COBAS AMPLICOR TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK.

Transkript

1 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test CT TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Bestillingsoplysninger AMPLICOR CT/NG CT/NG PREP 100 Tests P/N: Specimen Preparation Kit ART: US: AMPLICOR CT/NG CT/NG AMP 96 Tests P/N: Amplification Kit ART: US: COBAS AMPLICOR CT DK 100 Tests P/N: Chlamydia trachomatis ART: Detection Kit US: COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: Detection Reagents Kit ART: US: COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: Wash Buffer ART: US: Nedenstående kit kan bruges til detektion af neisseria gonorrhoeae i prøver, der er amplificeret ved hjælp af AMPLICOR CT/NG Amplification Kit. Detektion af neisseria gonorrhoeae er valgfrit for brugeren. COBAS AMPLICOR NG DK 100 Tests P/N: Neisseria gonorrhoeae ART: Detection Kit US: Nedenstående kit kan bruges til detektion af CT/NG-intern kontrol, der er amplificeret ved hjælp af AMPLICOR CT/NG Amplification Kit. Detektion af CT/NG-intern kontrol er valgfrit for brugeren ved test af urinprøver eller podeprøver, der er indsamlet i chlamydia-kulturtransportmedier. Detektion af intern kontrol er påkrævet ved test af podeprøver, der er indsamlet og transporteret ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection og Transport Kit. COBAS AMPLICOR IC DK 100 Tests P/N: Internal Control Detection Kit ART: US: Nedenstående kit kan anvendes til indsamling og transport af intracervikale og uretrale podeprøver. AMPLICOR STD STD SWAB 50 Tests P/N: Swab Specimen Collection and ART: Transport Kit US: /2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 1/35 P/N:

2 Tilsigtet brug COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis (CT) -testen er en kvalitativ in vitro-diagnosticering til bestemmelse af C. trachomatis-dna i kliniske prøver på COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. Testen anvender nukleinsyreamplifikationsmetoden PCR (Polymerase Chain Reaction) og nukleinsyrehybridisering til detektion af C. trachomatis i urogenitale prøver. Oversigt over og forklaring af testen Chlamydia er en gram-negativ, ikke-motil bakterie, der lever som obligate intracellulære parasitter i eukaryoter på grund af deres manglende evne til at syntetisere ATP. Chlamydia-slægten består af fire beskrevne arter: C. trachomatis, C. psittaci, C. pecorum og C. pneumoniae (TWAR). C. psittaci og C. pecorum er primært patogener hos dyr 1-3. C. trachomatis-infektioner betragtes nu som den næststørste årsag til seksuelt overførte sygdomme (STD) i verden med ca. 89,1 millioner tilfælde årligt. 4 I USA er der ca. 3 millioner tilfælde om året 5. C. trachomatis er kendt for at forårsage cervicitis, underlivsbetændelse (PID), infant conjunctivitis, infant pneumonia, urethritis, epididymitis og proctitis 1,6. C. trachomatis er også den mest almindelige årsag (ca % af tilfældene) til non-gonorroisk uretrit (NGU) hos mænd (ca. 55% af tilfældene). Konsekvenserne for chlamydia-infektioner hos kvinder er alvorlige, hvis de ikke behandles. Da ca. tre fjerdedele af disse infektioner er uden symptomer, opdages og behandles sygdommen i mange tilfælde ikke, hvilket fører til yderligere problemer hos især gravide kvinder. Børn født af chlamydia-smittede mødre har stor risiko for at udvikle indesluttet conjunctivitis og pneumoni. Der findes flere metoder til detektion af C. trachomatis i kliniske prøver. Metoderne omfatter direkte Giemsa-farvning af inficeret væv, detektion af indesluttede chlamydia-legemer i inficerede dyrkningsceller ved hjælp af fluorescerende antistoffarvning, direkte antigen-detektion ved hjælp af fluorescerende antistoffarve og nukleinsyreprober 1,7-9. Kulturen er meget specifik, men er mindre end 100% sensitiv, når den anvendes i klinisk praksis. Da chlamydia-dyrkning ikke er 100% sensitiv, er det blevet foreslået, at der bruges flere ikke-dyrkningstest for at identificere inficerede prøver, der ikke detekteres via dyrkning 10. Ikke-dyrkningstestmetoder bruges til at identificere organismedele (proteiner eller nukleinsyrer), der forventes at korrelere med smitsomme organismer. Disse metoder kan detektere yderligere positive prøver, der ikke detekteres via dyrkning. Da metoderne er mindre end 100% specifikke anbefales det at verificere C. trachomatis-antigenet eller nukleinsyren med en alternativ metode (handling anbefalet af CDC, 1993) 4. Principper for proceduren COBAS AMPLICOR CT-testen er baseret på fire hovedprocesser: Prøveforberedelse, PCR-amplifikation 11,12 af target-dna ved hjælp af CTspecifikke komplementære primere, hybridisering af de amplificerede produkter til oligonukleotide prober, der er specifikke for target, samt detektion af de probebundne, amplificerede produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. Udviklingen i en PCR-analyse omfatter identifikation af det bestemte område af target-dna, der skal amplificeres, og en syntese af to korte biotinylerede 2/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

3 Chlamydia trachomatis oligonukleotide primere, der er komplementære til de områder, der ligger ved siden af targetsekvensen. De biotinylerede primere bindes til det komplementære tilstødende område, og DNA-polymerasen udvider sekvensen i retningen 5' til 3' ved hjælp af overskydende deoxynukleosid trifosfater (dntp er) i reaktionsblandingen og danner derved en biotinyleret, komplementær DNA-sekvens, der kaldes et amplikon. En oligonukleotid probe, der er specifik for amplikonet, er bundet til en fast støtte (mikropartikler) og bruges til hybridisering (opfangning) af amplikonet. Detektionssystemet i analysen anvender et avidin/horseradish-peroxidasekonjugat (HRP), som bindes til det biotinylerede amplikon, der er opfanget af mikropartiklerne. Et brintoveriltesubstrat og tetramethylbenzidin (TMB)-kromofor bruges til at danne farve. COBAS AMPLICOR CT-testen er en multiplex-analyse, der tillader samtidig amplifikation af C. trachomatis-target-dna, Neisseria gonorrhoeae-target-dna og CT/NG-intern kontrol (CT/NG IC)-DNA. Master Mix-reagenset indeholder to biotinylerede primere, der er specifikke for C. trachomatis, N. gonorrhoeae og CT/NG IC Detektionen af N. gonorrhoeae-amplificeret DNA kan udføres, når brugeren vælger det. Detektionen af CT/NG-intern kontrol skal udføres ved test af podeprøver, der er indsamlet og transporteret ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection og Transport Kit Detektionen af CT/NG-intern kontrol kan udføres, når brugeren vælger det, ved test af urinprøver eller podeprøver, der er indsamlet og transporteret i chlamydia-kulturtransportmedier. Forberedelse af prøver PCR-amplifikation Urogenitale epitelceller, der er indsamlet via podeprøver eller pelleteret fra urin, behandles med en rensemiddelopløsning for at frigøre chlamydia-dna et i de retikulære chlamydia-legemer. En anden rensemiddelopløsning tilføjes derefter for at klargøre den lyserede prøve til amplifikation. Valg af target C. trachomatis indeholder ud over kromosom-dna et kryptisk plasmid-dna på ca basepar, der er almindelig for alle serotyper af C. trachomatis 13,14. COBAS AMPLICOR CT-testen bruger primerne CP24 og CP27 til at definere en DNAsekvens på ca. 208 nukleotider i det kryptiske plasmid-dna fra C. trachomatis. Targetamplifikation Behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen i amplifikationsrørene (A-rør), hvor PCR-reaktionen foregår. Reaktionsblandingen opvarmes for at adskille den dobbeltstrengede DNA-helix og vise den specifikke primers targetsekvenser på det kryptiske plasmid-dna fra C. trachomatis. Når blandingen afkøler, bindes de biotinylerede primere, CP24 og CP27, til target-dna et. Ved tilstedeværelsen af overskydende deoxynukleosid trifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin og deoxyuridin (i stedet for deoxythymidin) trifosfater, forlænger den termostabile Thermus aquaticus DNA-polymerase (Taqpol) de bundne primere langs targetskabelonerne for at producere et dobbeltstrenget DNA-molekyle på 208 basepar, der kaldes et amplikon. COBAS AMPLICORanalyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna teoretisk fordobles for hver cyklus. Intern kontrol-amplifikation I enzymbaserede amplifikationprocesser, som f.eks. PCR, kan effektiviteten reduceres af de inhibitorer, der kan forekomme i den kliniske prøve. CT/NGintern kontrol gør det muligt at identificere behandlede prøver, der indeholder 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 3/35

