FACTOR V LEIDEN KIT. Til brug med LightCycler 1.2-instrumentet. Til in vitro-diagnostik.

Transkript

1 REF FACTOR V LEIDEN KIT Til brug med LightCycler 1.2-instrumentet (I EU: Serienummer 2021 til 5602) Kit til 32 reaktioner til højst 30 prøver Til in vitro-diagnostik. DETTE PROGRAM MÅ IKKE BRUGES I CANADA, DA LIGHTCYCLER 1.2-INSTRUMENTET IKKE ER LICENSERET SOM MEDICINSK UDSTYR. TILSIGTET BRUG Med Factor V Leiden-kittet kan bruges til detektion og genotypebestemmelse af DNA isoleret fra humant perifert blod. Faktor V Leiden-mutationen er en punktmutation (G til A ved position 1691) i det humane Factor V-gen. Testen udføres på LightCycler 1.2-instrumentet ved hjælp af en PCRreaktion (Polymerase Chain Reaction) til amplifikation af Factor V-DNA fra kliniske prøver. Fluoroserende target-dna-specifikke hybridiseringsprober bruges til detektion og genotypebestemmelse af det amplificerede Factor V-DNA. Factor V Leiden-testen er en in vitro-diagnostisk analyse til påvisning og genotypebestemmelse af Factor V Leiden-mutationen som en hjælp ved diagnostik af patienter, der er mistænkt for at have trombofili. Testen er beregnet til brug på LightCycler 1.2-instrumentet (i EU: Serienummer 2021 til 5602) med LightCycler Software 3.5. Prøveforberedelsen skal udføres i overensstemmelse med nedenstående arbejdsgang. FORKLARING AF TESTEN Personer, der arver trombofili, er prædisponerede for trombotiske hændelser, f.eks. venøs trombose, der er den tredjemest almindelige hjerte-karsygdom (1). Aktiveret protein C-resistens (APC) betragtes som den mest fremherskende abnormitet, der er forbundet med venøs trombose (1, 2). En punktmutation ved position 1691 i Factor V-genet, der kaldes Factor V Leiden-mutationen, medfører, at et arginin substitueres med glutamin på position 506 i Factor V-proteinet og gør det delvist resistent over for inaktivering ved APC. Genetisk analyse har vist, at denne mutation, som har en relativ høj forekomst i den generelle befolkning (f.eks. ca. 5% hos den kaukaside race), er skyld i 85-95% af tilfælde med APC-resistens (2). TESTPRINCIP/OVERSIGT Forberedelse af prøver Prøveforberedelsen kan foretages manuelt eller automatisk ved hjælp af High Pure PCR Template Preparation Kit eller på MagNA Pure LC-instrumentet med MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Detektion 1. Et 222 bp-fragment af Factor V-genet amplificeres fra humant genomisk DNA ved hjælp af specifikke primere. 2. Amplikonet detekteres ved fluorescens ved hjælp af et specifikt H-probepar. H-proberne består af to forskellige oligonukleotider, der hybridiseres til en intern sekvens af det amplificerede fragment under annealingfasen i PCR-cyklussen. Én probe mærkes ved 5'-enden med LightCycler Red 640-N-hydroxy-succinimid-ester (Red 640-NHS-ester), og modificeres ved 3'-enden ved hjælp af fosforylering for at undgå ekstension. Den anden probe mærkes ved 3'-enden med fluorescein. 3. Det er først efter hybridisering til skabelon-dna'et, at de to prober kommer tæt nok på hinanden, hvilket resulterer i overførsel af resonansfluorescensenergi (FRET) mellem de to fluoroforer. LightCycler 1.2-instrumentets lyskilde, exiterer donerprobens fluerosin. En del af denne exiteringsenergi transporteres til LightCycler Red 640-NHS-ester på accepterproben. 