikre at boblerne forsvinder iv. Placer nu gelen præcis ovenpå blottingpapiret. Fugt rulleren og rul forsigtigt over gelen, så eventuelle luftbobler fjernes! v. Placer nu forsigtigt den fugtede nitrocellulosemembran ovenpå gelen med den side, hvorpå I skrev gruppenavnet ned mod gelen. Undgå at bevæge membranen mere end højst nødvendigt, idet proteinerne vil begynde at bevæge sig i samme øjeblik, de kommer i kontakt med membranen. Rul igen over membranen for at fjerne eventuelle luftbobler. Det er meget vigtigt, at der ikke er luftbobler mellem membran og gel. vi. Læg det andet stykke blottingpapir ovenpå membranen og fjern eventuelle luftbobler. vii. Læg den anden gennemvædede fiberpude ovenpå viii. Fold den klare del af plastikkassetten ned over sandwichen og saml den. Hold hele tiden sandwichen delvist nedsunken i blottingbufferen.

21 21 6. Klargøring af mini-transblotapparatet: i. Placer det rød-sorte mini-trans-blotmodul i elektroforesekarret med den sorte side i midten af tanken og med bananstikkene stikkende op i midten. ii. Placer den frosne Bio-Ice enhed i karret iii. Lad kassetten med sandwichen glide på plads i minitrans-blot-modulet, idet de to sorte sider skal vende i samme retning. Der kan være to sandwich i et kar og begge sandwich skal vende den sorte side mod modulets sorte side og tilsvarende de klare sider mod blottingmodulets røde side Det er vigtigt at alt placeres korrekt ellers vil blottingen ikke finde sted. iv. Fyld karret op med blottingbuffer til den hvide klips. Kig efter en gang til for at forsikre ser om, at de sorte sider vender mod den sorte side af minitrans-blot-modulet og at Bio-Ice n er på plads. v. Læg låg på karret 7. Blottingen startes: Tilslut karret til strømforsyningen og tænd strømmen. Ufarvede geler kører i 2½ time ved 20V Farvede geler kører i 15 timer ved 20V 8. Straks efter at immunoblottingen er færdig går man videre med behandlingen med antistof. Alternativt kan man lade blotting modulet stå natten over ved stuetemperatur eller man kan tage sandwichen ud og placere den i blokker natten over i køleskabe. Endelig er der mulighed for at opbevare blottet i blottingbuffer eller vaskebuffer i op til en uge i køleskab.

22 22 Lektion 4: Reaktion med antistof I denne del af forsøget vil vi finde et bestemt protein ved hjælp af et specifikt antistof. Hvad skal vi bruge: Blokker (hvis membranen ikke allerede er blokket) 25 ml Primært antistof 10 ml Sekundært antistof 10 ml HRP color detection substrat, farvesubstrat 10 ml Vaskebuffer 200 ml Demineraliseret vand 100 ml Kar til inkubering 1 Beholder til affaldsvæske 1 Fælles: Rystebord/vippebord Eventuelle handsker 1. Skil sandwichen ad husk rør kun ved kanten af nitrocellulosemembranen 2. Tag handsker på og se efter om den farvede kaleidoskopstandard er overført. Hvis ikke, sig da straks til, da det kan skyldes at blottingen ikke har fundet sted. 3. Læg membranen i et farvekar med 25 ml blokkingopløsning og med den synlige kaleidoskopstandard opad. Lad membranen ligge i blokkeren i 15 minutter ved stuetemperatur. Vip af og til eller brug vippebordet, hvis man har et sådant. Membranen kan også lægges i blokkeren og stilles i køleskab natten over. Bemærk membranen kan ikke overblokkes, men der kan opstå mikrobiel vækst, hvis det står for længe. 4. Hæld blokkingopløsningen fra 5. Tilsæt 10 ml anti-myosin primært antistof til karret på vippebordet og lad det vippe videre i minutter ved stuetemperatur eller natten over ved 4 o C Jo længere inkubering med antistof desto tydeligere bånd. Sørg for at der hele tiden er væske der vipper hen over membranen.