4 stoffer, som kan give interferens med PCR-amplifikationen. CT/NG-intern kontrol er et ikke-smitsomt, rekombinant DNA-plasmid med primerbindingsområder, der er identiske med dem i C. trachomatis-targetsekvensen, en randomiseret intern sekvens, der har samme længde og basesammensætning som C. trachomatis-targetsekvensen, samt et unikt probebindingsområde, der adskiller CT/NG-intern kontrol-amplikonet fra targetamplikonet. Disse funktioner er valgt for at sikre en ensartet amplifikation af CT/NG-intern kontrol- og C. trachomatistarget-dna et. CT/NG-intern kontrolreagensen medfølger i AMPLICOR CT/NG Amplification Kit og tilsættes hver enkelt amplifikationsreaktion og coamplificeres med target-dna fra den kliniske prøve. Det valgfri COBAS AMPLICOR Internal Control Detection Kit indeholder en IC-specifik oligonukleotid-opfangningsprobe, der kan bruges til at identificere et positivt ICsignal i reaktionsblandingen. CT/NG-intern kontrol er udviklet til at identificere prøver, der indeholder inhibitorer, som påvirker amplifikationen og detektionen af 20 eller flere kopier af C. trachomatis-targetnukleinsyre som er bestemt ved Poisson-analyse. Detektionen af CT/NG-intern kontrol kan udføres, når brugeren vælger det, ved test af urinprøver eller podeprøver, der er indsamlet og transporteret i chlamydia-kulturtransportmedier. Detektion af CT/NG-intern kontrol er påkrævet ved test af podeprøver, der er indsamlet og transporteret ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection og Transport Kit. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af targetnukleinsyren fra den kliniske prøve opnås i COBAS AMPLICOR CT-testen ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym og deoxyuridin trifosfat (dutp). AmpErase registrerer og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 15, men ikke DNA-strenge, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon på grund af, at deoxyuridin trifosfat bruges i stedet for deoxythymidin trifosfat som en af dntp erne i Master Mix-reagensen. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør forurenende amplikon modtagelig for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. AmpEraseenzym, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridinholdigt DNA ved deoxyuridin-resterne ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved basisk ph i Master Mix brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzym er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Efter amplifikation denatureres resterende enzym ved at tilsætte denatureringsopløsningen, hvilket forhindrer nedbrydningen af target-amplikoner. Det er påvist, at AmpErase-enzym i COBAS AMPLICOR CT Test deaktiverer mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdigt C. trachomatis-amplikon pr. PCR. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifikation tilsætter COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet automatisk denatureringsopløsning til A-rørene for at denaturere CT-amplikonet og CT/NG-intern kontrol-amplikonet kemisk. Derved dannes enkeltstrenget DNA. Aliquoter af denatureret amplikon overføres derefter til detektionskopper (Dkopper). En opløsning af magnetiske partikler, der er belagt med en oligonukleotid detektionsprobe for C. trachomatis (eller intern kontrol, når brugeren vælger det), tilsættes de enkelte D-kopper. Det biotinmærkede CT og CT/NG-intern kontrolamplikon hybridiseres til de targetspecifikke oligonukleotidprober, der er bundet til de magnetiske partikler. Hybridiseringen af amplikonet til den targetspecifikke probe øger den samlede specificitet for testen. 4/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

5 Chlamydia trachomatis Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen skyller COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet de magnetiske partikler i D-kopperne for at fjerne ubundet materiale og tilsætter derefter avidin/horseradish-peroxidasekonjugat. Avidin/horseradish-peroxidasekonjugatet bindes til det biotin-mærkede amplikon, der er hybridiseret af de targetspecifikke oligonukleotid-detektionsprober, der er bundet til de magnetiske partikler. COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet fjerner ubundet konjugat ved at skylle de magnetiske partikler og tilsætter derefter en substratopløsning, der indeholder brintoverilte og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) i hver D-kop. Ved tilstedeværelsen af brintoverilte katalyserer den partikelbundne horseradishperoxidase oxideringen af TMB for at danne et farvet kompleks for hvilket, der måles absorbans ved hjælp af COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet ved en bølgelængde på 660 nm. Reagenser AMPLICOR CT/NG CT/NG PREP 100 test P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR CT/NG prøveforberedelseskit US: CT/NG URINE WASH (CT/NG-urinvaskebuffer) Tris-HCl-buffer 300 mm natriumklorid < 0,1% rensemiddel 0,09% natriumazid CT/NG LYS (CT/NG-lysisreagens) Tris-HCl-buffer < 1% emulgator 0,09% natriumazid CT/NG DIL (CT/NG-prøvediluent) Tris-HCl-buffer 6 mm magnesiumklorid < 25% rensemiddel 0,05% natriumazid 1 x 50 ml 1 x 25 ml 2 x 50 ml AMPLICOR CT/NG CT/NG AMP 96 test P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR CT/NG amplifikationskit US: CT/NG MMX (CT/NG Master Mix) Tris-HCl-buffer EDTA 100 mm kaliumklorid Glycerol < 0,016% dutp < 0,01% AmpliTaq (Taq DNA-polymerase, mikrobiel) < 0,005% datp, dctp, dgtp < 0,01% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobiel) < 0,0004% SS01-, SS02-, CP24- og CP27-primere, biotinylerede 0,05% natriumazid 3 x 1,8 ml 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 5/35

6 CT/NG IC (CT/NG-intern kontrol) Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsom, rekombinant plasmid-dna (mikrobiel) indeholdende CT-primerbindingssekvenser og et unikt probebindingsområde < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA Amaranth-farve 0,05% natriumazid CT (+) C [C. trachomatis (+)-kontrol] Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsomt, rekombinant plasmid-dna (syntetisk) indeholdende C. trachomatis-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) < 0,5% rensemiddel EDTA 0,05% natriumazid NG (+) C [C. trachomatis ( )-kontrol] Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsomt, rekombinant plasmid-dna (syntetisk) indeholdende N. gonorrhoeae-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) < 0,5% rensemiddel EDTA 0,05% natriumazid 3 x 0,1 ml 1 x 0,8 ml 1 x 0,8 ml COBAS AMPLICOR CT DK 100 test P/N: Chlamydia trachomatis ART: Detection Kit US: COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis detektionskit CT PS1 (CT-probeopløsning 1) MES-buffer < 0,3% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er belagt med C. trachomatis-specifik oligonukleotid-opfangningsprobe (CP35) 0,9% natriumazid CT4 (CT-probeopløsning 2) Natriumfosfatbuffer 25% natriumthiocyanat < 0,2% emulgator + Xn 25% (w/w) natriumthiocyanat 1 x 100 test 1 x 100 test Sundhedsskadelig 6/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

7 Chlamydia trachomatis COBAS AMPLICOR DK 100 test P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR detektionsreagenskit US: DN4 (Denatureringsopløsning) 1,6% natriumhydroxid EDTA Thymolblå + Xi 1,6% (w/w) natriumhydroxid 1 x 100 test Lokalirriterende CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001% Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat Serumalbumin fra kvæg (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Phenol 1% ProClin 150 SB3 (Substrat A) Citratopløsning 0,01% brintoverilte 0,1% ProClin 150 SB (Substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T 40% (w/w) dimethylformamid (DMF) 1 x 100 test 5 x 75 test 5 x 5 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan skade barnet under graviditeten. Farlig ved indånding og ved hudkontakt. Irriterer øjnene. S: Undgå enhver kontakt - indhent særlige anvisninger før brug. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig; vis etiketten, hvis det er muligt. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 7/35

8 COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB (10X-skyllekoncentrat) < 2% fosfatbuffer < 9% natriumklorid EDTA < 2% rensemiddel 0,5% ProClin x 250 test Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnosticering. Udtrykket kopi refererer til 1 kopi af C. trachomatis-targetnukleinsyre i denne metodemanual. Én (1) kopi svarer til den mindste mængde C. trachomatistargetnukleinsyre, der kan generere et positivt PCR-testresultat. Denne test er kun beregnet til intracervikal-, uretral- og urinprøver. Testen er ikke beregnet til hals-, rektal- eller andre prøvetyper, end dem der er angivet. Undgå at pipettere med munden. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, kitler og sikkerhedsbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og reagenser. Undgå bakteriekontaminering af reagenser, når der fjernes aliquoter fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og pipettespidser. Reagenser fra forskellige lot eller fra forskellige flasker fra det samme lot må ikke blandes sammen. Reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Du kan rekvirere MSDS er (Material Safety Data Sheets) hos den lokale Rocheforhandler. Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i preamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation / detektion). Pre-amplifikationsaktiviteterne skal starte med klargøring af reagenser og fortsætte med klargøring af prøver. Beholdninger og udstyr skal være specielt beregnet til pre-amplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og beholdninger, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til forberedelse af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre target-dna-kilder. Beholdninger og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i postamplifikationsområdet. 8/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

9 Chlamydia trachomatis Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med laboratoriesikkerhedsprocedurer som dem, der er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 og i CLSI-dokument M29-A 17. Rengør grundigt og desinficer alle arbejdsflader med en nyfremstillet 0,5% natriumhypochlorit-opløsning i demineraliseret eller destilleret vand. Almindelig tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypochlorid med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% natriumhypochloridopløsning. Prøver, der er modtaget i laboratoriet med vatpinden bibeholdt i AMPLICOR STM, kan ikke godkendes til test. Disse prøver skal kasseres, og der skal indsamles en ny prøve. Prøver, der er indsamlet og transporteret ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection og Transport Kit kan muligvis inbibere PCR. Der skal udføres detektion af CT/NG-intern kontrol ved test af disse prøver. Podeprøver, der transporteres i kulturtransportmedier til Chlamydia, skal opbevares i transportrøret som visuel bekræftelse af prøvepodningen. COBAS AMPLICOR CT/NG-testen for Chlamydia trachomatis er evalueret ved hjælp af prøver, der er transporteret med podeprøven i Chlamydia-kulturtransportmedie (CTM)-røret. CTM-prøver, der transporteres uden podeprøver, er ikke evalueret og anbefales ikke til denne test. Opbevaring af urinprøver ved stuetemperatur i mere end 24 timer kan resultere i forringelse af prøverne. Urinprøver, der er opbevaret i mere end 24 timer ved stuetemperatur, må ikke bruges til test. CT/NG URINE WASH, CT/NG LYS, CT/NG DIL, CT/NG MMX, CT/NG IC, CT (+) C, NG (+) C, CT PS1 og IC PS1 indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. Brug beskyttelsesbriller, kitler og engangshandsker ved håndtering af DN4, CN4, SB3, SB og arbejdssubstrat (blandet SB3- og SB-reagens). Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Hvis der opstår kontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis det ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal du fortynde med vand, før de tørres op. Undgå kontakt mellem hud eller slimhinder og SB eller arbejdssubstratet. Hvis der opstår hudkontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. SB og arbejdssubstratet indeholder dimethylformamid, der er rapporteret som giftigt ved høje orale doser og kan virke fosterskadende. Undgå hudkontakt, indånding af dampe samt indtagelse. Hvis der opstår hudkontakt, skal du vaske grundigt med vand og sæbe samt straks søge læge. Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/35