4. Den fluorescens, der udsendes fra LightCycler Red 640-NHS ester, måles derefter af LightCycler 1.2-instrumentet. Genotypebestemmelse H-proberne anvendes desuden til at bestemme genotypen ved at foretage en smeltekurveanalyse, efter amplifikationscyklussen er fuldført, og amplikonet er tilstede med en forøget koncentration. Den Red 640-mærkede H-probe hybridiseres til en del af targetsekvensen, der ikke er muteret og fungerer som en ankerprobe. Den fluorescein-mærkede H-probe spænder over mutationsstedet (mutationsprobe). Under smeltekurveanalysen medfører de forhøjede temperaturer, at fluorescensen mindskes, idet den korteste af de to prober (mutationsproben) smelter fra først, og de to fluorescensfarver ikke længere er tæt nok på hinanden. Hvis Factor V Leiden-mutationen er tilstede, vil uoverensstemmelsen mellem mutationsproben og target destabilisere hybridiseringen, så den formindskede fluorescens vil ske ved en lavere temperatur. Med vildtypen forekommer der ingen uoverensstemmende genotyper, og heteroduplexet har derfor et højere smeltepunkt (T m ). Heterozygot-genotypen udviser en karakteristisk kombination af egenskaber. 1

2 REAGENSER ARBEJDSOPLØSNINGER 1. FVL MD Mix (Factor V Leiden Mutation Detection Mix) 1 78 µl 2. FVL R Mix (Factor V Leiden-reaktionsmix) 1 78 µl 3. FVL CT (Factor V Leiden-kontrolskabelon) 1 50 µl 4. FVL DIL (Factor V Leiden-diluent) 1 1 ml <0,01% FVL-primer fremadrettet og revers <0,01% FVL H-probe Red 640 <0,01% FVL H-probe fluorescein Tris-HCl-buffer <0,01% Taq DNA-polymerase, GMP-kvalitet <0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp <0,01% kontrolskabelon-dna indeholder plasmid: pcrf5 WT og pcrf5mut Brij 35 MgCl 2 Brij 35 MgCl 2 H 2 O, PCR-kvalitet (bruges også som negativ kontrol ved amplifikation) ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Polymorfi I Factor V-genet kan der forekomme mutationer ud over FVL-mutationen ved position 1691, og mutationsproben spænder over disse ekstra mutationer. Tre sjældne mutationer vil føre til et falskt positivt resultat efter udførelse af smeltekurveanalysen (dvs. mutationerne A1692C, G1689A og A1696G). Bemærk! Factor V Leiden-testen kan udføres i tilknytning til eller efter en funktionel analyse, der registrerer den fenotypeaktiverede protein C-resistens (APC). Det er kun FVL-mutationen, og ikke de ovennævnte tre sjældne mutationer, der kædes sammen med APC-resistens. Krav til håndtering TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. Der skal tages de samme forholdsregler som ved håndtering af normale laboratoriereagenser. Denne test er beregnet til humant fuldblod, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA eller citrat. Heparin kan påvirke PCR-reaktionen og må ikke bruges med denne procedure. Arbejdsgangen i laboratoriet skal ske i overensstemmelse med god laboratoriepraksis og skal desuden være envejs (dvs. prøveforberedelse, opsætning af PCR, og PCR-kørslen med LightCycler 1.2-instrumentet skal foregå fysisk adskilt). Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes. Luk alle flasker straks efter brug for at undgå spild, varierende bufferkoncentrationer eller varierende bufferforhold. Opbevar alle flasker, der har været åbnet, i oprejst tilstand. Reagenser fra forskellige lotnumre må ikke blandes. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. Undgå kontakt mellem hud eller slimhinder og lysis-/bindingsbuffer og vaskebuffer I fra MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I eller bindingsbuffer og Inhibitor Removal-buffer fra High Pure PCR Template Preparation-kittet. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis der spildes reagens, skal der fortyndes med vand, før det tørres op. Lysis-/bindingsbufferen fra MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, der indeholder guanidinthiocyanat må ikke komme i kontakt med natriumhypoklorit (blegemiddel) eller stærke syreopløsninger. Denne blanding kan danne en meget giftig gas. Laboratorieprocedurer Alt materiale, der stammer fra mennesker, og affald herfra skal betragtes som potentielt smittefarligt. Rengør grundigt, og desinficer alle arbejdsoverflader med et desinficerende middel, som anbefales af de lokale myndigheder. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Brug ikke mundpipette. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Undgå bakterie- og nukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. Affaldshåndtering Reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger hos Roche. Forberedelse af prøver Se sikkerhedsinstruktionerne på pakningsindlægget til MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I eller High Pure PCR Template Preparation Kit for at få oplysninger om håndtering og bortskaffelse. MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I eller High Pure PCR Template Preparation Kit skal opbevares ved stuetemperatur (+15 C til +25 C). Før brug af lysis-/bindingsbuffer i MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I skal opløsningen omrystes for at opløse bundfaldet. Opløsningerne må ikke opbevares ved lavere temperatur end stuetemperatur. Brug kun MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (kat. nr ) eller MagNA Pure LC Reagent Tub (stor) (kat. nr ) på de positioner, der er angivet af MagNA Pure LC-instrumentet med denne procedure. Amplifikation og detektion Se brugerhåndbogen til LightCycler 1.2-instrumentet før brug af dette kit. Notér LightCycler -prøvekarrusel-id'et. Oplysningerne skal indeholde LightCycler -prøvekarrusellens position, kapillærrørnummer og det navn, der er tilknyttet hver prøve, for at sikre korrekt prøveidentifikation. Sammenlign de Factor V Leiden-specifikke instrumentindstillinger på programmeringsskærmen på LightCycler 1.2-instrumentet straks efter indtastning, eller senest lige før kørslen på LightCycler 1.2-instrumentet påbegyndes, med de instrumentindstillinger, der er trykt på den sidste side i dette pakningsindlæg (tabel 2). Overfladen af kapillærrørene må ikke berøres. Brug altid beskyttelseshandsker i forbindelse med håndtering af kapillærrørene. Sikkerhedsforanstaltninger for håndtering af LightCycler 1.2-instrumentet Følg alle generelle sikkerhedsforanstaltninger for elektriske instrumenter. Berør aldrig kontakter eller strømførende ledninger med våde hænder. Instrumenthuset må ikke åbnes. Rengør aldrig instrumentet uden at slukke for det og trække strømkablet ud. Bemærk! Det er kun autoriserede servicemedarbejdere, der må udføre service eller reparationer af enheden. Thermo cycler-kammeret må ikke åbnes under drift. Thermo cycler-låget og prøvekarrusellen er varme under instrumentets drift. 2

3 Elektrisk sikkerhed for LightCycler 1.2-instrumentet LightCycler 1.2-instrumentet er udviklet i overensstemmelse med beskyttelsesklasse I (IEC). Hvis strømkablet revner, er flosset, ødelagt eller på anden måde beskadiget, skal det straks udskiftes med den tilsvarende reservedel fra Roche Diagnostics. Vedligeholdelse af LightCycler 1.2-instrumentet Generel vedligeholdelse Se brugerhåndbogen til LightCycler 1.2-instrumentet. Rengøringsinstruktioner Der må ikke hældes væske i thermo cycler-kammeret. Håndtering og bortskaffelse af smitsomt materiale skal foregå i overensstemmelse med de lokale sikkerhedsbestemmelser. Rengør instrumenthuset med en mild sæbeopløsning. Brug evt. 70% ethanol til at desinficere instrumenthuset. Hvis der sker brud på kapillærrør, skal LightCycler -prøvekarrusellen rengøres ved at fjerne kapillærrørfragmenterne med de medfølgende børster. Forebyggende vedligeholdelse Inspicer jævnligt området omkring analyseinstrumentet for at kontrollere, at der er fri luftgennemstrømning rundt om instrumentet, og at bøger, papir eller andre materialer ikke hindrer luftgennemstrømningen. LightCycler -arbejdsstation Konfigurationen af computerarbejdsstationen kan variere fra land til land og kan ændre sig efter tilgængelighed af komponenter og tekniske fremskrift. Kontakt den lokale Roche-repræsentant for at bekræfte den nøjagtige konfiguration og for at få teknisk hjælp. HÅNDTERING AF REAGENSER 1. FVL MD Mix (gult låg, rør 1), klar til brug Opbevares ved -15 C til -25 C. Skal beskyttes mod lys! 2. FVL R Mix (rødt låg, rør 2), klar til brug Opbevares ved -15 C til -25 C. 3. FVL CT (lilla låg, rør 3), klar til brug Opbevares ved -15 C til -25 C 4. FVL DIL (farveløst låg, rør 4), klar til brug Opbevares ved -15 C til -25 C OPBEVARING/HOLDBARHED (REAGENSER) Det uåbnede kit skal opbevares ved -15 C til -25 C indtil udløbsdatoen, der er trykt på mærkaten. Beskyt FVL MD Mix (rør 1, gult låg) mod lys! Optø komponenterne i Factor V Leiden-kittet, bland grundigt, og opbevar blandingen på is. Nedfryses straks efter brug. Kit-reagenser kan nedfryses og optøs op til fem gange. INDSAMLING/FORBEREDELSE OG HOLDBARHED AF PRØVER Oprensningen af genomisk DNA fra humant blod skal udføres ved hjælp af High Pure PCR Template Preparation Kit (kat. nr ) eller MagNA Pure DNA Isolation Kit I (kat. nr ) i kombination med MagNA Pure LC-instrumentet (kat. nr ) som beskrevet nedenfor. EDTA- eller citratantikoaguleret, perifert humant blod kan holde sig i mindst 7 dage ved +2 C til +8 C. Det kan opbevares nedfrosset ved -20 C i op til 12 måneder og optøs én gang. Elueret DNA kan opbevares i en lukket prøvekassette eller i Sarstedt-rør med skruelåg ved +2 C til +8 C i op til 7 dage. Det er langtidsholdbart (ca. 3 uger) ved -15 C til -25 C. Elueret DNA kan nedfryses og optøs op til tre gange. MEDFØLGENDE MATERIALER Se afsnittet Reagenser arbejdsopløsninger på side 2. NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER OG ENHEDER LightCycler 1.2-instrument (EU: Serienummer 2021 til 5602, kat. nr ) Bemærk! I USA gælder muligvis andre katalognumre. Kontakt salgskontoret i USA for at få yderligere oplysninger. LightCycler -software 3.5 (kat. nr ) LightCycler -kapillærrør (20 µl) (kat. nr ) High Pure PCR Template Preparation Kit (kat. nr ) Mikrocentrifugerør, 1,5 ml, sterile, nukleasefri Ethanol p.a. Isopropanol p.a. H 2 O, dobbeltdestilleret, nukleasefrit MagNA Pure LC-instrument (kat. nr ) MagNA Pure-software eller nyere (kat. nr ) MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. nr ) LC-karruselcentrifuge [kat. nr (230 V) eller (115 V)]. I forbindelse med en nyanskaffelse bestilles LC Carousel Centrifuge 2.0 [kat. nr (230 V) eller (115 V)]. I dette tilfælde LC Carousel Centrifuge 2.0 Bucket 2.1 (kat. nr )* kræves også Sarstedt-rør med skruelåg, 1,5 ml, sterile *Se brugerhåndbogen til LightCycler 1.2-instrumentet, eller kontakt teknisk support for at få tilsvarende centrifugespecifikationer, hvis en LC-karruselcentrifuge ikke er tilgængelig. I dette tilfælde skal desuden anvendes LightCycler -centrifugeadaptere (kat. nr ). VALGFRI MATERIALER Thrombophilia Post-Elution Protocols CD (kat. nr ) MagNA Pure LC-barkodemærkater (kat. nr ) MagNA Pure LC Barcode Reader Quick Scan 1000 MagNA Pure LC Barcode Printer Ribbon (kat. nr ) (kat. nr ) MagNA Pure LC-køleblok, LC-prøvekarrusel (kat. nr ) MagNA Pure LC Barcode Printer TLP 2844 (kat. nr ) LightCycler Capping Tool (kat. nr ) Alm. laboratorieudstyr 3