23 23 6. Hæld det primære antistof fra. 7. Tilsæt ca. 50 ml vaskebuffer og vip et par gange. Hæld vaskebufferen af. 8. Tilsæt 50 ml vaskebuffer og vip i 3 minutter. Der sker ikke noget ved at lade vaskeprocessen vare længere og har man brug for at afbryde eksperimentet midlertidigt kan man lade membranen stå i vaskebufferen i køleskabet til næste dag. 9. Hæld vaskebufferen fra 10 Tilsæt 10 ml sekundært antistof og vip i 5-15 minutter Jo længere inkubering med antistof desto tydeligere bånd. Sørg for at der hele tiden er væske der vipper hen over membranen. 11 Hæld det sekundære antistof fra. 12 Tilsæt ca. 50 ml vaskebuffer og vip et par gange. Hæld vaskebufferen af. 13 Tilsæt 50 ml vaskebuffer og vip i 3 minutter. Der sker ikke noget ved at lade vaskeprocessen vare længere og har man brug for at afbryde eksperimentet midlertidigt kan man lade membranen stå i vaskebufferen i køleskabet til næste dag.

24 24 14 Hæld vaskebufferen fra 15 Tilsæt 10 ml farvesubstrat, HRP color detection reagent, og vip I mindst 10 minutter indtil båndene fremkaldes. 16. Når båndene er tydelige hældes farvesubstratet fra og membranen skylles to gange med demineraliseret vand. Dup forsigtigt med køkkenrulle og lad membranen lufttørre i op til en time. Hvis der lufttørres i længere tid kan lyset bevirke at båndene fader og at membranen bliver gullig. Sæt membranen ind i en notesbog eller put den i en plastiklomme, der opbevares mørkt. Bemærk: membranen er skrøbelig, når den er tør. 17 Tegn gelen og båndene og beregn størrelsen af den lette myosin proteinkæde. Brug tabellen nedenfor: Kaleidoskopstandard Standardmasse (Farve) (kd) Blå 250 Lilla 150 Blå 100 Pink 75 Blå 50 Grøn 37 Pink 25 Blå 20 Blå 15 Gul 10

25 25 Proteinelektroforese vandret elektroforese Det er vigtigt at være opmærksom på, at der til elektroforese af proteiner skal benyttes en speciel høj-procents agarose, der samtidig har et lavt smeltepunkt fx # Gelen smelter ved 65 o C, men er den først smeltet forbliver den flydende ned til 34 o C. Gelen kan adskille meget små molekyler. For at få så god en molekyladskillelse som muligt er det vigtigt, at gelen er tynd. Den buffer der benyttes både ved fremstilling af gelen og som elektroforesebuffer er 1x Tris- Glycin-SDS (TGS)buffer. Vigtigt! Når man støber disse geler kan man ikke benytte sig af en mikrobølgeovn, idet opvarmning til kogning vil resultere i at SDS en, der er en detergent, får gelen til at skumme og dermed vil det være umuligt at støbe gode geler. Brug derfor et varmebad ved fremstilling af agarosegelen. Af andre ændringer kan nævnes: Elektroforesen skal køre i 45 minutter ved 100V højere spænding vil resultere i opvarmning af gelen, der derved vil smelte For ikke at få for udflydende bånd skal proteinerne fikseres i gelen straks efter elektroforesen. Fikseringen sker med 10% eddikesyre og 40 % ethanol. Ved fikseringen sker der en delvis præcipitation af proteinerne. Gelerne fikseres mindst 1 time, men kan også stå natten over. Farvningen af gelerne tager 2 timer eller man lader det stå natten over. Det tager længere tid, fordi gelerne er tykkere end polyacrylamidgeler Efter farvningen skal der skylles mindst 3-5 gange med vand! Blottingen skal også bruge længere tid! Da gelen er tykkere kan det være svært at lave sandwichen, hvor kapilærmetoden anbefales. Lærerens forberedelse til 2. Lektion (vandret elektroforese): Støbning af geler ca. 3 timer Fremstilling af reagenser mm. ca. ½ time Materialer: 10x Tris-Glycin-SDS (TGS)= buffer Demineraliseret vand Specielt agarose Vandbad 95 o C Gelstøbningskar Kamme til karret Tape eller anden forsegling Eddikesyre Ethanol (95-100%) Laemmli samle buffer, 500 µl Aktin-myosin standard 500µg Kaleidoskopstandard Mikropipetter 1-20 µl Spidser 300mL 3,5 L 12 g 100 ml 400 ml 1 glas 1 glas 1 glas