10 Krav til opbevaring og håndtering Reagenser må ikke nedfryses. CT/NG LYS opbevares ved 2-25 C. CT/NG URINE WASH og CT/NG DIL opbevares ved 2-8 C. Hvis der dannes bundfald i disse reagenser under opbevaringen, skal de opvarmes til den omgivende temperatur og blandes grundigt før brug. Reagenserne kan holde sig til den angivne udløbsdato. CT/NG MMX og CT/NG IC opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Arbejds-Master Mix (forberedes ved tilsætning af CT/NG IC til CT/NG MMX) skal opbevares ved 2-8 C og kan holde sig i 4 uger. CT (+) C og NG (+) C opbevares ved 2-8 C. Reagenserne kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. CT PS1 og CT4 opbevares ved 2-8 C. Reagenserne kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Når først CT PS1 og CT4 er blandet, kan arbejdsreagensen holde sig i 30 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagensen kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. DN4 opbevares ved 2-25 C. DN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan DN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. DN4 kan anvendes i højest 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. CN4 opbevares ved 2-8 C. CN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan CN4-reagens holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. CN4 kan anvendes i højest 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. SB3 og SB opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil de angivne udløbsdatoer. Der skal forberedes arbejdssubstrat hver dag ved blanding af SB3 med SB. Arbejdssubstratet kan holde sig i 16 timer på COBAS AMPLICORanalyseinstrumentet. Udsæt ikke SB3, SB eller arbejdssubstrat for metaller, oxideringsmidler eller direkte lys. WB opbevares ved 2-30 C. WB kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Undersøg WB, og opvarm ved C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Arbejdsvaskebuffer (1X), der er forberedt ved 1:10 fortynding af WB med destilleret eller demineraliseret vand, skal opbevares ved 2-25 C i COBAS AMPLICOR-vaskebufferreservoiret og kan holde sig i 2 uger fra forberedelsesdatoen. Detektionsreagenser, der ikke er helt opbrugt, skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentkørsler. Kontroller udløbsdatoen på åbnede reagenser eller arbejdsreagenser, før de indsættes i COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. 10/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

11 Chlamydia trachomatis Medfølgende materialer AMPLICOR CT/NG CT/NG PREP P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR CT7NG prøveforberedelseskit US: CT/NG URINE WASH (CT/NG-urinvaskebuffer) CT/NG LYS (CT/NG-lysisreagens) CT/NG DIL (CT/NG-prøvediluent) AMPLICOR CT/NG CT/NG AMP P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR CT/NG amplifikationskit US: CT/NG MMX (CT/NG Master Mix) CT/NG IC (CT/NG-intern kontrol) CT (+) C [C. trachomatis (+)-kontrol] NG (+) C [C. trachomatis ( )-kontrol] COBAS AMPLICOR CT DK P/N: Chlamydia trachomatis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR US: Chlamydia trachomatis detektionskit CT PS1 (CT-probeopløsning 1) CT4 (CT-probeopløsning 2) COBAS AMPLICOR DK P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR detektionsreagenskit US: DN4 (Denatureringsopløsning) CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 11/35

12 COBAS AMPLICOR WB P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB (10X-skyllekoncentrat) Nødvendige, men ikke medfølgende materialer Indsamling af prøver Intracervikale og uretrale podeprøver: Brug kun vatpinde med dacron-, rayoneller kalciumalginatspidser med skafter af plastik eller ikke-aluminium. Chlamydia Culture Transport Media (Chlamydia-transportmedium eller CTM): Brug kun 2SP CTM, Bartels ChlamTrans CTM (Bartels, Inc.), SPG CTM eller M4 CTM (MicroTest, Inc.) Urinindsamlingskopper af polypropylen uden konserveringsmidler Pre-amplifikation Reagensklargøringsområde COBAS AMPLICOR-A-ring monteret med 12 A-rør (ART: ; P/N: ) Holder til COBAS AMPLICOR-A-ring Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Combitip -reservoir (steril, enkeltpakket) Pipetter (kapacitet 100 µl)* med aerosolfilter eller stempelspidser Vortex-mixer Engangshandsker, uden pulver Pre-amplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet 2,0 ml polypropylen-rør med skruelåg, sterile, ikke-silikoniseret, konisk (Sarstedt eller tilsvarende)** Glasrack (Sarstedt eller tilsvarende) Sterile overførselspipetter med målestreger Pipetter (kapacitet 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl og 1000 µl)* med aerosolfilter eller stempelspidser Mikrocentrifuge (maks. RCF x g, min. RCF x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller tilsvarende Forlængede aerosolfilterspidser (Matrix 7055 eller tilsvarende) til prøver, der transporteres i kulturtransportmedier til AMPLICOR STM, M4 eller Bartels ChlamTrans 37 C ± 2 C varmeblok Vortex-mixer Trækpapir Engangshandsker, uden pulver 12/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

13 Chlamydia trachomatis Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområdet COBAS AMPLICOR-analyseinstrument og printer Brugerhåndbog til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet Metodemanual til COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis-testen Rack med D-kopper (ART: ; P/N: ) Destilleret eller demineraliseret vand 5 ml serologiske pipetter Cylinder med målestreger (min. 1 liter) Vortex-mixer Engangshandsker, uden pulver * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolfilter eller stempelspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. ** Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver og kontroller. Brug ikke rør med snaplukning. Indsamling, transport og opbevaring af prøver Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. De eneste acceptable prøver er: 1. Urinprøver (fra mænd og kvinder), der transporteres i rene polypropylenbeholdere. Brug ikke urinprøver, der er indsamlet i beholdere, som indeholder konserveringsmidler. 2. Endocervikale og uretrale podeprøver, der er indsamlet ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection and Transport Kit. Der skal udføres detektion af CT/NG-intern kontrol ved test af disse prøver. 3. Endocervikale og uretrale podeprøver, der er indsamlet og transporteret i: 2SP Culture Transport Medium, Bartels ChlamTrans Chlamydial Transport Medium (Bartels, Inc), SPG CTM, M4 Culture Transport Medium (MicroTest, Inc.). Medielot skal være godkendt til brug i hvert laboratorium (se afsnittet Kvalitetskontrol for at få yderligere oplysninger). Følg instruktionerne om korrekt prøveindsamling nedenfor for at opnå pålidelige testresultater. Testen er ikke beregnet til hals-, rektal- eller andre prøvetyper, end dem der er angivet. For at sikre levering af prøver til testlaboratoriet i høj kvalitet, skal urinprøver og urogenitale podeprøver transporteres til laboratoriet så hurtigt som muligt. Prøver bør kun transporteres under kontrollerede temperaturforhold. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 13/35

14 Indsamling af prøver Urinprøver Patienten må ikke have urineret de sidste 2 timer. 1. Indsaml ml af første del af urinen (første del af strømmen) i en ren polypropylenbeholder uden konserveringsmidler. 2. Forsegl prøvebeholderen, og påsæt en etiket med de relevante oplysninger. Følg laboratoriets procedurer for indsamling og transport. Prøven kan transporteres til testlaboratoriet ved stuetemperatur C. Podeprøver indsamlet i AMPLICOR Specimen Transport Medium (STM) 1. Fjern mucus fra exocervix med en af de medfølgende store vatpinde, og kasser den. 2. Indfør den anden store vatpind i den intracervikale kanal, indtil spidsen af vatpinden ikke længere kan ses. 3. Rotér i 3-5 sekunder, træk vatpinden ud, og undgå kontakt med de vaginale overflader. 4. Placer podeprøven i AMPLICOR STM-røret, og ryst eller omrør vatpinden kraftigt i væsken i 15 sekunder. Der kan forekomme inhibering af PCR, hvis vatpinden forbliver i kontakt med STM i mere end 15 sekunder. 5. Fjern væsken fra vatpinden ved at presse vatpinden mod rørets sider. Eventuel overskydende mucus i prøven skal på dette tidspunkt fjernes ved hjælp af vatpinden. Fjern eventuel resterende væske fra mucus ved at presse vatpinden mod siden af røret. Fjern vatpinden med eventuel resterende mucus, og kasser den. Sæt låg på røret. 6. Forsegl prøvebeholderen, og påsæt en etiket med de relevante oplysninger. Følg laboratoriets procedurer for transport. Opbevar prøverne ved stuetemperatur, før de transporteres til laboratoriet. Podeprøver indsamlet i kulturtransportmedier (CTM) 1. Endocervikale og uretrale podeprøver kan indsamles og transporteres i 1-3 ml 2SP Culture Transport Medium, Bartels ChlamTrans Chlamydial Transport Medium (Bartels, Inc.), SPG Culture Transport Medium eller M4 Culture Transport Medium (MicroTest, Inc.). Brug de anbefalede metoder til prøvetagning af cervikale- og squamo-cervikale celler efter fjernelse af cervikal mucus Brug kun vatpinde med dacron-, rayon- eller kalciumalginatspidser med skafter af plastik eller ikke-aluminium. Brug ikke prøvevatpinde med træeller aluminimumsskafter. 3. Efterlad vatpindene i kulturtransportmediet. Forsegl prøvebeholderen, og påsæt en etiket med de relevante oplysninger. Følg laboratoriets procedurer for indsamling og transport. Nedkøl podeprøverne, hvis transporten til laboratoriet sker mere end én time efter prøveindsamlingen. 14/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