4 ANALYSEPROCEDURE ➀ Automatisk prøveforberedelsesprocedure for 15 eller 30 prøver ved hjælp af MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. nr ) i kombination med MagNA Pure LC-instrumentet (kat. nr ) A. OPRENSNING Før start Sæt MagNA Pure LC-køleblokken og LC-prøvekarrusellen (kat. nr ) i et køleskab ved +2 C til +8 C (i mindst 2 timer). Start af MagNA Pure LC-instrumentet og softwaren 1. Tænd for MagNa Pure LC-instrumentet, og tænd derefter for computeren. 2. Start MagNA Pure LC-softwaren og klik derefter på knappen Sample Ordering på skærmen Main Menu. 3. Vælg protokollen med navnet DNA I Blood Cells Fast Protocol på skærmen Sample Ordering, og indtast derefter lotnumrene på MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. nr ) og Factor V Leiden-kittet, og indtast LightCycler -karrusel-id'et(der må ikke redigeres i andre indstillinger). 4. Indtast den negative kontrol (FVL DIL, rør 4, farveløst låg) i række 1 i prøveordretabellen (position A1) ved at skrive Negativ kontrol. Indtast 50 µl som prøvevolumen og 0 µl som fortyndingsvolumen (forudindstillet). Elueringsvolumen er forudindstillet til 100 µl. 5. Start i række 1 (position B1) med at indtaste prøvenavnene, eller brug MagNA Pure LC-barkodelæseren (valgfrit). Indtast 50 µl som prøvevolumen og 0 µl som fortyndingsvolumen (forudindstillet). Elueringsvolumen er forudindstillet til 100 µl. 6. Gem og udskriv prøveordrefiloplysningerne. 7. Brug funktionen Print Sample Names til at lave en udskrift med prøvenavnene og deres position i prøvekassetten (valgfrit). 8. Udskriv Cartridge Barcode-mærkaterne i tredobbelt bestemmelse (valgfrit). 9. Sæt barkodemærkater på prøvekassetten (til eluering) og udskrifterne (valgfrit). 10. Klik på Stage Setup. Forberedelse af proteinase K-arbejdsopløsning (nok til 32 prøver) 1. Tilsæt 3 ml elueringsbuffer (flaske 6, gult låg) til ét rør med proteinase K, frysetørret (rør 4, lyserødt låg). Tilsæt yderligere 2ml elueringsbuffer, når proteinase K er helt opløst, for at opnå en endelig volumen på 5 ml. 2. Sæt låg på røret, og bland godt. Bemærk! Opbevar den solubiliserede opløsning ved +2 C til +8 C i rør 4 (i op til 4 uger), hvis den ikke anvendes samme dag. Alle andre reagenser er klar til brug. Indsættelse af reagenser og engangsplastikmaterialer Bemærk! Brug ikke MagNA Pure LC Tub 30. Brug kun MagNA Pure LC Medium Reagent Tub 20 (kat. nr ) eller MagNA Pure LC Reagent Tub (stor) (kat. nr ) på de positioner, der er angivet af MagNA Pure LC-instrumentet med denne procedure. Statussen for Heat Unit og Cool Units 1 & 2 skal vises i displayet som PASS, før reagensbeholderne fyldes med MGP-opløsningen (magnetiske glaspartikler). 1. Fyld reagensbeholderne manuelt (uden for MagNA Pure LC-instrumentet) med de mængder, der angivet på skærmen Start Information (på grafikken Stage Layout), og sæt derefter låg på. Placer de fyldte reagensbeholdere i reagensreservoirracket på de positioner, der er angivet på skærmen Start Information [undtagen MGP-opløsningen, se trin 4]. 2. Placer de øvrige nødvendige engangsplastikmaterialer (som angivet) og det klargjorte reagensreservoirrack på reagens-/prøveenheden i overensstemmelse med oplysningerne på skærmen Start Information. 3. Overfør manuelt 50 µl resuspenderet EDTA- eller citratantikoaguleret humant perifert blodprøve direkte til prøvekassetten (uden for MagNA Pure LC-instrumentet) i overensstemmelse med prøveordrelisten. 4. Bland MGP-røret grundigt på vortex-mixer, umiddelbart inden kørslen startes, fyld en reagensbeholder med MGP-opløsningen, sæt det tilhørende låg på, og placer den på instrumentets reagens-/prøveenhed i den position, der er angivet på skærmen Start Information. 5. Placer prøvekassetten i MagNa Pure LC-instrumentet. Oprensningskørsel 1. Bekræft hver indlæst position på MagNA Pure LC-instrumentet ved hjælp af musen på skærmen (Start Information). Når alle elementer er bekræftet, vises knappen OK. 2. Fjern låget fra rørene, og luk låsestanden og døren på MagNa Pure LC-instrumentet. 