26 26 Skruelågsrør Mikrocentrifugerør Fremstilling af 1x TGS-buffer Tris-glycin-SDS-bufferen leveres som en 10x stamopløsning. Der skal bruges 3L. De 3 L TGSbuffer fremstilles ved at blande 300 ml 10xTGS-buffer med 2,97 L demineralisreret vand. Bufferen opbevares ved stuetemperatur. Fremstilling af 4% low-melt agarosegel: Der bruges ml til en gel på 7x7cm og ml til en 7x10 cm gel. Der skal bruges 4g agarose per 100 ml TGS-buffer. Lav agaroseblandingen i en en konisk kolbe eller en BlueCap flaske. Ryst godt og stil derefter blandingen i et o C varmt vandbad. Ryst af og til. Når væsken er klar og der ikke længere er små bobler i afkøles blandingen til ca. 60 o C og gelerne støbes. Hav tålmodighed! Det tager oftest 2-4 timer at få agarosen ordentligt opløst i TGS-bufferen. Støbning af gelerne: Forsegl karrets ender Placer kammen (eller kammene ved dobbeltgeler) korrekt Sørg for at karret står vandret Køl agaroseblandingen til 60oC Hæld agarosen op gelen skal være 3-5 mm tyk. Tyndere geler giver bedst resultat Lad gelen størkne ved stuetemperatur i minutter Stil ikke gelen i køleskab, da SDS en derved vil doffundere ud af gelen Fjern kammen og endernes forsegling Skal gelerne opbevares eksempelvis til næste dag gøres dette ved stuetemperatur og med gelen dækket af TGS-buffer. Hvis de ikke er dækket af buffer vil de hurtigt tørre ud og krakelere. Fremstilling af fikseringsvæske Bland 500 ml med 100 ml eddikesyre og 400 ml denatureret sprit. Aktin og myosinstandarden. Tilsæt 500 µl Laemmli buffer til det lille glas med den frysetørrede aktin-myosin standard og opløs proteinerne. Lad glasset stå i 5 minutter ved stuetemperatur. Overfør hele aktin-myosin standarden til et mærket skruelågsrør og stil det i vandbadet ved 95 o C i 5 minutter. Mærk 8 1,5 ml skruelågsrør AM og fordel 10 µl aktin-myosinstandard til hvert rør eller hav standarden klar ved et fællesbord, hvorfra en fra hver gruppe kan afpipettere den nødvendige mængde. Den klargjorte aktin-myosinstandard kan opbevares i op til 12 måneder ved -20 o C. Kaleidoskopstandarden Mærk 8 1,5 ml mikrocentrifugerør med K og fordel 6 µl Kaleidoskopstandard til hvert rør Klargør lokalet og gruppebordene Materialer til hver gruppe: Muskelekstrakt fra 1. lektion 5 rør pr. gruppe

27 27 Aktin-myosinstandard 10 µl 1 Kaleidoskopstandard 6µL 1 4% low-melt agarosegel 1 TGS-buffer 300 ml Mikropipette 0-20 µl 1 Pipettespidser Affaldsbøtte til spidser mm. Holder til mikrocentrifugerørene Kar til gelfarvning Fælles: Elektroforesekar Strømforsyning Fikseringsvæske Coomassiefarve Vandbad på 95 o C Rystebord/vippebord Demineraliseret vand eller vandhanevand til affarvning Lektion 2: Proteinelektroforese vandret metode Hvad skal vi gøre: 1. Hent en gel eller støb en gel 2. Sæt elektroforeseappartatet op og placer gelen med brøndene vendt mod den sorte (negative) elektrode. Hvis kammen stadig sidder i, fjernes denne forsigtigt. 3. Hæld ca 275 ml TGS-buffer i elektroforeseapparatet sørg for at gelen er dækket af 1-2 mm TGSbuffer 4. Noter, hvad der skal puttes i hver brønd Brønd Volumen Prøve 1 20 µl Kaleidoskopstandarden (K) 2 20 µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Fiskeprøve µl Aktin-myosinstandard (AM)

