LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

Transkript

1 LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 Tests P/N: LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 Tests P/N: LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK 96 Tests P/N: Well Tray with Lid 1 Each P/N: TILSIGTET BRUG LINEAR ARRAY HPV (Human Papilloma Virus) Genotyping-testen er en kvalitativ in vitro-test til påvisning af humant papilloma-virus i kliniske prøver. Testen anvender amplifikation af target-dna ved hjælp af PCR (Polymerase Chain Reaction) og nukleinsyrehybridisering og detekterer 37 anogenitale HPV DNA-genotyper [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 og CP6108] i cervikale celler, indsamlet i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt -opløsning. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Vedvarende infektion med human papilloma-virus (HPV) er den vigtigste årsag til cervikal kræft og forstadiet cervical intraepitelial neoplasi (CIN) 1-3. Tilstedeværelsen af HPV er forekommet i mere end 99% af de cervikale kræfttilfælde på verdensplan 3. HPV er et lille, ikke-kappebærende, dobbeltstrenget DNAvirus med et genom på ca nukleotider. Der findes mere end 100 forskellige HPV-genotyper og ca. 40 forskellige HPV-genotyper, der kan inficere de humane genitale slimhinder. Det er imidlertid kun et udsnit af disse seksuelt overførte virale genotyper, der forbindes med svær cervikal dysplasi og cervikal cancer 3-5. Disse kaldes højrisiko-hpv-genotyper, mens lavrisiko-hpv-genotyperne ofte forbindes med godartede lette intraepiteliale læsioner eller kondylomer. Seksuelt overførte infektioner med HPV er meget udbredt, og det skønnes, at op til 75% af alle kvinder udsættes for HPV på et eller andet tidspunkt 6. De fleste HPV-infektioner forsvinder spontant, men en vedvarende højrisiko-hpv er en væsentlig risikofaktor for udviklingen af cervikal cancer. I udviklede lande med screeningsprogrammer for cervikal cancer har Pap-smear (opkaldt efter Dr. George Papanicolaou) været anvendt siden midten af 1950 erne som det primære middel til påvisning af tidlige forstadier til cervikal cancer. Selvom det har reduceret dødeligheden for cervikal cancer væsentligt i disse lande, kræver Pap-smear en fortolkning af højtuddannede cytopatologer og er en forholdsvis upræcis test med en høj forekomst af falsk-negative resultater. Cytologiske abnormiteter, der observeres i Pap-smear, skyldes primært infektion med HPV. Imidlertid kan forskellige betændelsesformer eller prøvevariationer resultere i falsk-positive Pap-resultater. Undersøgelse af en abnorm Pap-smear omfatter gentagne test, kolposkopi og biopsi. En histologisk bekræftet svær læsion skal fjernes ved operation for at undgå udviklingen af invasiv cervikal cancer. Papilloma-virus er meget svært at dyrke in vitro, og ikke alle patienter, der er smittet med HPV, har en påviselig antistof-reaktion. Nukleinsyretest (DNA) ved hjælp af PCR-metoden er derfor en følsom og ikke-invasiv metode til påvisning af en aktiv cervikal HPV-infektion. Rapporteret anvendelse af HPVtypebestemmelsestest omfatter evaluering af detektion og clearance af specifikke HPV-typer 7, monitorering af typespecifikke persistente genotyper, der er forbundet med højere risiko for cervikale lidelser og cervikal carcinogenese 8, virkning af exairese-behandling 9, strålebehandling 10 eller kemoterapi 11 mod HPV-tilknyttede læsioner (test af helbredelse), genotypebestemmelse i udvalgte screeningprogrammer før og efter vaccination 12 samt lettelse af epidemiologiske undersøgelser med hensyn til det naturlige forløb af HPV-infektioner. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen er baseret på fire hovedprocesser: Prøveforberedelse, PCRamplifikation 13 af target-dna med HPV-primere, hybridisering af de amplificerede produkter til oligonukleotide prober samt påvisning af de probebundne, amplificerede produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument DA 1 Doc Rev. 11.0

2 Prøveforberedelsen med AmpliLute Liquid Media Extraction Kit resulterer i HPV target-dna og humant genomisk DNA, der egner sig til PCR-amplifikation. Master Mix-reagenset indeholder primere til amplifikation af DNA fra 37 HPV-genotyper og humant ß-globin-gen. Detektion og genotype - bestemmelsen udføres ved hjælp af det denaturerede amplificerede DNA og en array af oligonukleotide prober, der giver mulighed for uafhængig identifikation af de enkelte HPV-genotyper. Forberedelse af prøver HPV DNA frigives ved at lysere cervikale celleprøver under denatureringsforhold ved forhøjede temperaturer. Der udføres en lysis under tilstedeværelse af proteinase K, kaotropisk stof og detergent efterfulgt af isolation og oprensning af DNA over en kolonne og eluering ved hjælp af elueringsreagens. Ved at isolere ß-globin-genet får man mulighed for at vurdere, dels om cellematerialet er tilstrækkeligt, dels ekstraktionen og amplifikationen for den enkelte behandlede prøve. PCR-amplifikation Valg af target LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen brugere biotinylerede primere til at definere en sekvens af nukleotider i den polymorfe L1-region i HPV-genomet med en omtrentlig længde på 450 basepar. En pool af HPV-primere, der er til stede i Master Mix, er designet til at amplificere HPV DNA fra 37 HPVgenotyper 14, herunder 13 højrisiko-genotyper* (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 og 68) 3-5. Capture-probesekvenserne er placeret i polymorfe regioner af L1, som er defineret af disse primere. Yderligere et primerpar er rettet mod det humane ß-globin-gen for at kontrollere ekstraktion og amplifikation, samt om cellematerialet er tilstrækkeligt. Targetamplifikation AmpliTaq Gold DNA-polymerase anvendes til at kickstarte amplifikationen af HPV target-dna og ß-globin-kontrollen. Først tempereres PCR-reaktionsblandingen for at aktivere AmpliTaq Gold DNApolymerase og denaturere det virale og genomiske DNA og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder primerne (både upstream og downstream) sig til target-dna et. Ved tilstedeværelsen af Mg 2+ og overskydende dntp er forlænger AmpliTaq Gold DNA-polymerasen sig i de bundne primeres retning langs targetskabelonerne og danner et dobbeltstrenget HPV target-dnamolekyle med 450 basepar eller et ß-globin-DNA-molekyle med 268 basepar, kaldet et amplikon. Denne proces gentages et antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Amplifikationen af HPV-genomet eller ß-globin-genet foregår kun i området mellem de relevante primerpar. Hele genomet amplificeres ikke. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 15, men ikke DNA, som indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat ud over deoxythymidin trifosfat i Master Mixreagenset. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør kontaminerende amplikon modtageligt for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. AmpErase-enzym, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved den alkaliske ph i Master Mix brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzym er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Efter amplifikationen denatureres det resterende enzym ved at tilsætte denatureringsopløsningen, hvilket forhindrer nedbrydningen af target-amplikon. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifikation denatureres HPV- og ß-amplikonet ved tilsætning af denatureringsopløsningen og danner enkeltstrenget DNA. Afmålte mængder af denatureret amplikon overføres derefter til den relevante brønd for den typebestemmelsesbakke, der indeholder hybridiseringsbuffer og en enkelt LINEAR ARRAY HCV Genotyping-strip, som er dækket med HPV og en række ß-globin-prober. Det biotinmærkede amplikon hybridiseres kun til den oligonukleotide probe, hvis amplikonet indeholder en sekvens, der stemmer overens med sekvensen i den komplimentære probe. Herudover dækkes LINEAR ARRAY HPV Genotyping-stripsen med én krydsreaktiv oligonukleotid probe, der hybridiserer med HPVgenotyperne 33, 35, 52 og 58. Amplikon med sekvenser, der indbyrdes stemmer overens (kun 1-3 uover - ensstemmelser), som er komplementære til proben, hybridiseres til denne proberække. * LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen detekterer HPV 66. Risikoklassificeringen af HPV 66 er ikke entydig. Journaler, hvor der er brugt peer-review, er ikke enige med hensyn til klassificeringen af denne type, og den identificeres som værende af lav, mellem eller høj risiko afhængigt af den pågældende udgivelse. Analyser, der bruger HPV DNA-detektion til screening for cervikal cancer, varierer også med hensyn til typedetektion, og nogle inkluderer HPV 66 som en højrisikotype, mens andre ikke gør DA 2 Doc Rev. 11.0