15 Chlamydia trachomatis Transport af prøver Urinprøver 1. Urinprøver kan transporteres til laboratoriet ved C. Urinprøver kan holde sig i 24 timer ved C. Urinprøver, der ikke skal behandles inden 24 timer efter prøveindsamlingen, skal opbevares ved 2-8 C og skal behandles inden 7 dage efter indsamlingen. Urinprøver, der ikke skal behandles inden 7 dage efter prøveindsamlingen, kan opbevares ved -20 C eller lavere og skal testes inden 30 dage efter indsamlingen. 2. Urinprøver, der kræver forsendelse til testcentre uden for laboratoriet, skal sendes med dag-til-dag-levering med garanti for ankomst inden 24 timer. Forsendelsen kan ske ved C. Hvis urinprøverne sendes ved C, skal de opbevares ved 2-8 C indtil afsendelsestidspunktet for at sikre, at opbevaringen ved C ikke overstiger 24 timer. Transport af prøver skal foregå i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 18. Podeprøver indsamlet i AMPLICOR Specimen Transport Medium (STM) 1. Podeprøver kan holde sig i 10 dage ved C. Podeprøver skal opbevares ved stuetemperatur og behandles inden 10 dage efter indsamlingen. 2. Podeprøver, der kræver forsendelse til testcentre uden for laboratoriet, skal opbevares ved stuetemperatur indtil forsendelsestidspunktet. De skal sendes ved stuetemperatur og skal ankomme til testlaboratoriet, så de kan blive behandlet inden 10 dage efter indsamlingen. Transport af prøver skal foregå i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 18. Podeprøver indsamlet i kulturtransportmedier (CTM) 1. Podeprøver kan transporteres til testlaboratoriet ved C, hvis den samlede opbevarings- og forsendelsestid ved C er mindre end 1 time. Nedkøl podeprøverne, hvis transporten til laboratoriet sker mere end én time efter prøveindsamlingen. 2. Podeprøver, der kræver forsendelse til testcentre uden for laboratoriet, skal sendes nedkølet hurtigst muligt efter indsamlingen i overensstemmelse med laboratoriets procedurer for transport af chlamydia-dyrkningsprøver. Transport af prøver skal foregå i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 18. Opbevaring af prøver Rutinemæssig nedfrysning eller længerevarende opbevaring af prøver kan påvirke funktionsevnen. Urinprøver 1. Urinprøver, der ikke skal behandles i løbet af 24 timer efter indsamlingen, skal opbevares ved 2-8 C og skal behandles inden 7 dage efter indsamlingen. Urinprøver, der ikke kan behandles inden 7 dage efter indsamlingen kan opbevares ved -20 C eller koldere i op til 30 dage. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 15/35

16 Podeprøver indsamlet i AMPLICOR Specimen Transport Medium (STM) 1. Podeprøver kan holde sig i 10 dage ved C. Podeprøver skal opbevares ved C og behandles inden 10 dage efter indsamlingen. 2. Podeprøver skal opbevares ved stuetemperatur indtil forsendelsestidspunktet. De skal sendes ved C og skal ankomme til testlaboratoriet, så de kan blive behandlet inden 10 dage efter indsamlingen. Podeprøver indsamlet i kulturtransportmedier (CTM) 1. Nedkøl podeprøverne, hvis transporten til laboratoriet eller prøvebehandlingen forsinkes i mere end én time efter prøveindsamlingen. Podeprøver, der kræver forsendelse til testcentre uden for laboratoriet, skal sendes hurtigst muligt efter indsamlingen i overensstemmelse med laboratoriets procedurer for transport af chlamydia-dyrkningsprøver. 2. Podeprøver, der ikke skal testes umiddelbart efter ankomst til testlaboratoriet, skal opbevares ved 2-8 C og skal behandles inden 7 dage. Podeprøver, der ikke kan behandles inden 7 dage efter prøveindsamlingen, skal opbevares ved -20 C eller koldere og skal testes inden 30 dage efter indsamlingen. Brugsvejledning Kørselsstørrelse Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få en detaljeret brugsvejledning. Alle reagenser skal have den omgivende temperatur før brug. Brug pipetter med aerosolfilter eller stempelspidser, når dette er angivet. Vær yderst forsigtig med at sikre selektiv amplifikation. Urin- og podeprøver skal have den omgivende temperatur før brug. Brug pipetter med aerosolfilter eller stempelspidser, når dette er angivet. Vær yderst forsigtig med at sikre selektiv amplifikation. Inhiberingen af PCR kan reduceres ved at opbevare de behandlede prøver natten over ved 2-8 C, før prøven tilsættes arbejds-master Mix 21. Der skal bruges rør med skruelåg til forberedelse af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. Hvert kit indeholder reagenser til to kørsler af 12 test, der kan udføres separat eller samtidigt. Hver testkørsel skal inkludere mindst én kopi af C. trachomatis (+)-kontrollen og én kopi af C. trachomatis ( )-kontrollen (se afsnittet Kvalitetskontrol ). NG (+)-kontrollen fungerer som CT ( )-kontrollen for COBAS AMPLICOR CT -testen. 16/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

17 Chlamydia trachomatis Prøveforberedelsesreagenserne er pakket til udførelse af 100 test. CT (+)- og NG (+)-kontrollerne leveres i enkeltstående flasker med tilstrækkeligt materiale til forberedelse af 8 sæt behandlede kontroller. CT/NG Master Mix og CT/NG-intern kontrol leveres i tre flasker, der hver indeholder tilstrækkeligt materiale til at foretage en kørsel med op til 32 test, inklusive prøver og kontroller. Den mest effektiv brug af reagenser, prøver og kontroller fås ved at behandle dem i batches, der kan ganges med 12. Arbejdsgang Reagensforberedelse COBAS AMPLICOR CT-testen kan udføres i løbet af én dag eller over to dage. Hvis testen skal afsluttes på en enkelt arbejdsdag, skal du følge instruktionerne under Reagensforberedelse, Prøveforberedelse, Kontrolforberedelse, Amplifikation og Detektion i rækkefølge. Testen kan udføres over 2 dage ved at starte med Prøveog kontrolforberedelse dag 1 efterfulgt af Reagensforberedelse, Amplifikation og Detektion dag 2. Testen kan også udføres ved at starte med Reagensforberedelse, Prøve- og kontrolforberedelse og tilsætte forberedte prøver og kontroller til Master Mix dag 1 efterfulgt af Amplifikation og Detektion dag 2. Udført i: Pre-amplifikation Reagensforberedelsesområdet 1. Fastlæg det relevante antal A-ringe, der skal bruges til testen af patientprøver og kontroller. Placer A-ringen(e) i A-ring-holderen eller -holderne. Selvom der ikke foretages detektion af CT/NG-intern kontrol, skal der tilsættes CT/NG IC til Master Mix. 2. Forbered arbejds-master Mix ved at tilsætte 100 µl CT/NG IC til ét rør med CT/NG MMX. Det er ikke nødvendigt at måle Master Mix-volumen. Tilsæt 100 µl CT/NG IC til hele flasken med CT/NG MMX. Sæt låg på røret, og bland godt ved at vende røret gange. Bland ikke arbejds-master Mix i en vortex-mixer. Den lyserøde farve i CT/NG IC bruges som visuel bekræftelse af, at CT/NG IC er blevet tilsat til CT/NG MMX. Kasser det resterende CT/NG IC. Bland godt ved at vende røret gange. Arbejds- Master Mix skal opbevares ved 2-8 C og anvendes højst 4 uger efter forberedelsen. 3. Tilsæt 50 µl arbejds-master Mix i hvert A-rør med en repetitionspipette eller en pipette med aerosolfilter- eller stempelspids. Luk ikke A-rør-lågene endnu. 4. Placer den eller de A-ring(e), der indeholder arbejds-master Mix, i en genlukkelig plastikpose, og luk posen omhyggeligt. Flyt A-ringen eller -ringene til Pre-amplifikation-prøveforberedelsesområdet. Opbevar A-ringen/-ringene med arbejds-master Mix ved 2-8 C i pre-amplifikation-prøveforberedelsesområdet, indtil forberedelsen af prøver og kontroller er fuldført. Arbejds-Master Mix kan holde sig i 48 timer ved 2-8 C i A-rør, der er lukket inde i plastikposen. Forberedelse af prøver Udført i: Pre-amplifikation Prøveforberedelsesområdet Urinprøver 1. Sæt en etiket på et 2,0 ml rør med skruelåg til hver patientprøve. Brug ikke rør med snaplukning. 2. Tilsæt 500 µl CT/NG URINE WASH til hver af de mærkede rør. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 17/35

18 3. Bland urinen grundigt (3-10 sekunder) i en vortex-mixer. Hvis der bruges frosne prøver, skal prøverne optøs til stuetemperatur, før de blandes i en vortexmixer (mængder på mere end 2 ml skal optøs natten over ved 2-8 C). Fortsæt behandlingen, selv om der forekommer bundfald. Fjern forsigtigt lågene fra beholderne med urinprøve. Undgå at kontaminere handskerne med urin fra låget. Hvis handskerne kontamineres, skal de udskiftes med nye, før der fortsættes til næste prøve. 4. Tilsæt 500 µl af hver patienturinprøve til det relevant mærkede rør med CT/NG URINE WASH. Brug en ny aerosolfilterspids til hver prøve. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. 5. Inkubér ved 37 C i 15 minutter. 6. Centrifuger ved x g i 5 minutter. 7. Hæld supernatanten ud, og tryk hvert rør af med et separat ark trækpapir. 8. Ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids til hver prøve tilsættes 250 µl CT/NG LYS til hvert rør. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. 9. Inkubér rørene i 15 minutter ved stuetemperatur. 10. Ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids til hver prøve tilsættes 250 µl CT/NG DIL til hvert rør. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortexmixer. 11. Centrifuger rørene i 10 minutter ved x g. 12. Behandlede prøver kan opbevares ved stuetemperatur i op til 2 timer, før der overføres aliquoter til A-rørene med arbejds-master Mix. De behandlede prøver skal opbevares ved 2-8 C, hvis der ikke tilsættes aliquoter til A-rørene inden 2 timer. Behandlede prøver, der opbevares ved 2-8 C, skal testes inden 7 dage. 13. Hvis de behandlede prøver blev opbevaret ved 2-8 C, skal de opvarmes til stuetemperatur og blandes godt i en vortex-mixer, før de amplificeres. Centrifuger de behandlede prøver i 10 minutter ved x g, efter de er blandet i vortex-mixeren. 14. Overfør ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids 50 µl af supernatanten til det relevante A-rør. Brug en ny aerosolfilterspids til hver prøve. Undgå at forstyrre pelleten (pelleten er muligvis ikke synlig). Noter patientprøvernes position på kortet over A-ringen. Sæt låg på A-rørene. 15. Resten af de behandlede prøver opbevares ved 2-8 C, hvis testen skal køres igen. Omkørsel af testen skal udføres inden 7 dage efter prøvebehandlingen. Podeprøver Podeprøver transporteret i AMPLICOR Specimen Transport Medium (STM) Der skal udføres detektion af CT/NG-intern kontrol ved test af disse prøver. 1. Kontroller AMPLICOR STM-prøvetransportrøret. Hvis en prøve er transporteret i et rør med en vatpind, skal prøven kasseres, og der skal indsamles en ny prøve. 18/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