28 28 5. Sæt låget på og start elektroforesen. Lad elektroforesen køre i 45 minutter ved 100V. Tjek at farven og dermed prøverne bevæger sig mod den positive pol. 6. Når eletroforesen er færdig slukkes for strømmen, stikkene tages ud og låget løftes af. 7. Flyt forsigtigt gelen over i et kar. Pas på gelen glider nemt af! 8. Tilsæt 100 ml fikseringsvæske og stil gelen til fiksering i mindst 1 time eller allerbedst natten over. Vip ind imellem eller benyt et vippebord. 9. Hæld fikseringsvæsken fra og tilsæt så meget Coomassiefarve, at gelen er dækket. Lad gelen farve i mindst 2 timer eller natten over. Vip ind imellem eller benyt et vippebord. 10. Når gelen er farvet affarves med postevand mindst 3 gang. Lad gelen stå og skift af og til vandet. Båndene vil langsomt dukke op muligvis først rigtig tydeligt næste dag

29 29 Alternativ Western blotting/immunoblotting kapillærmetoden Såfremt man ikke har rådighed over en immunoblottingenhed er det muligt at foretage en immunoblotting ved hjælp af kapillærkræfterne. Ved kapillærbevægelser bevæger blottingbufferen sig op gennem vægen, gelen, nitrocellulosemembranen og ind i stakken af papirhåndklæder. Bufferen trækker samtidigt proteinerne med og når proteinerne støder på nitrocellulosemembranen, bindes de til denne. Tips: Sørg for at bufferen bevæger sig ordentligt igennem gelen og nitrocellulosemembranen før den absorberes af det filtrerpapir, der ligger over gelen og membranen. Dette kan sikres ved, at der laves en vandtæt barriere rundt om gelens kanter af eksempelvis plastik eller gummistrimler, hvorved de to lag af filtrerpapir ikke kan røre hinanden direkte. Blottingpapir 1(nederste filtrerpapir) og blottingpapir 2 (den øverste filtrerpapir) må med andre ord ikke røre hinanden. Sørg for et kontinuerligt flow igennem gelen; det vil sige at det kan blive nødvendigt undervejs i processen løbende at efterfylde med blottingbuffer og/eller udskifte de våde papirhåndklæder med nye tørre Det er af afgørende betydninger, at der ikke er luftbobler mellem gelen og nitrocellulosemembranen, da disse vil forhindre bevægelsen og give fejl. Skal der blottes to geler er det vigtigt, at de placeres ved siden af hinanden, idet der derved skabes et bredere fundament, som giver en mere stabil stakning. Efterhånden som papirhåndklæderne suger bufferen op bliver stakken mere og mere ustabil. Det er derfor en god ide, at stabilisere stakken ved at tape rundt om vægten/loddet og bunden. For at undgå at bufferen fordamper fra kammeret kan dette eventuel dækkes af plastikfilm. Materialer 10x Tris-glycin buffer 10x PBS 10% Tween 20 Tørblokker/skummetmælkspulver Denatureret sprit Demineraliseret vand Fremstilling af blotting buffer 1x Tris-glycinbuffer med 20% ethanol: Bufferen bruges i buffertanken, når der blottes. Bland: 7 L Demineraliseret vand 1 L 10x Tris-glycin 2 L ethanol (der kan også benyttes methanol eller isopropyl, hvis man ikke har ethanol) Den færdige buffer kan opbevares ved stuetemperatur eller i køleskab i op til 6 måneder