3 Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen, vaskes LINEAR ARRAY HPV Genotyping-stripsen grundigt for at fjerne eventuelt ubundet materiale. Derefter tilsættes streptavidin/peberrodsperoxidasekonjugat til stripsen. Streptavidin/peberrodsperoxidasekonjugatet binder sig til det biotinmærkede amplikon, der er hybridiseret til de oligonukleotide prober på stripsen. Stripsen vaskes for at fjerne ubundet streptavidin/ peberrodsperoxidasekonjugat, og der tilsættes en substratopløsning, der indeholder brintoverilte og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB), til hver strip. Ved tilstedeværelsen af brintoverilte katalyserer den bundne streptavidin/peberrodsperoxidase oxideringen af TMB og danner et blåfarvet kompleks, som udfældes de steder på proben, hvor hybridiseringen foregår. LINEAR ARRAY HPV Genotyping-stripsen aflæses derefter visuelt ved at sammenligne mønstrene i de blå bånd med en referencetabel for LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen. REAGENSER AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 test AmpliLute Kit til ekstraktion af flydende medier P/N: CAR 1 x 310 µg (carrier-rna) Syntetisk RNA, frysetørret (tilsæt AVE) PK 1 x 1,25 ml (proteinase K) Proteinase K, serint proteinase, tritirachiumalbum Xn Proteinase K + Sundhedsskadelig R: 36/37/38-42/43 Irriterer øjnene, åndedrætsorganerne og huden. Kan give overfølsomhed ved indånding og ved kontakt med huden. S: /37 Undgå indånding af dampe. Undgå kontakt med huden. Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes. Brug særligt arbejdstøj og egnede beskyttelseshandsker. AVE (elueringsbuffer) RNase-frit vand < 0,09% natriumazid AW2 (vaskebuffer 2) Tris-HCl-buffer < 0,09% natriumazid (tilsæt ren ethanol) ATL (væv-lysisbuffer) EDTA 10% natriumdodecylsulfat AL (lysisbuffer) 50% guanidin HCl Xn 25-50% guanidin HCl + 4 x 2 ml 1 x 13 ml 1 x 10 ml 1 x 33 ml Sundhedsskadelig DA 3 Doc Rev. 11.0

4 R: 22-36/38 Farlig ved indtagelse. Irriterer øjnene og huden. S: Må ikke opbevares sammen med fødevarer, drikkevarer og foderstoffer. Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes. Brug særligt arbejdstøj. Ved indtagelse, kontakt omgående læge, og vis denne beholder eller etiket. EXT 50 stk. (Column Extenders, 3 ml) VC 50 stk. (VacConnectors) ELT 50 stk. (elueringsglas, 1,5 ml) CLM 50 stk. (QIAamp MinElute Columns) Siliciummembran LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 test LINEAR ARRAY HPV Genotyping-test (P/N: ) HPV MMX 4 x 0,58 ml (LINEAR ARRAY HPV Master Mix) Trisbuffer kaliumklorid < 0,02% AmpliTaq Gold DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobiel) < 0,001% datp, dctp, dutp, dgtp, dttp < 0,001% af hhv. upstream- og downstream-primere (biotinyleret) 0,06% natriumazid HPV Mg 2+ 4 x 0,125 ml (LINEAR ARRAY HPV-magnesiumopløsning) < 1% magnesiumklorid Amaranth-farve 0,05% natriumazid HPV (+) C 4 x 0,5 ml (positiv LINEAR ARRAY HPV-kontrol) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,002% Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001% ikke-smitsomt plasmid-dna (mikrobielt) indeholdende HPV-sekvenser < 0,001% ikke-smitsomt plasmid-dna (mikrobiel) indeholdende humane ß-globin-sekvenser 0,05% natriumazid HPV ( ) C 4 x 0,5 ml (negativ LINEAR ARRAY HPV-kontrol) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,002% Poly ra RNA (syntetisk) 0,05% natriumazid HPV Strip 4 x 12 test (LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strip) Nylon-strip, dækket med HPV DNA-prober og 1 human ß-globin DNA-probe (ved høje og lave probekoncentrationer) DA 4 Doc Rev. 11.0

5 LINEAR ARRAY Detection Kit LINEAR ARRAY detektionskit (P/N: ) DN (denatureringsopløsning) 1,6% natriumhydroxid EDTA Thymolblå Xi 1,6% (w/w) natriumhydroxid + LA DK 96 test 2 x 12 ml Lokalirriterende SDS (SDS-koncentrat) 20% natriumlaurylsulfat (SDS) 1% ProClin 150-konserveringsmiddel SSPE (SSPE-koncentrat) Natriumfosfatopløsning Natriumklorid EDTA 1% ProClin 150-konserveringsmiddel SA-HRP (streptavidin/peberrodsperoxidasekonjugat) Streptavidin/peberrodsperoxidasekonjugat ACES-buffer Natriumklorid 1% ProClin 150-konserveringsmiddel CIT (Citratkoncentrat) Citratopløsning SUB A (substrat A) Citratopløsning 0,01% brintoverilte 0,1% ProClin 150-konserveringsmiddel SUB B (substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T 40% (w/w) dimethylformamid (DMF) 4 x 27 ml 2 x 160 ml 2 x 2 ml 2 x 36 ml 3 x 160 ml 3 x 40 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan skade barnet under graviditeten. Farlig ved indånding og ved hudkontakt. Irriterer øjnene. S: Undgå enhver kontakt. Indhent særlige anvisninger før brug. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig. Vis etiketten, hvis det er muligt DA 5 Doc Rev. 11.0

6 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er beregnet til brug sammen med humane cervikale celler, som er indsamlet i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-opløsning. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangs - beskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter håndtering af prøver og testreagenser. E. Undgå bakterie- og DNA-kontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNA-fri og DNase-fri pipettespidser. F. Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes. G. Ubrugte reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. H. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. I. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger (Safety Data Sheets, SDS) hos Roche. J. Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i præamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/detektion). Præamplifikationsaktiviteterne skal starte med forberedelse af reagenser og fortsætte med forberedelse af prøver. Forbrugsartikler og udstyr skal være specielt beregnet til præamplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og forbrugsartikler, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til forberedelse af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre target-dna-kilder. Forbrugsartikler og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i postamplifikationsområdet. K. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 og CLSIdokument M29-A3 17. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindelig tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% opløsning af natriumhypoklorit. L. AW2, AVE, HPV MMX, HPV Mg 2+, HPV ( ) C og HPV (+) C indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. M. Brug beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangshandsker ved håndtering af AL, PK, HPV MMX, HPV Mg 2+, DN, SA-HRP, SUB A, SUB B og arbejdssubstrat (blandet SUB A- og SUB B-reagens). Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. N. SUB B og arbejdssubstrat indeholder dimethylformamid, der er rapporteret som giftigt ved høje orale doser, kan skade barnet under graviditeten. Undgå hudkontakt, indånding af dampe samt indtagelse. Kommer stof på huden vaskes straks med store mængder sæbe og vand, og omgående lægebehandling er nødvendig. O. AL indeholder guanidinhydroklorid, som kan danne stærkt reaktive forbindelser, hvis det kommer i forbindelse med blegemiddel. Rengør med egnet laboratorierengøringsmiddel og vand, hvis der spildes væske, som indeholder denne buffer. Hvis den spildte væske indeholder potentielt smittefarlige stoffer, skal det berørte område først rengøres med laboratorierengøringsmiddel og derefter med 0,5% natriumhypoklorit. Hæld ikke blegemiddel eller syreholdige opløsninger direkte i affald, der indeholder AL. P. Beholdere af glas eller plastik, som er under vakuum, kan implodere under brug, hvilket kan medføre personskade. Det anbefales kraftigt at bruge beskyttelsesbriller, når beholdere af glas eller plastik bruges under delvist vakuum for at forebygge personskader. Der bør kun bruges beholdere, der er særligt udviklet til dette arbejde. Undgå at bruge en beholder til vakuum-anvendelse, hvis den ikke er fremstillet til at modstå et vakuumtryk, hvis den er ridset, skåret eller revnet, hvis beholderen er klemt på en måde, som medfører belastning, eller hvis beholderen holdes i hånden. Q. Brug kun LINEAR ARRAY HPV Master Mix sammen med LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen. AMPLICOR HPV Master Mix kan ikke bruges sammen med LINEAR ARRAY HPV Genotypingtesten DA 6 Doc Rev. 11.0