19 Chlamydia trachomatis 2. Pipetttér 1 ml CT/NG DIL til hvert transportrør ved hjælp af en separat, steril pipette til hvert rør. 3. Sæt låg på røret. Bland i 5-10 sekunder i en vortex-mixer. 4. Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter. 5. Behandlede prøver kan opbevares ved stuetemperatur i op til 2 timer, før der overføres aliquoter til A-rørene med arbejds-master Mix. De behandlede prøver skal opbevares ved 2-8 C, hvis der ikke tilsættes aliquoter til A-rørene inden 2 timer. Behandlede prøver, der opbevares ved 2-8 C, skal testes inden 4 dage. 6. Hvis de behandlede prøver er opbevaret ved 2-8 C, skal de opvarmes til stuetemperatur og blandes godt i en vortex-mixer, før de amplificeres. 7. Overfør ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids 50 µl af hver behandlet prøve til det relevante A-rør. Noter patientprøvernes position på kortet over A-ringen. Sæt låg på rørene. 8. Resten af de behandlede prøver opbevares ved 2-8 C, hvis testen skal køres igen. Omkørsel af testen skal udføres inden 4 dage efter prøvebehandlingen. Podeprøver transporteret i kulturtransportmedier (CTM) COBAS AMPLICOR CT-testen er evalueret med 2SP Culture Transport Medium, Bartels ChlamTrans Chlamydial Transport Medium (Bartels, Inc.), SPG CTM og M4 Culture Transport Medium (MicroTest, Inc.). Brug af alternative transportmedier skal evalueres af laboratoriet. 1. Kontroller, at kulturtransportmediet indeholder en vatpind. Der er ikke udviklet specifikationer for funktionsevnen af denne test for prøver uden vatpinde. 2. Sæt en etiket på et 2,0 ml rør med skruelåg til hver patientprøve. Brug ikke rør med snaplukning. 3. Tilsæt 100 µl CT/NG LYS til de relevant mærkede 2 ml polypropylenrør. 4. Bland prøverne grundigt i en vortex-mixer. Hvis prøverne blev opbevaret nedfrosset, skal de optøs til stuetemperatur, før de blandes. Fjern forsigtigt lågene fra prøverørene. Undgå at kontaminere handskerne. Hvis handskerne kontamineres, skal de udskiftes med nye, før der fortsættes til næste prøve. 5. Tilsæt ved hjælp af en pipette med en ny aerosolfilterspids 100 µl godt blandet prøve til det relevante rør med CT/NG LYS. Brug en ny aerosolfilterspids til hver prøve. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. 6. Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter. 7. Ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids til hver prøve tilsættes 200 µl CT/NG DIL til hvert rør. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 19/35

20 8. Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter. 9. Behandlede prøver kan opbevares ved stuetemperatur i op til 2 timer, før der overføres aliquoter til A-rørene med arbejds-master Mix. De behandlede prøver skal opbevares ved 2-8 C, hvis der ikke tilsættes aliquoter til A-rørene inden 2 timer. Behandlede prøver, der opbevares ved 2-8 C, skal testes inden 7 dage. 10. Hvis de behandlede prøver blev opbevaret ved 2-8 C, skal de opvarmes til stuetemperatur og blandes godt i en vortex-mixer, før de amplificeres. 11. Overfør ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids 50 µl af hver behandlet prøve til det relevante A-rør. Brug en ny aerosolfilterspids til hver prøve. Noter patientprøvernes position på kortet over A-ringen. Sæt låg på A-rørene. 12. Resten af de behandlede prøver opbevares ved 2-8 C, hvis testen skal køres igen. Omkørsel af testen skal udføres inden 7 dage efter prøvebehandlingen. Forberedelse af kontroller Udført i: Pre-amplifikation Kontrolforberedelsesområdet Der skal forberedes nye arbejdskontroller til hver dag, testen udføres. Arbejdskontroller kan anvendes til at forberede flere behandlede kontroller i løbet af dagen, men de skal kasseres ved dagens slutning. CT (+)-kontrollen fungerer som den positive kontrol for CT-testen. NG (+)- kontrollen fungerer som den negative kontrol for CT-testen. Del A. Arbejdskontroller: Hvis der både testes pode- og urinprøver, skal der forberedes ét sæt kontroller til hver prøvetype. Forbered følgende arbejds-ct (+)- og CT ( )-kontroller. A1. Brug en steril pipettespids til at tilsætte 1 ml CT/NG DIL til hver af de to 2 ml polypropylen-rør med skruelåg. Mærk det ene rør med CT (+)- arbejdskontrol og det andet rør med CT ( )-arbejdskontrol. A2. Bland CT (+) C og NG (+) C i 5 sekunder i en vortex-mixer ved maksimal hastighed. Fjern forsigtigt lågene fra rørene. Undgå at kontaminere handskerne. Hvis handskerne kontamineres, skal de udskiftes med nye, før der fortsættes. A3. Tilsæt ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids 100 µl CT (+) C til røret med etiketten CT (+)-arbejdskontrol. A4. Tilsæt ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids 100 µl NG (+) C til røret med etiketten CT ( )-arbejdskontrol. A5. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. Opbevar kontrollen ved stuetemperatur, og kasser den ved arbejdsdagens ophør. 20/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

21 Chlamydia trachomatis Del B. Urin og AMPLICOR STD-podeprøver: Forbered følgende behandlede CT (+)- og CT ( )-kontroller. B1. Brug en steril pipettespids til at tilsætte 250 µl CT/NG LYS til hver af de to 2 ml polypropylen-rør med skruelåg. Mærk det ene rør med Behandlet CT (+)-kontrol og det andet rør med Behandlet CT ( )-kontrol. B2. Tilsæt ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids 250 µl CT (+)- arbejdskontrol til røret med etiketten Behandlet CT (+)-kontrol. B3. Tilsæt ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids 250 µl CT ( )- arbejdskontrol til røret med etiketten Behandlet CT ( )-kontrol. B4. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter. Opbevar kontrollen ved stuetemperatur, og kasser den ved arbejdsdagens ophør. B5. Overfør ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids 50 µl af hver behandlet kontrol til det relevante A-rør. Sæt låg på A-rørene, og noter kontrollernes position på kortet over A-ringen. B6. Flyt de behandlede prøver (patientprøver og kontroller) i A-ringene til postamplifikationsområdet. Disse PCR-forberedte prøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 16 timer. Del C. CTM-podeprøver: Forbered følgende behandlede CT (+)- og CT ( )-kontroller. C1. Brug en steril pipettespids til at tilsætte 100 µl CT/NG LYS til hver af de to 2 ml polypropylen-rør med skruelåg. Mærk det ene rør med Behandlet CT (+)-kontrol og det andet rør med Behandlet CT ( )-kontrol. C2. Brug en steril pipettespids til at tilsætte 100 µl kulturtransportmedium til hvert rør med CT/NG LYS. C3. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. C4. Tilsæt ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids 200 µl CT (+)- arbejdskontrol til røret med etiketten Behandlet CT (+)-kontrol. C5. Tilsæt ved hjælp af en pipette med ny aerosolfilterspids 200 µl CT ( )- arbejdskontrol til røret med etiketten Behandlet CT ( )-kontrol. C6. Sæt låg på rørene, og bland grundigt i en vortex-mixer. Inkubér ved stuetemperatur i 10 minutter. Opbevar blandingen ved stuetemperatur, og kasser den ved arbejdsdagens ophør. C7. Overfør ved hjælp af en pipette med aerosolfilterspids 50 µl af hver behandlet kontrol til det relevante A-rør. Sæt låg på A-rørene, og noter positionen af de behandlede prøver og kontroller på kortet over A-ringen. C8. Flyt de behandlede prøver (patientprøver og kontroller) i A-ringene til postamplifikationsområdet. Disse PCR-forberedte prøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 16 timer. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 21/35

22 Amplifikation og detektion Udført i: Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområdet Udfør den daglige instrumentvedligeholdelse som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, og gør følgende: Aftør initialiseringspunktet med en fnugfri, fugtig klud Aftør spidsen på D-kop-håndteringsenheden med en fnugfri, fugtig klud Kontroller vaskebufferreservoiret, og fyld det om nødvendigt Forbered arbejdsvaskebufferen (1X) på følgende måde. Undersøg WB, og opvarm ved C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Tilsæt 1 del WB til 9 dele destilleret eller demineraliseret vand. Bland grundigt. Sørg for, at der altid er mindst 3-4 liter arbejdsvaskebuffer (1X) i analyseinstrumentets vaskebufferreservoir. Tøm affaldsbeholderen Prim systemet Kontroller sprøjter og slanger under primingen Kontroller overførselsspidsen under primingen Gør følgende før hver kørsel: Kontroller affaldsbeholderen, og tøm den om nødvendigt Kontroller vaskebufferreservoiret, og tilføj om nødvendigt buffer Udskift brugte D-kop-rack Prim systemet Indsætning i og betjening af instrumentet 1. Kontroller mængden af reagens på COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. Forbered nok reagenskassetter til udførelse af arbejdsopgaverne. 2. Bland CT PS1 grundigt i vortex-mixeren. Tilsæt 2,5 ml CT PS1 til CT4- kassetten. Placer kassetten på det testspecifikke reagensrack. Kasser det brugte CT PS1-rør. Angiv datoen for reagensforberedelsen på CT4- kassetten. Fortsæt til trin 4, hvis der ikke foretages detektion af den interne kontrol. Ellers fortsættes med trin 3. Der skal udføres detektion af CT/NG-intern ved test af podeprøver, der er indsamlet og transporteret ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection og Transport Kit. 3. Bland IC PS1 grundigt i vortex-mixeren. Tilsæt 2,5 ml IC PS1 til kassetten med IC4. Placer kassetten på det testspecifikke reagensrack. Kasser det brugte IC PS1-rør. Angiv datoen for reagensforberedelsen på IC4-kassetten. 4. Forbered arbejdssubstratet ved at pipettere 5 ml SB i en SB3-kassette. Bland det ved at pipettere op og ned. Kasser det tomme SB-rør. Angiv datoen for reagensforberedelsen på SB3-kassetten. 5. Placer arbejdssubstratet i racket med generisk reagens. 6. Placer DN4- og CN4-kassetterne i racket med generisk reagens. Angiv datoen for, hvornår hver kassette blev åbnet, på kassetten. 22/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