30 30 Fremstilling af blokker 5% tørblokker, dvs. Skummetmælkspulver, i vaskebuffer: Blokkeren bruges til at blokere ledige pladser på nitrocellulosemembranen og til at fortynde antistofferne. Bland: 359 ml demineraliseret vand 40 ml 10x PBS 1 ml 10% Tween 20 20g dry blocker (tørblokker/skummetmælkspulver) Tjek at tørblokkeren er fuldstændig opløst før blokkeren bruges. Den færdige blanding kan opbevares i op til 48 timer i køleskab. Ved længere tids opbevaring er der risiko for mikrobiel vækst. Materiale til hver gruppe: Blotting buffer Blottingpapir/tykt filtrerpapir Nitrocellulosemembran Papirhåndklæder Væge fx lavet af et stykke tykt filtrerpapir, der kan dækkebunden og nå bufferkammeret Plastikbarrierer fx plastikfilm eller gummistrimler Stor beholder Bund fx et farvekar med bunden i vejret Vægt/lod 500g 1 kg Ruller Blød blyant Tape Blokker Sådan gør vi: 1. Klargøring af gelen: Ved ufarvet gel: Fjern gelen fra kassetten og læg den fladt på bordet med den mindste plade opad. Med fingerspidserne adskilles de to plader forsigtigt. Normalt vil gelen stadig hænge fast på den ene plade. eller Ved farvet gel: Inkuber gelen 15 minutter i elektroforesebufferen fra forrige modul. (Der sker ikke noget, hvis der inkuberes i længere tid). 2 For begge geler: Tag en lineal eller et plastikkort e.l. og skær forsigtigt brøndene og den øverste del af gelen lige over brøndene væk. På tilsvarende vis skæres den kant væk, der er nedenfor det blå bånd, som laemmlibufferen har dannet. Hvis gelen brækker samles den igen.

31 31 Gelen ekvilibreres: Læg gelen over i et lille kar med blottingbuffer. Hvis gelen stadig sidder fast på pladen løsnes den derfra. Lad gelen ligge i blottingbufferen i mindst et kvarter, mens du gør klar til blottingsandwichen. 3. Gennemblød fiberpuderne grundigt med blottingbuffer 4. Med en blyant skrives gruppens navn i hjørnet af nitrocellulosemembranen. Fugt blottingpapiret og nitrocellulosemembranen i blottingbuffer. 5. Gennemvæd to stykker blottingpapir/tykt filtrerpapir og nitrocellulosemembranen i blottingbufferen. Se på figuren og byg blottingsystemet op Vægt Papirhåndklæder Filtrerpapir Nitrocellulosemembran Gel(er) Plastikbarrierer Filtrerpapir Væge Buffertank Bund

32 32 6. Stil bunden i beholderen og hæld 2-3 cm buffer i således at bufferkanten stopper ca. 0,5 cm fra bundens kant. 7. Gennemvæd vægen og placer den over bunden med enderne ned i bufferen. Vægens rolle er at sikre at der suges buffer op gennem gelen og nitrocellulosemembranen. 8. Læg et stykke gennemvædet blottingpapir/filtrerpapir oven på vægen. Sørg for at der ikke er nogen luftbobler. 9. Læg nu forsigtigt gelen oven på filtrerpapiret og fjern eventuelle luftbobler ved at rulle forsigtigt oven på gelen. Hold gelen våd det letter arbejdet. 10. Placer en plastikbarriere rundt om gelen. Alt det af vægen og blottingpapiret/filtrerpapiret, der ikke er dækket af gelen skal være dækket af plastik. 11 Gennemvæd nu nitrocellulosemembranen i blottingbuffer og placer den præcis oven på gelen. Fjern eventuelle luftbobler 12. Gennemvæd et nyt stykke filtrerpapir og placer det oven på nitrocellulosemembranen. Fjern eventuelle luftbobler. 13. Læg tørre papirhåndklæder ovenpå. Læg vægten på og tape stakken sammen for at sikre den mod at vælte. 14. Blottingprocessen skal nu køre i to dage. Husk at fylde blottingbuffer på når det er nødvendigt og husk at udskifte de gennemvåde papirhåndklæder med nye tørre. Undgå at ødelægge eller røre blottingpapiret 15. Straks efter at immunoblottingen er færdig går man videre med behandlingen med antistof (lektion 4). Alternativt kan man lade blotting modulet stå natten over ved stuetemperatur eller man kan tage sandwichen ud og placere den i blokker natten over i køleskab. Endelig er der mulighed for at opbevare blottet i blottingbuffer eller vaskebuffer i op til en uge i køleskab.