7 KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING A. Reagenser må ikke nedfryses, medmindre andet er angivet. B. CLM og PK fra AmpliLute Liquid Media Extraction-kittet skal opbevares ved 2-8 C. Andre reagenser fra AmpliLute Liquid Media Extraction-kittet skal opbevares ved 2-25 C. Efter åbning kan ubrugt PK opbevares op til 2 måneder ved 2-8 C, ATL og AL kan opbevares op til 2 måneder ved 2-25 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. Efter rekonstitution med AVE, kan CAR opbevares i op til 24 timer ved 2-8 C eller i afmålte mængder opbevares ved -20 C i op til 2 måneder eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Hvis der tilsættes ren ethanol til AW2, kan eventuelle ubrugte mængder opbevares ved 2-25 C i op til 2 måneder eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Når det rekonstituerede CAR tilsættes til AL, kan arbejds-al opbevares ved 2-8 C i op til 48 timer. C. HPV MMX og HPV Mg 2+ skal opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til de angivne udløbsdatoer. Efter åbning skal ubrugt materiale kasseres. Arbejds-Master Mix (forberedes ved at tilsætte HPV Mg 2+ til HPV MMX) skal opbevares ved 2-8 C og anvendes inden 6 timer efter forberedelsen. D. HPV ( ) C og HPV (+) C skal opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til de angivne udløbsdatoer. Efter åbning skal ubrugt materiale kasseres. E. HPV Strip skal opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan dette reagens holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning skal ubrugte strips kasseres. F. DN skal opbevares ved 2-25 C. Uåbnet kan DN holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning kan DN holde sig i 3 måneder ved 2-25 C (eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først). G. CIT, SA-HRP, SUB A og SUB B skal opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til de angivne udløbsdatoer. Efter åbning kan disse reagenser holde sig i 1 måned ved 2-8 C (eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først). H. SDS og SSPE skal opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til de angivne udløbsdatoer. Efter åbning kan disse reagenser holde sig i 1 måned ved 2-8 C (eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først). Der dannes et bundfald i SDS og SSPE ved opbevaring ved 2-8 C. Før brug skal de opvarmes ved 53 C ± 2 C i højst 30 minutter og mixes grundigt for at opløse bundfaldet. Arbejdshybridiserings- og vaskebuffere, der er forberedt ved fortynding af SDS og SSPE med destilleret eller deioniseret vand, skal opbevares ved stuetemperatur i en ren, lukket plastikbeholder og kan holde sig i 30 dage efter forberedelsen. I. Arbejdskonjugat skal være nyfremstillet for hver dag ved at mixe SA-HRP med arbejds-ambientvaskebuffer og kan holde sig i 3 timer ved den omgivende temperatur. J. Arbejdssubstrat skal være nyfremstillet for hver dag ved at mixe SUB A med SUB B og kan holde sig i 3 timer ved den omgivende temperatur, hvis det beskyttes mod lys. SUB A, SUB B eller arbejdssubstrat må ikke udsættes for metaller, oxideringsmidler eller direkte lys. K. Arbejdscitratbuffer, der er forberedt ved fortynding af CIT med destilleret eller deioniseret vand, skal opbevares ved stuetemperatur i en ren, lukket beholder og kan holde sig i 30 dage efter forberedelsen. MEDFØLGENDE MATERIALER A. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit AmpliLute Kit til ekstraktion af flydende medier (P/N: ) CAR (carrier-rna) PK (proteinase K) AVE (elueringsbuffer) AW2 (vaskebuffer 2) ATL (væv-lysisbuffer) AL (lysisbuffer) EXT (Column Extenders, 3 ml) EXTRN DA 7 Doc Rev. 11.0

8 VC (VacConnectors) ELT (elueringsglas, 1,5 ml) CLM (QIAamp MinElute Columns) B. LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT LINEAR ARRAY HPV Genotyping-test (P/N: ) HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV Master Mix) HPV Mg 2+ (LINEAR ARRAY HPV-magnesiumopløsning) HPV (+) C (positiv LINEAR ARRAY HPV-kontrol) HPV ( ) C (negativ LINEAR ARRAY HPV-kontrol) HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strip) Referenceguide (Referenceguide til LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen) C. LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK LINEAR ARRAY detektionskit (P/N: ) DN (denatureringsopløsning) SDS (SDS-koncentrat) SSPE (SSPE-koncentrat) SA-HRP (streptavidin/peberrodsperoxidasekonjugat) CIT (Citratkoncentrat) SUB A (substrat A) SUB B (substrat B) D. 24-Well Tray with Lid 24-brønds bakke med låg (P/N: ) NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Præamplifikation - Reagensforberedelsesområdet Til Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 skal der bruges MicroAmp -reaktionsrør (AB-nr. N ), Caps (AB-nr. N eller AB-nr. N ), bakke/holdere (AB-nr ) eller Ready-Pak MicroAmp Assembly (AB-nr ) og base (AB-nr. N ) Genlukkelig plastikpose Eppendorf Multipette -pipette* 1,0 ml eller 1,25 ml Eppendorf Combitip plus (steril, enkeltpakket)* Pipetter (kapacitet 50 µl og 125 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (DNA- og DNase-fri) Beskyttelseshandsker, uden talkum DA 8 Doc Rev. 11.0

9 Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet Eppendorf Multipette-pipette* 1,0 ml og 5,0 ml Eppendorf Combitip plus (steril, enkeltpakket)* Pipetter (kapacitet 20 µl, 200 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (DNA- og DNase-fri) Sterile 2,0 ml rør med skruelåg (Sarstedt eller tilsvarende) Racks til rør (Sarstedt eller tilsvarende) Ren ethanol - som opfylder ACS-specifikationerne Sterile, koniske polypropylenrør, 15 ml og 50 ml: (Corning og eller tilsvarende) Sterile serologiske engangspipetter (5 ml, 10 ml og 25 ml) Pipet-Aid (Drummond eller tilsvarende) Mikrocentrifuge (min. RCF x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller tilsvarende Vortex-mixer 56 C ± 2 C og 70 C ± 2 C tørvarmeblokke Vakuummanifold (f.eks. QIAvac 24, kat. nr , QIAvac 24 Plus, kat. nr med QIAvactilslutningssystem, kat. nr ) Vakuumkilde [f.eks. en pumpe, der kan levere et vakuum på -800 til -900 mbar, KNF Neuberger LABOPORT, model UN840.3FTP (115 V, 60 Hz) eller model N840.3FT.18 (230 V, 50 Hz) eller QIAGEN-vakuumpumpe, P/N: (110 V, 60 Hz), (115 V, 60 Hz) eller (230 V, 50 Hz)] med slanger til manifolden Vakuumregulator (QIAGEN kat. nr ), valgfri Prøveglas (2 ml, QIAGEN kat. nr ), valgfri Beskyttelseshandsker, uden talkum Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområde Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, P/N: ) Sterile serologiske engangspipetter af polystyren (5 ml, 10 ml og 25 ml) Multikanal-pipette (kapacitet 100 µl)* Pipetter (kapacitet 20 µl, 200 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (DNA- og DNase-fri) Vortex-mixer Destilleret eller deioniseret vand 53 C ± 2 C rystevandbad, der kan levere ca. 60 o/min (Bellco Hotshaker Plus, P/N: (115 V, 60 Hz) eller P/N: (230 V, 50 Hz) eller tilsvarende) 53 C ± 2 C vandbad Orbital shaker, der kan levere ca. 60 o/min Tang, rustfrit stål (VWR-nr.: eller tilsvarende) Vand-/kemikalie-/varmeresistent tusch (Sharpie Industrial Super Permanent Marker, P/N: eller tilsvarende) Vakuumaspirationsapparat med et passende væskeopsamlingsreservoir (PYREX kraftig kvalitetsfilterkolbe, Corning P/N: L eller tilsvarende) 12-nåls stream splitter/aspirator (Art Robbins Instruments, P/N: ) Blyringlod, 0,5 kg (VWR-nr.: eller tilsvarende) Opbevaringsflasker eller kolber, 1 l, 2 l og 3 l Bægerglas, 100 ml, 250 ml og 500 ml Beholdere med målestreger, 100 ml, 250 ml, 500 ml og 1 l Eppendorf Multipette-pipette* 50 ml Eppendorf Combitip plus (steril, enkeltpakket)* 50 ml-adapter Eppendorf Biopur (P/N: ) RBS35-bakkerengøringsopløsning (VWR nr.: PI27952 / Pierce nr.: 27952) Beskyttelseshandsker, uden talkum * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (DNA- og DNase-fri), hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner DA 9 Doc Rev. 11.0