3. Klik på knappen OK for at starte kørslen. Skærmen Batch Status vises, og en lilla linje, der flytter sig fra venstre mod højre, angiver det faktiske forløb af oprensningen. 4. Skærmen Result vises, når kørslen er fuldført. 5. Gem og udskriv skærmen Result. 6. Vælg eventuelt funktionen Open Post-Elution i menuen Action. Fortsæt ellers til trin B i kapitel 2 (manuel prøveforberedelse) i dette pakningsindlæg. 7. Hvis MagNA Pure-ekstraheringen mislykkes for en enkelt prøve (noteret på skærmen Result), skal den pågældende prøve ekstraheres igen. Hvis post-elueringsfunktionen ikke kan udføres, skal der fortsættes til trin B i kapitel 2 (manuel prøveforberedelse) på dette pakningsindlæg med de prøver, der først blev ekstraheret eller ekstraheret igen. B. POST-ELUERING (valgfrit) Før start På LightCycler 1.2-instrumentet: Indtast de Factor V Leiden-specifikke instrumentindstillinger på skærmen Programming på LightCycler 1.2- instrumentet i overensstemmelse med tabel 2 på sidste side i dette pakningsindlæg. Post-elueringsprocedure (valgfrit) 1. Kontroller, at den prækølede (f.eks. nedkølet fra +2 C til +8 C i mindst 2 timer) MagNA Pure LC-køleblok og LC-prøvekarrusellen er på plads. 2. Indlæs post-elueringsprotokollen med navnet Thrombophilia 15 or 30 samples fra cd'en Thrombophilia Post-Elution Protocols CD (kat. nr ). 4

5 3. Forberedelse af Master Mix (kun til post-elueringsproceduren) Forbered kun den nødvendige mængde umiddelbart før brug. Optø komponenterne i Factor V Leiden-kittet, bland grundigt, og opbevar blandingen på is. Placer ét LightCycler -kapillærrør pr. DNA-prøve og ét for hver kontrol i LightCycler -karrusellen, dvs. hhv. 17 kapillærrør til 15 prøver eller 32 kapillærrør til 30 prøver. Forbered Master Mix: Trin Handling 1 I et 1,5 ml Sarstedt-rør med skruelåg på is tilsættes følgende komponenter i nedenstående rækkefølge (de viste eksempler omfatter 15 eller 30 prøver): Reagenser/arbejdsopløsninger Volumen* / 15 prøver Volumen* / 30 prøver FVL DIL, rør µl 396 µl FVL MD Mix, rør 1 38 µl 72 µl FVL R Mix, rør 2 38 µl 72 µl Volumen i alt 285 µl 540 µl * de angivne mængder omfatter afvigelser i kontroller og pipettering 2 Bland grundigt. Kontroller, at der ikke er fanget luftbobler i spidsen af røret. 3 Placer røret med Master Mix på MagNA Pure LC-køleblokken i position 1. Fjern låget. 4. Placer LightCycler -karrusellen, herunder de kapillærrør, der er angivet i post-elueringsprotokollen i køleblokken, og placer det nødvendige antal pipettespidser som angivet på skærmen for MagNA Pure LC-instrumentet. 5. Åbn FVL CT (rør 3, lilla låg), pipette 25 µl i et nyt 1,5 ml Sarstedt-rør med skruelåg, og placer det derefter på MagNA Pure LC-køleblokken i position 16 som angivet i post-elueringsprotokollen. Bemærk! Centrifuger røret med FVL CT for at samle indholdet i bunden af røret, før det åbnes. Kontroller, at der ikke er fanget luftbobler i spidsen af røret. Skift handsker efter håndtering af kontrolskabelonen. 6. Luk instrumentet, og klik derefter på Start og OK for at starte den automatiske pipettering. Når post-elueringen er udført, vises skærmen Post-Elution Result. 7. Udskriv barkoden på køleblokken i tredobbelt bestemmelse (valgfrit). 8. Gem (Save) og udskriv (Print) resultattabellen Post-Elution, og sæt derefter en køleblok-barkode på udskriften (valgfrit). 9. Skriv navnet på oprensningskørslen på en tom diskette, eller sæt en køleblok-barkode på. Opret en LightCycler SAM-fil (Sample Pattern File) på disketten. 10. Luk hvert kapillærrør med et låg ved hjælp af LC Capping Tool (kat. nr ). 11. Sæt en køleblok-barkode på LightCycler -karrusellen (valgfrit). 12. Placer LightCycler -karrusellen i LC-karruselcentrifugens rotorindsats. 