23 Chlamydia trachomatis 7. Identificer reagensrackene som generiske eller testspecifikke ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINKsoftwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. 8. Konfigurer reagensrackene ved at indtaste eller indscanne reagenspositioner og lotnumre i instrumentet ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINK-softwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. 9. Indsæt reagensracket i instrumentet ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINKsoftwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. Kontroller, at hver reagenskassette befinder sig på den tildelte position, og at hver kassette er sat ordentligt fast på det pågældende rack. 10. Placer D-kop-racket på D-kop-platformen. Der skal bruges én D-kop til hver prøve- eller kontroldetektion og to D-kopper til hver kassette med arbejdssubstrat, før COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet kan udføre en blindkørsel. 11. Placer A-ringen eller -ringene i COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentets thermo cycler segment(er). 12. Indsæt A-ringene i analyseinstrumentet ved hjælp af tastaturet eller barkodescanneren som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet, eller ved hjælp af AMPLILINKsoftwaren som beskrevet i brugerhåndbogen til AMPLILINK-softwaren. 13. Opret en A-ringsarbejdsliste som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. 14. Luk låget til det eller de thermo cycler segmenter tæt til. 15. Start COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet som beskrevet i brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet. 16. Vent, til analyseinstrumentet indikerer, at Load Check er gennemført. Med COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet kan der udføres op til 6 separate detektioner på indholdet i hvert A-rør. Den påkrævede mængde af hver detektionsreagens beregnes af analyseinstrumentet, og der foretages et load check ved starten af hver kørsel, som indikerer, om der er nok tilgængelig reagens til at foretage den ønskede test. 17. COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet udfører automatisk amplifikation og detektion. Resultaterne udtrykkes som absorbansværdier ved 660 nm og som positive, negative eller usikre på baggrund af en sammenligning mellem absorbansværdien og en foruddefineret testspecifik cutoff-værdi. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 23/35

24 Kvalitetskontrol Hver testkørsel skal inkludere mindst én kopi af den behandlede CT (+)-kontrol og én kopi af den behandlede CT ( )-kontrol. Som ved alle nye laboratorieprocedurer bør nye brugere overveje at bruge ekstra kontroller, hver gang testen udføres, indtil de har opnået en høj grad af fortrolighed med hensyn til at udføre testen korrekt. Der er ikke nogen anbefalinger med hensyn til positionen af kontrollerne og prøverne i A-ringen eller A-ringene. Negativ kontrol Absorbansen for CT ( )-kontrollen skal være mindre end 0,20 ved 660 nm. Hvis absorbansen for CT ( )-kontrollen er større end eller lig med 0,20, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion) Hvis absorbansen for CT ( )-kontrollen konstant er større end 0,20, skal du kontakte den lokale Roche-forhandler for at få teknisk assistance. CT ( )-kontrollen indeholder ikke homolog DNA (N.gonorrhoeae-sekvenser) og er beregnet til at overvåge kontaminering af reagenser eller udstyr med target-dna. Positiv kontrol Absorbansen for CT (+)-kontrollen skal være større end eller lig med 2,0 ved 660 nm. Hvis absorbansen for CT (+)-kontrollen er mindre end 2,0, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion) Hvis absorbansen for CT (+)-kontrollen konstant er mindre end 2,0, skal du kontakte den lokale Roche-forhandler for at få teknisk assistance. CT (+)-kontrollen indeholder ca. 20 kopier af en C. trachomatis-plasmid-dnasekvens pr. test. Dette er ca. fire gange analysens minimumsdetektionsgrænse, som er bestemt ved Poisson-analyse. Amplifikation og detektion af CT (+)- kontrollen sikrer, at der er fundet en amplifikation sted. CT (+)-kontrollen overvåger ikke testens amplifikationseffektivitet eller detektionsniveau. Validering af prøveindsamlings- vatpinde og kulturtransportmedier Nye lot af prøveindsamlingsvatpinde og kulturtransportmedier (CTM), der bruges til transport af podeprøver til laboratoriet for test af COBAS AMPLICOR CT-testen skal være egnet til brug med testen for at sikre, at vatpinde og medier ikke indeholder stoffer, der påvirker PCR-reaktionen. Kontakt den lokale Roche-forhandler for at få en kopi af valideringsprocedurerne for podeprøver og transportmedier. Kontrol af For at teste effektiviteten af prøvebehandlingen, skal McCoys-celler, der er smittet prøvebehandling med C. trachomatis (kan fås fra American Type Culture Collection) tilsættes et rør med kulturtransportmedium eller et rør med AMPLICOR STM med en koncentration på celler/ml og inkuberes i én time ved stuetemperatur. Det tilsatte kulturtransportmedium eller AMPLICOR STM skal behandles og testes ved hjælp af proceduren for den relevante podeprøvetype som beskrevet i denne metodemanual. Korrekt behandlede prøver skal give positive COBAS AMPLICOR CT-testresultater med en absorbans, der er større end eller lig med 0,8 ved 660 nm. 24/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

25 Chlamydia trachomatis Resultater Fortolkning af resultater Uden intern kontrol-detektion Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få oplysninger om udskrivning af resultater samt fortolkning af flag og kommentarer. 1. Kontroller kørselsudskriften for flag (FLG) og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Hvis kørslen er ugyldig, skal du gentage hele kørslen (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). 2. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: A 660 FLG Kommentar Fortolkning < 0,2 NEGATIVE C. trachomatis-dna er ikke detekteret. Prøven er formodet negativ for C. trachomatis. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedeværelse af en C. trachomatis-infektion, da resultater er afhængige af korrekt prøveindsamling, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med DNA, før der kan foretages en detektion. 0,8 POSITIVE C. trachomatis-dna er detekteret. Prøven er positiv for C. trachomatis. 0,2 < 0,8 GZ Prøven er usikker for C. trachomatis. Gentag testen på den behandlede prøve. Fortolk resultaterne på baggrund af alle 3 værdier. 3. Hvis prøveresultaterne er usikre, skal den endelige fortokning af prøverne fastlægges med 0,20 A 660 som cutoff-værdi. En prøve med et oprindeligt usikkert resultat (GZ 0,2 0,8) skal have foretaget en test som dubletter på den behandlede prøve, før det endelige resultat kan rapporteres. Prøver med mindst 2 ud af 3 resultater (oprindeligt og mindst én gentaget kopi) med A 660 større end eller lig med 0,2 skal anses som positive for C. trachomatis. Hvis begge dubletter af den gentagede prøve har en A 660, der er mindre end 0,2, er prøven formodet negativ for C. trachomatis. Fortolkning af resultater Med intern kontrol-detektion Se brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR-analyseinstrumentet for at få oplysninger om udskrivning af resultater samt fortolkning af flag og kommentarer. 1. Kontroller kørselsudskriften for flag (FLG) og kommentarer for at sikre dig, at kørslen er gyldig. Hvis kørslen er ugyldig, skal du gentage hele kørslen (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 25/35

26 2. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultater med A 660 < 0,2 fortolkes på følgende måde: CT-resultater IC-resultater Fortolkning A 660 A 660 < 0,2 0,2 C. trachomatis-dna er ikke detekteret. Prøve er formodet negativ for C. trachomatis. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedeværelsen af en C. trachomatis-infektion, da resultater er afhængige af korrekt prøveindsamling, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med DNA, før der kan foretages en detektion. < 0,2 < 0,2 Inhiberet prøve. C. trachomatis-dna vil, hvis det er tilstede, ikke kunne detekteres. Behandl en ny aliquot af den oprindelige prøve, og gentag testen. Inhibitorer er ofte labile, og prøver, der i første omgang er inhiberet, er muligvis ikke inhiberet, når de behandles igen. Hvis den oprindelige prøve ikke er tilgængelig, skal der indsamles en ny prøve. 3. Hvis kørslen er gyldig, fortolkes prøver med A 660 0,8 som positive for C. trachomatis, uanset IC-resultatet. 4. Hvis kørslen er gyldig, skal prøver, der har en oprindelig CT-værdi i gråzonen (A 660 0,2 < 0,8), uanset IC-resultatet have foretaget en ny test i dubletter på den behandlede prøve, før det endelige resultat rapporteres. Den endelige fortolkning af prøverne skal foretages med 0,2 A 660 som cutoff-værdi. Fortolkning af gentaget test: Gentag Gentag CT-prøveresultater IC-prøveresultater Fortolkning Mindst ét resultat 0,2 En vilkårlig værdi Prøven er positiv for C. trachomatis. Begge resultater < 0,2 Begge resultater 0,20 Prøven er formodet negativ for C. trachomatis. Begge resultater < 0,2 Mindst ét resultat < 0,20 Ugyldigt negativt resultat. Prøven er ubestemt for C. trachomatis. 26/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