10 INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver Kun cervikale celleprøver, som er indsamlet i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCytopløsning, er godkendt til brug sammen med LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen. Følg producentens anvisninger vedrørende indsamling af cervikale celleprøver i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-opløsning. B. Transport af prøver Cervikale celleprøver, som er indsamlet i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-opløsning, kan transporteres ved 2-30 C. Transport af cervikale celleprøver skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 18. C. Opbevaring af prøver Cervikale celleprøver indsamlet i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-opløsning kan opbevares ved 2-30 C i op til 6 måneder. BRUGSANVISNING Bemærk! Lad alle reagenser blive tempereret til stuetemperatur (15-30 C) før brug, medmindre andet er angivet. Undersøg visuelt alle reagenser for at se, om der er en tilstrækkelig mængde reagens, før testproceduren påbegyndes. Bemærk! Cervikale celleprøver skal have opnået stuetemperatur (15-30 C) før brug. Bemærk! Brug pipetter med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser, hvor det er angivet. Udvis stor omhu for at sikre selektiv amplifikation. Kørselsstørrelse: Hvert AmpliLute Liquid Media Extraction Kit indeholder reagenser til 50 test. Hvert LINEAR ARRAY Detection Kit indeholder reagenser til 96 test. Hver LINEAR ARRAY HPV Genotyping-test indeholder reagenser til fire kørsler af 12 test, der kan udføres separat eller samtidig. Der skal mindst inkluderes én bestemmelse af hver negativ LINEAR ARRAY HPV-kontrol og positiv LINEAR ARRAY HPV-kontrol i hver kørsel med op til 22 prøver (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Amplifikationsreagenserne er pakket i engangsflasker med 12 test. Negativ LINEAR ARRAY HPV-kontrol og positiv LINEAR ARRAY HPV-kontrol er pakket i engangsflasker. LINEAR ARRAY HPV Genotypingstripsene er pakket i engangsposer med 12 test. Den mest effektive anvendelse af reagenser, prøver og kontroller opnås ved at behandle dem i batches, der kan multipliceres med 12. Arbejdsgang: LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen kan udføres i løbet af én dag eller over to dage. Hvis testen skal afsluttes på en enkelt arbejdsdag, skal instruktionerne i del A til D følges i rækkefølge. Hvis testen skal udføres over 2 dage, kan proceduren afbrydes efter Prøve- og kontrolklargøring (del B) eller efter Amplifikation (del C). Hvis prøve- og kontrolforberedelse skal udføres dag 1, og amplifikation og detektion udføres dag 2, skal trin B.1 til B.29 udføres, og de behandlede prøver og kontroller opbevares som angivet i trin B.29. Begynd dag 2 med del A (reagensforberedelse), og optø derefter de behandlede prøver og kontroller ved stuetemperatur, og fortsæt med trin B.30. Bemærk! De behandlede prøver og kontroller må ikke optøs/nedfryses mere end 1 gang. Hvis prøve- og kontrolforberedelse samt amplifikation skal udføres dag 1, og detektion udføres dag 2, skal del A (Reagensforberedelse), B (Prøve- og kontrolforberedelse) og C (Amplifikation) udføres dag 1, og det denaturerede amplikon opbevares ved 2-8 C som angivet i trin C.6. Fortsæt med del D (Detektion af genotype med LINEAR ARRAY HPV-stripsen) næste dag. A. Reagensforberedelse Udført i: Præamplifikation Reagensforberedelsesområdet 1. Bestem det relevante antal reaktionsrør, der skal bruges til testen af prøver og kontroller. Placer rørene i MicroAmp-bakken, og lås den på plads med holderen. 2. Forbered arbejds-master Mix ved at tilsætte 125 µl HPV Mg 2+ til én flaske med HPV MMX. Det er ikke nødvendigt at måle Master Mix-volumen. Tilsæt 125 µl HPV Mg 2+ til hele flasken med HPV MMX. Sæt låg på flasken, og mix godt ved at vende flasken gange. Arbejds- Master Mix må ikke vortex-mixes. Den lyserøde farve i HPV Mg 2+ bruges som visuel bekræftelse af, at HPV Mg 2+ er blevet tilsat til HPV MMX. Kasser det resterende HPV Mg Tilsæt 50 µl arbejds-master Mix i hvert enkelt reaktionsrør med en Multipette-pipette eller en pipette med aerosolbarriere- eller positiv displaceringsspids. Undlad at sætte låg på reaktionsrørene på dette tidspunkt DA 10 Doc Rev. 11.0

11 4. Placer bakken med arbejds-master Mix og det relevante antal reaktionsrørslåg i en genlukkelig plastikpose, og luk plastikposen omhyggeligt. Gå til præamplifikation prøve- og kontrol - forberedelsesområdet. Opbevar bakken/bakkerne med arbejds-master Mix ved 2-8 C i præamplifikation - prøve- og kontrolforberedelsesområdet, indtil forberedelsen af prøver og kontroller er fuldført. Arbejds-Master Mix kan holde sig i 6 timer ved 2-8 C i reaktionsrør, der opbevares i den lukkede plastikpose. B. Prøve- og kontrolforberedelse Udført i: Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet 1. Indstil temperaturen i den ene tørvarmeblok til 56 C ± 2 C. 2. Indstil temperaturen i den anden tørvarmeblok til 70 C ± 2 C. 3. Temperér reagenser, prøver og kontroller til den omgivende temperatur (mindst 15 minutter). Hvis der dannes bundfald i ATL eller AL, skal de opløses ved at opvarme til 70 C og ryste forsigtigt. Bemærk! Trin B.4-B.6 kan udføres under inkubation af prøverne/kontrollerne med PK og ATL (trin B.10). 4. Opløs det frysetørrede CAR ved at tilsætte 310 µl AVE. Bland i 10 sekunder på vortex-mixer. Mærk røret med initialer og dato. Bemærk! Opløst CAR kan holde sig ved 2-8 C i op til 24 timer eller i afmålte mængder og nedfrosset ved -20 C i op til 2 måneder eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. Undgå at optø/nedfryse det opløste CAR mere end 3 gange. 5. Tilsæt 30 ml ren ethanol til AW2. Mærk flasken med initialer og dato. Mix det fortyndede AW2 ved at ryste det. Bemærk! Fortyndet AW2 kan opbevares ved stuetemperatur i op til 2 måneder eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der indtræder først. 6. Forbered arbejds-al ved at tilsætte de relevante mængder opløst CAR til AL som vist i tabel 1. Mix forsigtigt ved at vende røret 10 gange. For at undgå skumdannelse må der ikke blandes på vortex-mixer. Tabel 1 Forberedelse af arbejds-al Antal prøver/kontroller, der skal behandles Reagenser CAR (ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 0,20 0,25 AL (ml) 4,0 7,0 10,0 13,0 16,0 20,0 25,0 Bemærk! Arbejds-AL kan holde sig ved 2-8 C i op til 48 timer. 7. Sæt en etiket på et 2 ml rør med skruelåg til hver prøve og kontrol, der skal behandles. Bemærk! Brug IKKE 1,5 ml rør med skruelåg eller koniske rør, da disse vil interferere med varmeoverførslen under inkubationen og kan resultere i en ufuldstændig lysis. 8. Tilsæt 80 µl ATL til hvert rør. 9. Bland hver prøve og kontrol på vortex-mixer i 10 sekunder. Tilsæt 250 µl af hver prøve og kontrol til det relevante mærkede rør. 10. Tilsæt 20 µl PK til hvert rør. Sæt låg på rørene, og bland i 10 sekunder på vortex-mixer. Inkuber rørene ved 56 C ± 2 C i 30 minutter i en tørvarmeblok. 11. Saml vakuummanifolden QIAvac 24 (eller QIAvac 24 Plus) i overensstemmelse med håndbogen til QIAGEN-vakuummanifolden, mens prøverne og kontrollerne inkuberes. Fjern én CLM for hver prøve og kontrol fra blisterpakningen, og mærk den. Gem affaldsrørene til brug i trin B.23. Åbn låget på CLM, og indsæt den i VC. Indsæt EXT i CLM. 12. Tilsæt 250 µl arbejds-al til hvert rør efter inkubationen ved 56 C ± 2 C. Sæt låg på rørene, og bland i 10 sekunder på vortex-mixer ved maksimal hastighed. Bemærk! Der dannes muligvis et hvidt bundfald ved tilsætning af arbejds-al. Bundfaldet påvirker ikke prøve- og kontrolforberedelsen og opløses under den efterfølgende inkubation. 13. Inkuber rørene ved 70 C ± 2 C i 15 minutter i en tørvarmeblok. Bland jævnligt prøverne og kontrollerne på vortex-mixer i løbet af inkubationen DA 11 Doc Rev. 11.0