13. Overfør rotorindsatsen, herunder LightCycler -karrusellen, til LC-karruselcentrifugen. Bemærk! Hvis der ikke er mulighed for at bruge en LC-karruselcentrifuge, kan en benchtop-centrifuge benyttes med LightCycler - centrifugeadaptere. Centrifuger ved maks. 735 g i 30 sek. 14. Tryk på Start for at starte kørslen af LC-karruselcentrifugen. 15. Overfør LightCycler -karrusellen til LightCycler 1.2-instrumentet efter centrifugeringen. Bemærk! Det eluerede DNA kan opbevares ved +2 C til +8 C i op til 7 dage og ved -15 C til -25 C ved langtidsopbevaring (ca. 3 uger). Fortsæt til trin B i kapitel 2 (manuel prøveforberedelse) for at konfigurere PCR Master Mix, hvis post-elueringsprotokollen ikke benyttes med MagNAPure LC. 16. Luk MagNA Pure LC-computeren og MagNA Pure LC-instrumentet ned, hvis der ikke skal foretages flere magna Pure-kørsler. C. AMPLIFIKATION OG DETEKTION LightCycler 1.2-instrument 1. Hvis LightCycler -karrusellen blev mærket tidligere (trin B.11), fjernes barkode-mærkaten (valgfrit). 2. Placer karrusellen i LightCycler 1.2-instrumentet. 3. Klik på Open Experiment File. Vælg eksperimentet, der indholder instrumentindstillingerne, fra side 8. Indstil Display Mode (visningstilstand) til detektion af kanal F2. 4. Klik på knappen Edit Samples på skærmen Programming for at åbne skærmen Sample Loading. 5. Klik på Run. 6. Hvis der bruges en tidligere oprettet SAM-fil (trin B.9), indsættes disketten med SAM-filen i LightCycler 1.2-instrumentet (valgfrit). 7. Vælg listen File/Load MagNA Pure LC på menulinjen på skærmen Loading. Vælg filen (SAM-filen) fra MagNA Pure LC, og klik på Open for at indlæse dataene (valgfrit). 8. Indtast negative som prøvetype for karruselposition nr Indtast positive som prøvetype for karruselposition nr Klik på Done for at vende tilbage til skærmen Programming. 11. Klik på Save Experiment File. 12. Klik på Run for at starte kørslen. 13. Udfør analysen Melting Curve, når kørslen er fuldført, for at foretage en genotypebestemmelse af det humane genomiske DNA. ➁ Manuel prøveforberedelsesprocedurer for én prøve ved hjælp af High Pure PCR Template Preparation Kit (kat. nr ) A. OPRENSNING Før start Sæt LightCycler -centrifugeadapterne i køleskab ved +2 C to +8 C (i mindst 2 timer). Forberedelse af arbejdsopløsninger Reagens Rekonstituering/forberedelse af arbejdsopløsning Opbevaring og holdbarhed af arbejdsopløsning Proteinase K Opløs proteinase K i 4,5 ml dobbeltdestilleret vand, afmålt opløsning. Opbevares ved -15 C til -25 C. Holdbar i 12 (rør 3, lyserødt låg) måneder. Inhibitor Removal-buffer Tilsæt 20 ml ethanol til Inhibitor Removal-bufferen. Opbevares ved +15 C til +25 C. Holdbar indtil den (rør 4a, sort låg) Vaskebuffer (rør 4, blåt låg) Bemærk! Flasken skal mærkes og dateres efter tilsætning af ethanol. udløbsdato, der er trykt på kit-mærkaten. Tilsæt 80 ml ethanol til vaskebufferen. Opbevares ved +15 C til +25 C. Holdbar indtil den Bemærk! Flasken skal mærkes og dateres efter tilsætning af ethanol. udløbsdato, der er trykt på kit-mærkaten. 5

6 Oprensningsprocedure Bemærk! Sørg for at følge nedenstående procedure nøjagtigt og ikke den procedure, der er beskrevet på pakningsindlægget til High Pure PCR Template Preparation Kit. 1. Afmål 200 µl elueringsbuffer pr. prøve i sterile 1,5 ml-reaktionsrør, luk rørene, og forvarm dem til +70 C. 2. Til 200 µl resuspenderet EDTA- eller citratantikoaguleret humant perifert fuldblod tilsættes: 200 µl bindingsbuffer (grønt låg) 40 µl proteinase K (rekonstitueret) Bland straks på vortex-mixer, og inkuber ved +70 C i 10 min. 3. Tilsæt 100 µl isopropanol, og bland grundigt på vortex-mixer. 