33 33 Resultatbehandling Benyt enten nedenstående traditionelle metode eller benyt et af de programmer, der i dag findes til efterbehandling af elektroforeser. Her kan eksempelvis nævnes softwaren til LabPro fra Vernier (Se sidst i dette dokument). Gelen kan måles op. Dvs. at man måler hvor langt de enkelte bånd har bevæget sig i millimeter fra påsætningsstedet. Dette kan fx gøres ved at tegne den af på følgende måde. Læg et ark OHP-plastik på gelen og tegn den af med en vandfast spritpen. Eventuelt kan I prøve at fotokopiere den. Det er også muligt at tørre gelen. Databehandling. Standarderne. Tegn en standardkurve som vist få figuren ved brug af de kendte masser af proteinerne i kaleidoskop-blandingen (tabel 2). Dette gøres ved at afsætte vandringslængden i mm ud af den lineære akse på semi-log papir og massen opad den logaritmiske akse. Tegn den bedste rette linie. Tabel 2:

34 34 Protein Farve Vægt Myosin Blå daltons β-galactosidase Magenta daltons Bovin serum albumin Grøn daltons Carbonsyre anhydrase Violet daltons Sojabønne trypsin Orange daltons Inhibitor Rød daltons Lysozyme Blå 7009 daltons Det er nu muligt at finde størrelsen af alle dine ukendte proteiner, ved at gå ind på kurven og aflæse massen udfor vandrings-længden. Af tabel 1 kan du nu komme med begavede gæt på hvilke proteiner de forskellige bånd indeholder. På grundlag af båndene i hvert spor skal du lave en tabel over størrelserne af proteinerne og hvilke proteiner det kunne være. Kan du finde ud af hvilke bånd der er aktin og hvilke der er myosin? Søg svaret i A/M-standarden. Reflektionsspørgsmål og diskussion: Hvad viser dit resultat om slægtskabet imellem de forskellige dyr? Er der nogle bånd som alle fiskearter har? Er der nogle bånd som kun en fiskeart har? Hvem har flest bånd fælles? næstflest osv. Opstil et stamtræ imellem arterne på baggrund af flest ligheder og sammenlign med stamtræet på figuren. Det kan være en fordel at sammenligne helhedsindtrykket af gelerne. Undersøgelse af geler fra elektroforese af DNA eller proteiner med LoggerPro software (Vernier) Formål: at analysere elektroforesen af DNA/proteiner og finde sammenhæng mellem vandringslængde og størrelsen. Fremgangsmåde: Gå ind i "insert" og importer et billede af en gel med farvede bånd. Billedet skal helst vise klare og tydelige bånd. Desuden skal der være påsat en standsard med kendte størrelser af båndene. 1. Gå ind under "page" og klik auto arrange. Nu vil billedet af gelen fint sidde ved siden af et koordinatsystem med DNA/protein-størrelsen som funktion af vandringslængden 2. Ved siden af koordinatsystemet ses en bjælke med forskellige funktioner. Først klikkes på den øverste knap og man kan sætte 0-linien, hvorfra man måler vandringslængden 3. Klik på næste knap og indstil skalaen ved at trække markøren fra 0-linien til det der svarer til 1 cm. Nu vil alle vandringslængder blive målt i cm. 4. Klik på tredie knap og indtast værdierne fra standarden. Dette gøres ved at klikke på et af de kendte bånd og indtaste størrelsen på DNA'et/proteinerne i kb eller kdalton. Punktet bliver nu indsat på grafen, med logaritmen til størrelsen som funktion af vandringslængden. 5. Dette gøres for alle båndene i standarden, og der fremkommer en graf der i forskellige områder er lineær.