12 14. Tilsæt 300 µl ren ethanol til hvert rør efter inkubationen af prøverne og kontrollerne ved 70 C ± 2 C. Sæt låg på rørene, og bland i 15 sekunder på vortex-mixer ved maksimal hastighed. 15. Inkuber rørene ved den omgivende temperatur i 5 minutter. Centrifuger rørene ved hjælp af en bordcentrifuge ved maksimal hastighed. 16. Overfør lysatet fra hvert rør i den tilsvarende CLM. Lad det inkubere i mindst 1 minut. 17. Slå vakuumpumpen til. Brug vakuummet i manifolden for at fjerne alt lysatet, og lad vakuumpumpen køre i mindst 1 minut mere. Slå vakuummet i manifolden fra som beskrevet i håndbogen til QIAGEN-vakuummanifolden. Bemærk! Hvis lysatet fra en enkelt prøve eller kontrol ikke er passeret helt igennem membranen, skal CLM en placeres i et rent 2 ml-prøveglas, låget sættes på og prøveglasset centrifugeres ved maksimal hastighed i 1 minut, eller indtil lysatet er passeret helt igennem. Ekstra 2 ml-prøveglas kan købes separat (se NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER ). 18. Tilsæt 750 µl AW2 til hver CLM. Lad det inkubere i mindst 1 minut. 19. Slå vakuumpumpen til. Brug vakuummet i manifolden for at fjerne al væsken, og lad vakuumpumpen køre i mindst 1 minut mere. Slå vakuummet i manifolden fra som beskrevet i håndbogen til QIAGEN-vakuummanifolden. 20. Tilsæt 750 µl ren ethanol til hver CLM. Lad det inkubere i mindst 1 minut. 21. Slå vakuumpumpen til. Brug vakuummet i manifolden for at fjerne al væsken, og lad vakuumpumpen køre i mindst 1 minut mere. Slå vakuummet i manifolden fra som beskrevet i håndbogen til QIAGEN-vakuummanifolden. 22. Fjern forsigtigt EXT fra hver CLM. Kasser EXT. Bemærk! Undgå at komme i kontakt med CLM, mens EXT fjernes, for at forhindre krydskontaminering. 23. Placer hver CLM i affaldsrørene (fra Step B.11), og luk lågene. Centrifuger enhederne ved maksimal hastighed i 3 minutter. 24. Mærk én ELT for hver prøve og kontrol. 25. Kasser affaldsrørene, og placer hver CLM i den tilsvarende mærkede ELT. 26. Åbn lågene til hver CLM, og inkuber ved den omgivende temperatur i 15 minutter. 27. Tilsæt 120 µl AVE til hver CLM. Luk lågene. Bemærk! Kontroller, at AVE har opnået stuetemperatur, før den tilsættes til hver CLM. 28. Inkuber enhederne ved den omgivende temperatur i 5 minutter, og centrifuger dem derefter ved maksimal hastighed i 1 minut. 29. Fjern og kasser CLM fra enhederne, og sæt låg på rørene. Amplificer straks de behandlede prøver og kontroller, eller opbevar dem ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C. Behandlede prøver og kontroller kan opbevares ved stuetemperatur i op til 6 timer, ved 2-8 C i op til 7 dage eller ved -20 C eller koldere i op til 8 uger, men må højst optøs/nedfryses én gang. Hvis de nedfryses og optøs flere gange, kan det medføre signaltab. 30. Tilsæt 50 µl af hver behandlet prøve og kontrol i de relevante amplifikationsrør med arbejds- Master Mix. Brug en ny aerosolbarrierespids eller positiv displaceringsspids til hver prøve og kontrol. Sæt låg på amplifikationsrørene. Bemærk! Hvis de behandlede prøver og kontroller opbevares nedfrosset, skal de frosne, behandlede prøver og kontroller optøs ved stuetemperatur. Når de er optøet, skal hver behandlet prøve og kontrol blandes kraftigt på vortex-mixer i 10 sekunder. Hvis de behandlede prøver og kontroller opbevares ved 2-8 C, skal hver behandlet prøve og kontrol blandes kraftigt på vortex-mixer i 10 sekunder, før de tilsættes til arbejds-master Mix. Bemærk! Amplifikationen på Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 skal starte inden 45 minutter, efter at de behandlede prøver og kontroller er tilsat til arbejds-master Mix. 31. Flyt de forberedte prøver og kontroller i amplifikationsbakken til amplifikations-/ detektionsområdet. De resterende behandlede prøver og kontroller kan opbevares i henhold til instruktionerne i trin B DA 12 Doc Rev. 11.0