27 Chlamydia trachomatis Forholdsregler ved procedurerne Procedurebegrænsninger Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i preamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/detektion). Pre-amplifikationsaktiviteterne skal starte med klargøring af reagenser og fortsætte med klargøring af prøver. Beholdninger og udstyr skal være specielt beregnet til pre-amplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og beholdninger, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til forberedelse af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre target-dna-kilder. Beholdninger og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i post-amplifikationsområdet. Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt udførelse af analysen. På grund af testens høje analytiske sensitivitet skal der udvises ekstraordinær opmærksomhed ved håndtering af reagenser og amplifikationsblandinger i kittet for at undgå kontaminering. Kasser alle suspekte reagenser. Test kun de angivne prøvetyper. COBAS AMPLICOR CT Test er evalueret ved hjælp af endocervikale podeprøver fra kvinder og uretrale podeprøver fra mænd indsamlet i 2SP-, M4- og SPG-kulturtransportmedier samt urinprøver fra kvinder og mænd indsamlet uden konserveringsmidler. Test af andre prøvetyper er ikke evalueret og kan resultere i falsk negative eller falsk positive resultater. Detektionen af C. trachomatis er afhængig af det antal organismer, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøveindsamlingsmetoder, patientfaktorer (dvs. alder, sygdomshistorik, tilstedeværelse af symptomer), infektionsstadiet og/eller de inficerende C. trachomatis-strenge. Der kan forekomme falsk negative resultater pga. polymerase-inhibering. Der er tilsat CT/NG-intern kontrol i COBAS AMPLICOR CT Test for at muliggøre identifikation af behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan påvirke PCRamplifikationer, der er større end 20 kopier pr. test. Detektionen af CT/NG-intern kontrol skal udføres ved test af podeprøver, der er indsamlet og transporteret ved hjælp af AMPLICOR STD Swab Specimen Collection og Transport Kit For laboratorier, der begynder at anvende COBAS AMPLICOR CT/NG Test for Chlamydia trachomatis, ansætter nye operatører eller ændrer test- eller prøveindsamlingsprocedurer, kan det være en god idé at benytte CT/NG-intern kontrol til at bestemme inhiberingsandelen i testpopulationen ved test af urinprøver eller podeprøver, der transporteres i chlamydia-kulturtransportmedier. Afhængig af resultaterne af denne første vurdering kan laboratoriet vælge at fortsætte brugen af CT/NG IC med disse prøvetyper. Forekomsten af chlamydia-infektion i en population kan påvirke funktionsevnen. Positive, prædiktive værdier formindskes ved test af populationer med lav forekomst eller personer uden risiko for smitte. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøveindsamling, transport, opbevaring og behandling. Variationer som skyldes opbevaring er ikke fuldstændigt defineret. I undersøgelser af prøveholdbarhed for nedkølede og frosne prøver var funktionsevnen den samme. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 27/35

28 Tilsætningen af AmpErase-enzym til Master Mix aktiverer den selektive amplifikation af target-dna. Kontaminering fra reagenser kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i denne metodemanual. Testen kan ikke afgøre behandlingsmæssig succes eller fiasko. Som ved alle diagnostiske tests skal resultaterne af COBAS AMPLICOR C Test fortolkes på baggrund af alle kliniske og laboratoriemæssige undersøgelser. Dette produkt må kun anvendes af medarbejdere, der er oplært i brugen af PCRteknikker. COBAS AMPLICOR CT Test kan ikke detektere plasmid-frie varianter af C. trachomatis. Der kan kun opnås prøvetilstrækkelighed (for podeprøver) ved mikroskopisk visualisering af cervikale epitelceller i prøverne. COBAS AMPLICOR CT Test anbefales ikke til evaluering ved mistanke om seksuelt misbrug eller andre retslægelige indikationer. Under alle omstændigheder anbefales det at foretage yderligere test, hvis falsk positive eller falsk negative resultater kan føre til alvorlige medicinske, sociale eller psykologiske følgevirkninger. Anbefalingerne for opbevaring af prøver er baseret på undersøgelser af 21 dyrkningspositive patientprøver (10 podeprøver og 11 urinprøver) og 52 dyrkningsnegative patientprøver. COBAS AMPLICOR CT Test giver kvalitative resultater. Der kan ikke udledes korrelation mellem størrelsen af et positivt absorbanssignal i COBAS AMPLICOR CT-testen og antallet af C. trachomatis-celler i en inficeret prøve. Testen detekterer kun C. trachomatis og ikke C. psittaci eller C. pneumoniae. COBAS AMPLICOR CT-testen anbefales i forbindelse med urinprøvetest fra mænd og kvinder at blive foretaget på tilfældige urinprøver af første del af urinen (defineret som de første ml af urinstrømmen). Effekten fra andre variabler, som f.eks. første del af strømmen i forhold til mellemste del eller sidste del osv., er ikke evalueret. Effekten fra andre potentielle variabler, som f.eks. nervøs fluor, brug af tamponer, brusebad osv., og prøveindsamlingsvariabler er ikke blevet evauleret. COBAS AMPLICOR CT Test er ikke beregnet som erstatning for halsundersøgelser og endocervikale prøver til diagnosticering af urogenital infektion. Patienter kan have cervicitis, uretrit, urinvejsinfektioner eller vaginalinfektioner af andre årsager eller samtidige infektioner fra andre stoffer. 28/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

29 Chlamydia trachomatis Forstyrrende stoffer Forekomst af PCR-inhibitorer kan medføre falsk negative resultater. Forstyrrende stoffer omfatter, men er ikke begrænset til følgende: Det er påvist, at Replens -smøremiddel hæmmer PCR og kan give falsk negative resultater med denne test. Forekomst af mucus i vercikale prøver kan hæmme PCR og give falsk negative testresultater. Mucus-fri prøver anbefales for at opnå optimal funktionsevne i testen. Brug en svamp eller en stor vatpind til at fjerne cervikal sekretion, før prøven indsamles 19. Prøver, der indeholder mere end 5% (v/v) blod, kan give falsk positive resultater. I kliniske undersøgelser indeholdt 689 ud af 2306 podeprøver fra kvinder for meget blod. Den falsk positive andel var ikke højere i disse prøver. Egenskaber for funktionsevne Analytisk specificitet: Dyrkede celler og virus Specificiteten for COBAS AMPLICOR CT-testen blev evalueret ved at tilsætte dyrkede celler eller dyrket virus til både CTM- og normal human urin. CTM og urin blev behandlet og testet ved hjælp af COBAS AMPLICOR CTtestproceduren. De testede organismer omfatter mange, der kan være isoleret fra tractus urogenitalis. Ingen af følgende organismer eller vira udviste reaktivitet i COBAS AMPLICOR CT-testen: Achromobacter xerosis Acinetobacter calcoaceticus Acinetobacter lwoffi Acinetobacter sp. genospecies 3 Actinomyces israelii Aerococcus viridans Aeromonas hydrophila Agrobacterium radiobacter Alcaligenes faecalis Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis Bacteriodes fragilis Bacteroides caccae Bacteroides gracilis Bifidobacillus longum Bifidobacterium adolescentis Branhamella catarrhalis Brevibacterium linens Candida albicans Candida glabrata Candida guilliermondi Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Lactococcus lactis subsp. cremoris Legionella bozemnii Legionella pneumophila Leuconostoc paramesenteroides Micrococcus luteus Mobiluncus curtsil subsp. curtsii Mobiluncus curtsil subsp. holmesii Moraxella osloensis Morganella morganii Mycobacterium smegmatis Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis Mycoplasma pneumoniae Neisseria cinerea Neisseria elongata Neisseria flavescens Neisseria gonorrhoeae Neisseria kochi Neisseria lactamica Neisseria meningitidis W135 Neisseria mucosa Neisseria perflava Neisseria polysaccharea Neisseria sicca 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 29/35

30 Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Chromobacter violaceum Chryseobacterium meningosepticum Citrobacter freundii Clostridium innocuum Clostridium perfringens Corynebacterium genitalium Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Cytomegalovirus Deinococcus radiopugnans Derxia gummosa Echerichia coli Edwardsiella tarda Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus avium Enterococcus faecium Epstein Barr Virus Erysipelothrix rhusiopathiae Ewingella americana Gardnerella vaginalis Gemella haemolysans Gemella morbillorum Haemophilus ducreyi Haemophilus influenzae Herpes simplex virus 1 Herpes simplex virus 2 Human papilloma virus type 16 Human papilloma virus type 18 Kingella kingae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Lactobacillus acidophillus Lactobacillus brevis Lactobacillus crisptus Lactobacillus jensenii Lactobacillus lactis subsp. lactis Lactobacillus oris Lactobacillus parabuchnerri Lactobacillus vaginalis Neisseria subflava Paracoccus denitrificans Pasteurella maltocida Pediococcus acidilactica Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Peptostreptococcus productus Prevotella bivia Prevotella corporis Prevotella intermedia Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Providencia stuartii Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Rahnella aquatilis Rhodospirillum rubrum Salmonella minnesota Salmonella typhimurium Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus anginosus Streptococcus bovis Streptococcus dysgalatia Streptococcus equinis Streptococcus mitis Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguis Streptomyces griseinus Treponema pallidum* Trichomonas vaginalis Ureaplasma urealyticum Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica * Oprenset DNA blev tilsat behandlet CTM og urin. Analytisk sensitivitet: Ved bestemmelse af den analytiske sensitivitet for oprenset target-dna udviste Oprenset DNA COBAS AMPLICOR CT-testen evnen til ved reproducering at detektere mindst 5 kopier oprenset C. trachomatis-dna pr. PCR-reaktion. Kopiantallet for det C. trachomatis-dna, der blev brugt i dette eksperiment, blev bestemt ved Poisson-analyse. 30/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