13 C. Amplifikation Udført i : Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområde 1. Placer bakke/holder-enheden i blokken på thermo cycleren. 2. Programmer Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 til LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen på følgende måde: HOLD-program: 2 min. 50 C HOLD-program: 9 min. 95 C CYCLE-program (40 cyklusser): 30 sek. 95 C, 1 min. 55 C, 1 min. 72 C (Rampehastighed = 50%) HOLD-program: 5 min. 72 C HOLD-program: 72 C i ubegrænset tid Indstil rampehastigheden i CYCLE-programmerne til 50%. Tilknyt brugernavn og metodenavn efter behov. Se i brugermanualen til Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 for at få yderligere oplysninger om programmering og betjening af thermo cycleren. 3. Start METHOD-programmet. Indstil Ramp Speed til Max og Reaction Volume til 100 µl i skærmbilledet Method Options. Tryk på START igen. Programmet kører i omkring 3 timer og 15 minutter. 4. Fjern bakken fra thermo cycleren inden for 4 timer efter start af det sidste HOLD-program, placer den i MicroAmp-basen, og fortsæt straks efter med trin 5. Lad ikke reaktionsrørene forblive i thermo cycleren i mere end 4 timer. DE AMPLIFICEREDE PRØVER MÅ IKKE MEDTAGES I PRÆAMPLIFIKATIONSOMRÅDET. AMPLIFICEREDE KONTROLLER OG PRØVER SKAL BETRAGTES SOM EN ALVORLIG KILDE TIL KONTAMINERING. 5. Tag forsigtigt lågene af reaktionsrørene for at undgå at danne aerosoler af amplifikationsprodukterne. Tilsæt straks 100 µl DN i den første kolonne (eller række) reaktionsrør med en multikanal-pipette med aerosolbarrierespids, og bland ved at afpipettere fem gange. Gentag denne procedure med et nyt sæt spidser for hver kolonne (eller række). 6. Det denaturerede amplikon må ikke opbevares ved stuetemperatur i mere end 5 timer, før der skal fortsættes til Detektion (del D). Hvis detektionsreaktionen ikke kan udføres inden for 5 timer, skal der sættes nye låg på rørene, og det denaturerede amplikon opbevares ved 2-8 C i op til 7 dage. D. Detektion af genotype med LINEAR ARRAY HPV-stripsen Udført i: Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområdet Bemærk! Undgå, at der kommer stænk fra prøverne mellem de enkelte brønde i løbet af detektionsproceduren. Undgå, at der stænkes vand fra badet til brøndene på bakken. Undgå at stable 24-brøndsbakkerne. 1. Opvarm alle detektionsreagenser til stuetemperatur. 2. Forvarm et vandbad til 53 C ± 2 C. 3. Forvarm rystebadet til 53 C ± 2 C ved en hastighed på ca. 60 o/min. Kontroller, at der er nok vand i badet til at opvarme 24-brøndsbakken, men ikke så meget, at der kommer stænk i 24-brøndsbakken. Vandet skal være i kontakt med ca. 1/4 af den ydre brønddybde eller 0,5 cm af 24-brøndsbakken. Bemærk! Der kan forekomme falsk-positive resultater, hvis vandet i vandbadet ikke er i ordentlig kontakt med 24-brøndsbakken. 4. Forbered arbejdshybridiseringsbuffer på følgende måde: Undersøg SSPE og SDS, og opvarm til 53 C ± 2 C i et vandbad for at opløse evt. bundfald, hvis det er nødvendigt. Tilsæt 100 ml SSPE til 388 ml destilleret eller deioniseret vand. Mix grundigt. Tilsæt 12,5 ml SDS, og mix grundigt. Der er nok arbejdshybridiseringsbuffer til 100 LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strips. Arbejdshybridiseringsbuffer skal opbevares ved stuetemperatur i en ren beholder og kan holde sig i 30 dage. 5. Forbered arbejds-ambient-vaskebuffer på følgende måde: Undersøg SSPE og SDS, og opvarm til 53 C ± 2 C i et vandbad for at opløse evt. bundfald, hvis det er nødvendigt. Tilsæt 133 ml SSPE til 2520 ml destilleret eller deioniseret vand. Mix grundigt. Tilsæt 13,3 ml SDS, og mix grundigt. Der er nok arbejds-ambient-vaskebuffer til 100 LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strips. Arbejds-ambientbuffer skal opbevares ved stuetemperatur i en ren beholder og kan holde sig i 30 dage DA 13 Doc Rev. 11.0

14 6. Forbered arbejds-stringent-vaskebuffer på følgende måde: Fjern 5 ml arbejds-ambientvaskebuffer (forberedt i forrige trin) for hver strip, der testes, og tilsæt den til en ren medieflaske af passende størrelse (til en kørsel med 24 strips fjernes f.eks. 120 ml arbejds-ambientvaskebuffer, som herefter tilsættes til medieflasken). Arbejds-stringent-vaskebuffer skal forberedes umiddelbart før hver kørsel. 7. Arbejdshybridiseringsbuffer og arbejds-stringent-vaskebuffer skal opvarmes i vandbadet ved 53 C ± 2 C i mindst 15 minutter. Lad arbejdshybridiseringsbufferen og arbejds-stringentvaskebufferen stå i vandbadet, indtil de skal bruges. 8. Forbered arbejdscitratbuffer på følgende måde: Undersøg CIT, og opvarm til 53 C ± 2 C i et vandbad for at opløse evt. bundfald, hvis det er nødvendigt. Tilsæt 25 ml CIT til 475 ml destilleret eller deioniseret vand. Mix grundigt. Der er nok arbejdscitratbuffer til 100 LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strips. Arbejdscitratbuffer skal opbevares ved stuetemperatur i en ren beholder og kan holde sig i 30 dage. 9. Fjern det nødvendige antal LINEAR ARRAY HPV Genotyping-strips fra HPV Strip-posen med en ren tang. 10. Mærk hver HPV Strip med det korrekte prøve- eller kontrol-id ved hjælp af en vand-/ kemikalie-/varmeresistent tusch. 11. Anbring hver strip med proberækkerne opad i den relevante brønd i 24-brøndsbakken. 12. Tilsæt 4 ml forvarmet arbejdshybridiseringsbuffer i hver brønd, der indeholder en mærket strip. 13. Tilsæt 75 µl denatureret amplikon til den relevante brønd, der indeholder en mærket strip, ved hjælp af en pipette med aerosolbarriere- eller positiv displaceringsspids. Vip forsigtigt bakken efter hver tilsætning. Brug en ny spids, hver gang der tilsættes amplikon. 14. Sæt låg på 24-brøndsbakken, og anbring den i rystebadet ved 53 C ± 2 C. Anbring et 0,5 kg blyringlod på bakkelåget for at holde 24-brøndsbakken på plads i rystevandbadet. Hybridiser i 30 minutter ved en hastighed på ca. 60 o/min. 15. Forbered arbejdskonjugat under hybridiseringen (trin 14) på følgende måde: Tilsæt 15 µl SA-HRP til 5 ml arbejds-ambient-vaskebuffer for hver strip, der testes. Mix grundigt. Arbejdskonjugat skal opbevares ved stuetemperatur i en ren beholder og kan holde sig i 3 timer. 16. Fjern 24-brøndsbakken fra rystevandbadet, og fjern arbejdshybridiseringbufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 17. Tilsæt 4 ml arbejds-ambient-vaskebuffer til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Vip forsigtigt 24-brøndsbakken 3-4 gange for at skylle stripsene, og afsug straks arbejds-ambientvaskebufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 18. Tilsæt 4 ml forvarmet arbejds-stringent-vaskebuffer til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Fjern eventuel kondens fra bakkelåget med en ren papirserviet, sæt låget på 24-brøndsbakken, og sæt 24-brøndsbakken tilbage i rystevandbadet ved 53 C ± 2 C. Anbring et 0,5 kg blyringlod på bakkelåget for at holde 24-brøndsbakken på plads i rystevandbadet. Inkuber i 15 minutter ved en hastighed på ca. 60 o/min. 19. Fjern 24-brøndsbakken fra rystevandbadet, og fjern arbejds-stringent-vaskebufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 20. Tilsæt 4 ml arbejdskonjugat til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Fjern eventuel kondens fra bakkelåget med en ren papirserviet, sæt låget på 24-brøndsbakken, og anbring 24-brøndsbakken på den orbitale shaker ved stuetemperatur. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur (15-30 C) ved en hastighed på ca. 60 o/min. 21. Fjern 24-brøndsbakken fra den orbitale shaker, og fjern arbejdskonjugatet fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 22. Tilsæt 4 ml arbejds-ambient-vaskebuffer til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Vip forsigtigt 24-brøndsbakken 3-4 gange for at skylle stripsene, og afsug straks arbejds-ambientvaskebufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 23. Tilsæt 4 ml arbejds-ambient-vaskebuffer til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Fjern eventuel kondens fra bakkelåget med en ren papirserviet, sæt låget på 24-brøndsbakken, og anbring 24-brøndsbakken på den orbitale shaker ved stuetemperatur i 10 minutter ved en hastighed på ca. 60 o/min. 24. Fjern 24-brøndsbakken fra den orbitale shaker, og fjern arbejds-ambient-vaskebufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 25. Tilsæt 4 ml arbejds-ambient-vaskebuffer til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Sæt låget på 24-brøndsbakken, og anbring 24-brøndsbakken på den orbitale shaker ved stuetemperatur i 10 minutter ved en hastighed på ca. 60 o/min DA 14 Doc Rev. 11.0

15 26. Fjern 24-brøndsbakken fra den orbitale shaker, og fjern arbejds-ambient-vaskebufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 27. Tilsæt 4 ml arbejdscitratbuffer til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Sæt låget på 24-brøndsbakken, og anbring 24-brøndsbakken på den orbitale shaker ved stuetemperatur i 5 minutter ved en hastighed på ca. 60 o/min. 28. Forbered arbejdssubstrat på følgende måde: Tilsæt 4 ml SUB A til 1 ml SUB B for hver strip, der testes. Mix grundigt. Arbejdssubstrat skal opbevares ved stuetemperatur i en ren beholder, beskyttet mod direkte lys, og kan holde sig i 3 timer. 29. Fjern 24-brøndsbakken fra den orbitale shaker, og fjern arbejdscitratbufferen fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 30. Tilsæt 4 ml arbejdssubstrat til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. Sæt låget på 24-brøndsbakken, og anbring 24-brøndsbakken på den orbitale shaker ved stuetemperatur i 5 minutter ved en hastighed på ca. 60 o/min. 31. Fjern 24-brøndsbakken fra den orbitale shaker, og fjern arbejdssubstratet fra brøndene ved hjælp af vakuumaspiration. 32. Tilsæt 4 ml destilleret eller deioniseret vand til hver brønd i bakken, der indeholder en strip. 33. Fjern strippene fra 24-brøndsbakken med en ren tang, placer dem på en ren og tør overflade og lad strippene lufttørre i mindst en time eller op til 72 timer ved stuetemperatur før fortolkning. Rengøring af 24-brøndsbakken Udført i: Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområdet Bemærk! 24-brøndsbakkerne kan kasseres eller genbruges. Hvis bakkerne skal genbruges, skal nedenstående rengøringsprocedure følges efter hver brug. 1. Forbered en 10% opløsning af RBS35 ved at tilsætte 1 del RBS35 til 9 dele destilleret eller deioniseret vand. 2. Fyld hver brønd på bakken med 10%-opløsningen, og lad det stå ved stuetemperatur til næste dag. 3. Skyl bakken grundigt med destilleret eller deioniseret vand. 4. Lad bakken tørre helt før brug. RESULTATER Kontroller, at kontrolresultaterne for kørslen er valide (se afsnittet Kvalitetskontrol). Hvis kørslen er invalid, skal hele kørslen gentages (prøveforberedelse, amplifikation og detektion af genotype med LINEAR ARRAY HPV-stripsen). Hvis kørslen er valid, skal LINEAR ARRAY HPV Genotyping-stripsen fortolkes ved at anbringe referencetabellen for LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen over stripsen i det udskårne område, så HPVgenotype-referencelinjerne vises på hver side af stripsen. Kontroller, at den sorte referencelinje (REF) på tabellen er ud for den sorte linje på HPV-stripsen. Registrer de positive, synlige bånd, og fortolk HPV- og ß-globin-resultaterne (BG) for hver strip på følgende måde: DA 15 Doc Rev. 11.0

16 HPVresultat BG Lowresultat BG Highresultat Fortolkning Invalidt resultat. HPV DNA blev ikke påvist, hvis det var til stede. Fravær af BG High- og BG Low-resultater tyder på utilstrækkelig prøveindsamling, behandling eller tilstedeværelse af hæmmere. Behandl en ny afmålt mængde af den oprindelige prøve, og gentag testen. Hvis den oprindelige prøve ikke er tilgængelig, skal der indsamles en ny prøve. Invalidt resultat. HPV DNA blev ikke påvist, hvis det var til stede. Fravær af BG Low tyder på utilstrækkelig prøveindsamling, behandling eller tilstedeværelse af hæmmere. Behandl en ny afmålt mængde af den oprindelige prøve, og gentag testen. Hvis den oprindelige prøve ikke er tilgængelig, skal der indsamles en ny prøve. HPV DNA ikke påvist. Et negativt resultat udelukker ikke tilstedeværelse af en HPV-infektion, da resultater er afhængige af korrekt prøvetagning, behandling, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med påviseligt HPV DNA. HPV DNA påvist (rapportgenotyper). Prøven er positiv for tilstedeværelsen af HPV. Fravær af BG Low og BG High tyder på utilstrækkelig prøveindsamling, behandling, tilstedeværelse af hæmmere eller konkurrence med et HPV-target med høj titer. Der kan forekomme flere HPV-genotyper, der ikke blev påvist. HPV DNA påvist (rapportgenotyper). Prøven er positiv for tilstedeværelsen af HPV. Fravær af BG Low tyder på utilstrækkelig prøveindsamling, behandling, fravær af hæmmere eller konkurrence med et HPV-target med høj titer. Der kan forekomme flere HPVgenotyper, der ikke blev påvist. HPV DNA påvist (rapportgenotyper). Prøven er positiv for tilstedeværelsen af HPV. Tilstedeværelsen af flere HPV-genotyper i prøven kan ikke udelukkes helt. Fortolkning af krydsreaktiv probe LINEAR ARRAY HPV Genotyping-stripsen indeholder en krydsreaktiv probe, der hybridiseres med HPVgenotype 33, 35, 52 og 58. Positive bånd-resultater for proben skal fortolkes på følgende måde: Båndresultat Fortolkning 33, 52/33/35/58 HPV 33* 35, 52/33/35/58 HPV 35* 58, 52/33/35/58 HPV 58* 52/33/35/58 HPV 52 * co-infektion med HPV-genotype 52 kan ikke udelukkes med disse testresultater. KVALITETSKONTROL Der skal udføres mindst én bestemmelse af den negative LINEAR ARRAY HPV-kontrol og én bestemmelse af den positive LINEAR ARRAY HPV-kontrol med hver kørsel af op til 22 prøver. Som ved alle nye laboratorieprocedurer bør nye brugere overveje at bruge ekstra positive og negative kontroller, hver gang testen udføres, indtil de har opnået en høj grad af fortrolighed med hensyn til at udføre proceduren korrekt. Der er ikke nogen krav med hensyn til kontrollernes position i MicroAmp-bakken. Prøver og kontroller fra separate prøveforberedelseskørsler kan amplificeres og detekteres samtidigt. Hver enkelt prøveforberedelseskørsel skal dog valideres individuelt med det kontrolsæt, der følger med kørslen. Det er derfor muligt at afvise én kørsel af prøver fra en normal amplifikations- og/eller detektionskørsel, mens en anden kørsel godkendes, afhængig af performance for de kontroller, der måles sammen med de pågældende prøver. Alle testprøver og -kontroller, der er forberedt i samme kørsel, skal amplificeres og detekteres i tilstødende positioner i thermo cycleren og på detektionsbakken. Den nøjagtige rækkefølge af prøvernes og kontrollernes placering i thermo cycleren eller på detektionsbakken er ikke afgørende DA 16 Doc Rev. 11.0