31 Chlamydia trachomatis Analytisk sensitivitet: COBAS AMPLICOR CT-testen kan detektere én IFU C. trachomatis pr. PCR- C. trachomatis-celler reaktion. Denne analytiske sensitivitet blev fastlagt ved serielle fortyndinger af kulturstammer i titer fra hver af 12 C. trachomatis-serotyper i CTM. Prøver fra hver fortynding blev behandlet og testet via standardproceduren for COBAS AMPLICOR CT-testen. For hver serotype gav CTM-fortyndingen indeholdende 80 IFU/ml, der svarer til 1 IFU pr. amplifikationsreaktion, et stærkt positivt signal. Præcision Præcisionen under kørsel, mellem kørsel, mellem dag og i alt for COBAS AMPLICOR CT-testen blev fastlagt ved hjælp af CT (+)-kontrollen. CT (+)- kontrollen blev behandlet og yderligere fortyndet med prøvebehandlingsbuffere for at resultere i koncentrationer på 0, 5, 10 og 20 DNA-kopier/amplifikationsreaktion. Tre operatører testede over 8 dage fem kopier af hver DNAkoncentration én gang pr. dag. Hermed blev der amplificeret 15 bestemmelser af hver DNA-koncentration, og hver amplifikation blev påvist som dobbeltbestemmelse til i alt 240 bestemmelser. Se tabel 1. Tabel 1 Præcision af COBAS AMPLICOR CT-testen* CT-target Kopiantal/PCR Kopi/PCR Kopi/PCR Kopi/PCR Kopi/PCR Det samlede antal kopier Gennemsnitlig absorbans 0,014 3,978 3,942 3,942 Minimumsværdi 0,002 3,559 1,770 3,478 Maksimumsværdi 0,031 4,000 4,000 4,000 Mellem dag Standardafvigelse 0,0012 0, , ,01604 Variationskoefficient 8,9% 0,1% 0,2% 0,4% Mellem kørsel Standardafvigelse 0,0064 0, , ,00474 Variationskoefficient 45,7% 0,7% 2,4% 0,1% Intraseriel kørsel Standardafvigelse 0,0030 0, , ,09978 Variationskoefficient 21,8% 1,7% 5,2% 2,5% I alt Standardafvigelse 0,0072 0, , ,10117 Variationskoefficient 51,4% 1,8% 5,8% 2,6% * Beregningerne er baseret på retningslinjer fra NCCLS (EP5A) for præcision under kørsel og samlet præcision. 9/2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 31/35

32 Klinisk funktionsevne COBAS AMPLICOR CT-testen blev evalueret i en klinisk undersøgelse, der blev foretaget på ét laboratorium. Der blev foretaget analyser af i alt 144 endocervikale podeprøver fra kvinder, 144 urinprøver fra kvinder, 50 uretrale podeprøver fra mænd og 50 urinprøver fra mænd. Matchende pode- og urinprøver fra hver patient blev testet ved dyrkning og fungerede som referencetest på nogle af laboratorierne. Prøver med afvigende resultater blev analyseret ved at gentage COBAS AMPLICOR CT-testen og ved at udføre PCR for en alternativ Chlamydia-specifik target-dna-sekvens (en del af Major Outer Membrane Protein-genet) 20. Resultaterne blev afklaret på to måder. I den første metode (pr. prøveanalyse) blev de testnegative infektioner i referencetesten identificeret ved hjælp af PCRresultaterne for kun én prøvetype (podning eller urin). Patienterne blev klassificeret som positive for infektion, hvis referencetesten var positiv, eller hvis den evaluerede prøvetype var PCR-positiv for både de primære og de alternative target. I den anden metode (pr. patientanalyse) blev de testnegative infektioner i referencetesten identificeret ved hjælp af PCR-resultaterne for både pode- og urinprøver fra en enkelt patient. Patienterne blev klassificeret som positive for infektion, hvis referencetesten var positiv, eller hvis én af prøvetyperne var PCR-positiv for både de primære og de alternative target. Funktionsevnen for testen blev beregnet for hver enkelt prøvetype. Sensitiviteten og specificiteten blev beregnet i forhold til referencetestresultaterne, pr. prøve afklaret resultat og pr. patient afklaret resultat. Den korrekte måling af klinisk sensitivitet og specificitet i COBAS AMPLICOR CT-testen skal foretages ved en sammenligning med de pr. patient afklarede resultater. CT-funktionsevne uden brug af intern kontrol ift. dyrkning Sted Prøve N Prævalens ift. dyrkning ift. afklarede resultater Kategori pr. prøve pr. patient Sensitivitet Specificitet Sensitivitet Specificitet Sensitivitet Specificitet 1 Urin fra mænd 50 20,0% 100,0% 79,2% 100,0% 95,0% 100,0% 95,0% (2/2) (38/48) (10/10) (38/40) (10/10) (38/40) Podning fra mænd 50 20,0% 100,0% 85,4% 100,0% 100,0% 90,0% 100,0% (2/2) (41/48) (9/9) (41/41) (9/10) (40/40) Urinprøve fra ,3% 60,0% 87,1% 90,0% 97,6% 81,8% 97,5% kvinder (3/5) (121/139) (18/20) (121/124) (18/22) (119/122) Podning fra ,3% 60,0% 87,1% 90,5% 98,4% 86,4% 98,4% kvinder (3/5) (121/139) (19/21) (121/123) (19/22) (120/122) CT-funktionsevne med brug af intern kontrol ift. dyrkning Sted Prøve N Præ- Inhi- ift. dyrkning ift. afklarede resultater Kategori valens bering pr. prøve pr. patient Sensitivitet Specificitet Sensitivitet Specificitet Sensitivitet Specificitet 1 Urin fra mænd 50 20% 2,0% 100,0% 79,2% 100,0% 95,0% 100,0% 95,0% (1/50) (2/2) (38/48) (10/10) (38/40) (10/10) (38/40) Podning fra 50 20% 100,0% 85,4% 100,0% 100,0% 90,0% 100,0% mænd (0/50) (2/2) (41/48) (9/9) (41/41) (9/10) (40/40) Urin fra ,3% 10,4% 75,0% 86,3% 94,7% 97,4% 85,7% 97,4% kvinder (15/144) (3/4) (113/131) (18/19) (113/116) (18/21) (111/114) Podning fra ,3% 2,8% 60,0% 86,9% 90,5% 98,3% 86,4% 98,3% kvinder (3/144) (3/5) (119/137) (19/21) (119/121) (19/22) (118/120) 32/35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

33 Chlamydia trachomatis Referencer 1. Schachter, J. and Stamm, W.E Chlamydia. In: Manual of Clinical Microbiology, (P.R. Murray, ed.) 7th ed., ASM Press, Washington, D.C., Grayston, J.T., Kuo, C.C., Campbell, L.A. et al Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. International Journal of Systematic Bacteriology 39: Grayston, J.T Chlamydia pneumoniae, strain TWAR. In: Chlamydial Infections: Proceedings of the Seventh International Symposium on Human Chlamydial Infections, W.R. Bowie, et al., Cambridge University Press, New York, Gerbase, A., Rowley J.T., and Mertens, T.E Global epidemiology of sexually transmitted diseases. Lancet 351:(S3) Screening Tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Infections Morbidity and Mortality Weekly Reports : (No. RR- 15): Thompson, S.E. and Washington, A. E Epidemiology of sexually transmitted Chlamydia trachomatis infections. Epidemiological Reviews. 5: Pao, C.C., Lin, S-S, Yang, T-E., et al Deoxyribonucleic acid hybridization analysis for the detection of urogenital Chlamydia trachomatis infections in women. American Journal of Obstetrics and Gynocology. 156: Loeffelholz, M. J., Lewinski, C. A., Silver, S. R. et al Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 30: Chernesky, M. A., Lee, H., Schachter, J. et al Diagnosis of Chlamydia trachomatis urethral infection in symptomatic and asymptomatic men by testing first-void urine in a ligase chain reaction assay. Journal of Infectious Diseases 179: Schachter, J., Stamm, W. E. Chernesky, M. A., et al Nonculture tests for genital tract chlamydial infection: What does the package insert mean, and will it mean the same thing tomorrow? Sexually Transmitted Diseases 19: Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: Mullis, K.B. og Faloona, F.A Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155: /2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 33/35

34 13. Palmer, L. and Falkow, S A common plasmid of Chlamydia trachomatis. Plasmid 16: Peterson, E.M. and de la Maza, L.M Restriction endonuclease analysis of DNA from Chlamydia trachomatis biovars. Journal of Clinical Microbiology 26: Longo, M.C., Berninger, M.L.S., and Hartley J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI Document M29-A Villanova, PA: CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, Guidelines for Treatment of Sexually Transmitted Diseases. Morbidity and Mortality Weekly Reports 1998 (No. RR-1): Dutilh, B., Bebear, C., Rodriguez, P. et al Specific amplification of a DNA sequence common to all Chlamydia trachomatis serovars using the polymerase chain reaction. Research Microbiology 140: Toye, B., Woods, W., Bobrowska, M., and Ramotar K Inhibition of PCR in genital and urine specimens submitted for Chlamydia trachomatis testing. Journal of Clinical Microbiology 36: /35 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 9/2006, Revision 4.0

35 Chlamydia trachomatis " Distributed by Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Et medlem af Roche Group Roche Diagnostics Roche Diagnostics Indianapolis, IN USA H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call the (For Technical Assistance call: Roche Response Center Pour toute assistance technique, toll-free: ) appeler le: ) Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz Roche Diagnostics F Meylan Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: D Mannheim, Germany Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I Milano Roche Diagnostics S.L. Distribuidor em Portugal: E Barcelona Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora ROCHE, COBAS, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPLITAQ og AMPERASE er varemærker, der tilhører Roche. ROCHE RESPONSE CENTER er et servicemærke, der tilhører Roche. ChlamTrans er et varemærke, der tilhører Bartels, Inc. Dynabeads -paramagnetiske partikler er licenseret under patenter, der tilhører Dynal Biotech ASA, Oslo, Norge. Dynabeads er et registreret varemærke, der tilhører Dynal Biotech ASA, Oslo, Norge, og er licenseret til Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Eppendorf Multipette og Eppendorf Combitip er varemærker, der tilhører Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, Tyskland. ProClin er et registreret varemærke, der tilhører Rohm and Haas Company. Replens er et registreret varemærke, der tilhører Columbia Laboratories Inc. Copyright 2006, Roche Molecular Systems, Inc. Alle rettigheder forbeholdes. 9/2006 ( ENGL) /2006, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Chlamydia trachomatis Test 35/35