17 Negativ kontrol Analyseresultatet for den negative LINEAR ARRAY HPV-kontrol må ikke indeholde positive bånd. Hvis der er synlige, positive bånd, er hele kørslen invalid. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrol - forberedelse, amplifikation og detektion af genotype med LINEAR ARRAY HPV-stripsen). Hvis den negative LINEAR ARRAY HPV-kontrol konstant giver resultater med positive bånd, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. Positiv kontrol Analyseresultatet for den positive LINEAR ARRAY HPV-kontrol skal give et positivt resultat fortolket som HPV 16, ß-Globin høj og ß-Globin lav. Det lave ß-Globin-bånd er svagt i forhold til det høje ß-Globinbånd, men skal være synligt. Hvis den positive LINEAR ARRAY HPV-kontrol ikke giver nøjagtigt dette resultat, er hele kørslen invalid. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion af genotype med LINEAR ARRAY HPV-stripsen). Hvis den positive LINEAR ARRAY HPVkontrol konstant giver resultater med et andet mønster af positive bånd, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. På grund af testens høje analytiske sensitivitet skal der udvises stor omhu for at bevare renheden i reagenser og amplifikationsblandinger i kittet. Renheden af alle reagenser skal overvåges nøje. Kasser alle suspekte reagenser. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE 1. Denne test er godkendt til brug sammen med humane cervikale celler, som er indsamlet i cobas PCR Cell Collection Media eller PreservCyt-opløsning. Test af andre prøvetyper kan resultere i falsk-negative eller falsk-positive resultater. 2. Denne test er kun valideret til brug med AmpliLute Liquid Media Extraction-kittet. Test med andre prøveekstraktionsprocedurer kan medføre ukorrekte resultater. 3. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvetagning, transport, opbevaring og behandling. 4. Detektionen af HPV er afhængig af det antal virusgenomer, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøvetagningsmetoder, patientfaktorer (dvs. alder, forekomst af symptomer) og/eller infektionsstadiet. 5. Der kan forekomme falsk-negative resultater pga. polymerase-hæmning eller celle - utilstrækkelighed. Der er tilsat ß-globin-amplifikation til LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen for at gøre det muligt at identificere behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan interferere med PCR-amplifikationen eller en utilstrækkelig celleindsamling. 6. Tilstedeværelsen af AmpErase-enzym i LINEAR ARRAY HPV Master Mix reducerer risikoen for amplikon-kontaminering. Kontaminering fra HPV-positive kontroller og prøver kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 7. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. 8. Det er kun Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700, der er valideret til brug med dette produkt. Det er kun thermo cyclerne GeneAmp PCR System 2400, GeneAmp PCR System 9600 eller GeneAmp PCR System 9700 med aluminiumsblok, der kan bruges med dette produkt. 9. Prøver, der indeholder Advantage-S Bioadhesive Contraceptive Gel, kan interferere med LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testens performance og give falsk-negative eller invalide resultater. 10. Prøver, der indeholder mere end 3,5% (v/v) blok, har vist sig at hæmme PCR-amplifikationen og kan give falsk-negative resultater. 11. Identifikation af HPV-genotype 64 og 69 er baseret på LINEAR ARRAY HPV Genotypingtestresultater for HPV-genotype 64- og 69-plasmid-DNA. HPV-genotype 64 og 69 blev ikke detekteret i en klinisk prøve under evalueringen af performance. 12. Selvom de er sjældne, kan mutationer i den bedst konserverede region i virusgenomet, som er dækket af LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testens primere og/eller prober, bevirke, at en bestemt genotype ikke detekteres. 13. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metode - korrelationsundersøgelser i laboratoriet for at fastlægge teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden DA 17 Doc Rev. 11.0

18 INTERFERERENDE STOFFER Følgende almindelige personlige hygiejneprodukter til kvinder, smøremidler, anti-svampemidler og svangerskabsforebyggende gel påvirker ikke LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testens performance. Tabel 2 Produktnavn Ortho Options Delfen vaginal kontraceptiv skum Mycelex 3 svampemiddel Clotrimazole 3 vaginalcreme Vagi-Gard medicinsk creme Gyne-Lotrimin 3 vaginalcreme Vagisil creme mod kløe Gynecort 1% hydrocortison-creme mod kløe Yeast Gard homøopatisk vaginalstikpille Vaginex hydrocortison-formel Betadine medicinsk badkoncentrat Miconazole udvortes vulvacreme Monistat 3, kombinationspakke med vaginalt svampemiddel Norforms deodorantstikpille K-Y Brand glidecreme Vagisil personligt smøremiddel Der blev observeret falsk-negative og/eller invalide resultater for HPV-positive prøver, der indeholdt Advantage-S Bioadhesive Contraceptive Gel ved koncentrationer på 0,11 g/20 ml og højere. Der blev observeret falsk-negative resultater for HPV-positive prøver, der indeholdt mere end 3,5% (v/v) blod. Der blev ikke observeret falsk-negative eller invalide resultater for HPV-positive prøver, der indeholdt endocervikalt eller exocervikalt sekret DA 18 Doc Rev. 11.0

19 UDBREDELSE AF HPV-GENOTYPER Udbredelsen og fordelingen af HPV-genotyper har vist sig at variere efter geografiske områder på verdensplan Herudover viser det sig, at flere genotyper, f.eks. 55, 64 og 69, er hidtil ukendte genotyper, der er rapporteret ved lav udbredelse og ikke er forbundet med cervikal cancer 20,22. De mest almindelige HPV-genotyper, der er forbundet med cervikal cancer med faldende udbredelse eller frekvens, er type 16, 18, 45 og 31. Frekvensvariationen i den geografiske fordeling er fundet for de fleste genotyper, herunder 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59 og 68. Tabel 3 Rapporteret udbredelse af HPV-genotyper i kontrol- og cervikal cancer-tilfælde HPV-genotype Prævalens (%) 16 7,5 56,0 18 2,3 22,1 45 2,4 7,9 58 0,2 5,4 53 0,0 5,2 33 1,0 4,4 31 2,0 4,2 52 0,5 4, ,0 3,6 39 0,0 3,3 61 0,0 3,2 35 0,4 2,7 56 0,2 2,5 66 0,0 2,4 84 2,3 6 0,3 2,3 81 0,1 2,3 70 0,0 2,3 59 0,0 2,1 CP6108 0,0 1,8 83 1,6 72 0,0 1,5 68 0,1 1,2 42 0,0 1,2 43 0,0 1,2 55 1,1 73 0,1 1,0 11 0,1 0,8 40 0,0 0,8 82 0,0 0,6 67 0,5 44 0,0 0,4 69 0,2 71 0,2 IS39 0,2 26 0,0 0,2 64 0, DA 19 Doc Rev. 11.0

20 EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE A. Detektionsgrænse Detektionsgrænsen blev bestemt for 18 HPV-genotyper (6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 og 82). Plasmid DNA [kvantificeret ved spektrofotometri (260 nm absorption)] for hver genotype blev fortyndet til mindst 5 koncentrationer i PreservCyt-opløsning med 250 ng/ml humant genomisk DNA som diluent. To operatører udførte hver mindst 4 kørsler, hvor hver kørsel bestod af mindst 3 bestemmelser pr. koncentrationsniveau, til i alt mindst 24 bestemmelser pr. niveau. Der blev foretaget en Probit-analyse for hver af disse 18 HPV-genotyper, og den prædiktive 95% positive hit ratekoncentration for hver genotype vises i tabel 4. Derudover viser tabel 4 det laveste koncentrationsniveau med en observeret hit rate 95%, og hvor alle højere koncentrationsniveauer havde en observeret positiv hit rate 95%. Tabel 4 Detektionsgrænseresultater for LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen HPV-genotype Probit-prædiktiv 95% hit rate-koncentration (c/ml) Observeret LOD (Koncentration 95 % positiv hit rate) (c/ml) # # # * 33 # ** 35 # # # # # # # # # Identificeret som høj risiko-genotyper, der forbindes med high-grade cervikal dysplasi og cervikal cancer 3-5. * For genotype 31 blev der observeret hit rates > 95% ved 2.000, 1.300, 900 og 660 c/ml, og 92% hit rates blev observeret ved og c/ml. ** For genotype 33 blev der observeret hit rates > 95% ved og c/ml, en 92% hit rate blev observeret ved c/ml, og en 94% hit rate blev observeret ved c/ml. B. Genotype-inklusivitet: Plasmid-DNA Genotype-inklusiviteten blev bestemt ved at analysere 36 HPV-genotypeplasmider (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 og CP6108). Plasmid-DNA for HPV-genotype 52 var ikke tilgængelig for testen. Inklusivitet for HPVtype 52 blev påvist i undersøgelser med en klinisk prøve (afsnit C). Inklusiviteten for HPV-genotype 6, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 og 82 blev påvist i detektionsgrænse - undersøgelsen. De resterende 18 tilgængelige HPV-genotypeplasmid-DNA-stammer blev kvantificeret ved spektrofotometri (260 nm absorption), fortyndet til 900 kopier/ml i PreservCyt-opløsning og derefter testet i 6 bestemmelser ved hjælp af to reagenslot. For de HPV-genotyper, der ikke blev påvist ved en 100% positivitetsfrekvens ved 900 kopier/ml, blev der foretaget yderligere test med højere plasmid-dnakoncentrationer, indtil der blev bestemt et 100% inklusivitetsniveau (n=6) for den pågældende genotype. Resultaterne påviste, at LINEAR ARRAY HPV Genotyping-testen kan detektere 36 HPV-genotyper fra HPV plasmid-dna ved forskellige koncentrationsniveauer afhængig af HPV-genotypen (tabel 5) DA 20 Doc Rev. 11.0