4. Afpipetter prøveblandingen i det øverste reservoir i en kombineret High Pure-filteropsamlingsbeholder. 5. Centrifuger i 1 minut ved 6000 g i en standardbordcentrifuge. 6. Kasser gennemløbet og opsamlingsbeholderen. 7. Sæt filterrøret sammen med en ny opsamlingsbeholder. 8. Tilsæt 500 µl Inhibitor Removal-buffer (sort låg) til det øverste reservoir. 9. Centrifuger i 1 min. ved 6000 g. 10. Kasser gennemløbet og opsamlingsbeholderen. 11. Sæt filterrøret sammen med en ny opsamlingsbeholder. 12. Tilsæt 500 µl vaskebuffer (blåt låg) til det øverste reservoir. 13. Centrifuger i 1 min. ved 6000 g. 14. Kasser gennemløbet og opsamlingsbeholderen. 15. Sæt filterrøret sammen med en ny opsamlingsbeholder. 16. Tilsæt 500 µl vaskebuffer (blåt låg) til det øverste reservoir. 17. Centrifuger i 1 min. ved 6000 g. 18. Kasser gennemløbet. 19. Sæt filterrøret sammen med den samme opsamlingsbeholder. 20. Centrifuger i 10 sek. ved maksimal hastighed ( g eller hurtigere) for at fjerne resterende vaskebuffer. 21. Kasser opsamlingsbeholderen. 22. Indsæt filterrøret i et rent 1,5 ml reaktionsrør. 23. Tilsæt 200 µl forvarmet (+70 C) elueringsbuffer til filterrøret. 24. Centrifuger i 1 min. ved 6000 g. Mikrocentrifugerøret indeholder det eluerede DNA. B. FORBEREDELSE AF MASTER MIX Før start Indtast de Factor V Leiden-specifikke instrumentindstillinger på skærmen Programming på LightCycler 1.2-instrumentet i overensstemmelse med tabellen på sidste side i dette pakningsindlæg. Forberedelse af Master Mix 1. Optø komponenterne i Factor V Leiden-kittet, bland grundigt, og opbevar blandingen på is. 2. Placer ét LightCycler -kapillærrør pr. DNA-prøve og ét for hver af kontrollerne i prækølede LightCycler -centrifugeadaptere. 3. Forbered Master Mix ved at multiplicere mængden i kolonnen Volumen/reaktion med det antal reaktioner, der skal køres (dvs. prøve- DNA, negative og positive kontroller), plus én reaktion mere. Fortsæt som beskrevet nedenfor for en 20 µl-standardreaktion. Trin Handling 1 I et 1,5 ml reaktionsrør på is tilsættes følgende komponenter i nedenstående rækkefølge: Reagenser arbejdsopløsninger Volumen/reaktion FVL DIL, rør 4 11 µl FVL MD Mix, rør 1 2 µl FVL R Mix, rør 2 2 µl Volumen i alt 15 µl 2 Bland grundigt. Afpipetter 15 µl Master Mix i hver af de prækølede LightCycler -kapillærrør. Kontroller identiteten af prøvelisten (kapitel 1, A7, udskrift) med den tilsvarende prøvekassette ved at sammenligne barkodenumrene (valgfrit). Tilsæt 5 µl isoleret prøve-dna eller 5 µl FVL CT (rør 3, lilla låg) som positiv kontrol eller 5 µl FVL DIL, (rør 4, farveløst låg) som negativ kontrol. 3 Luk hvert kapillærrør med et låg ved hjælp af LC Capping Tool (kat. nr ). 4 Fortsæt til trin 5, hvis LC-karruselcentrifugen benyttes. Hvis der benyttes en tilsvarende benchtop-centrifuge (f.eks. Biofuge 13 fra Heraeus Instruments eller Kendro Laboratory Products), placeres hvert kapillærrør i de tilsvarende prækølede LightCycler -centrifugeadaptere, og nedenstående trin udføres: Anbring adapterne i benchtop-centrifugen Centrifuger ved maks. 735 g i 30 sek. Fortsæt med trin 5. 5 Placer kapillærrøret med den negative kontrol i position 1 og kapillærrøret med den positive kontrol i position 2 i LightCycler -karrusellen. 6 Start i position 3, og placer kapillærrørene med prøve-dna'et i LightCycler -karrusellen. 7 Overfør rotorindsatsen, herunder LightCycler -karrusellen, til LC-karruselcentrifugen. 8 Tryk på Start for at starte kørslen af LC-karruselcentrifugen. 9 Overfør LightCycler -karrusellen til LightCycler 1.2-instrumentet efter centrifugeringen. C. AMPLIFIKATION OG DETEKTION LightCycler 1.2-instrument 1. Placer karrusellen i LightCycler 1.2-instrumentet. 2. Klik på Open Experiment File. Vælg eksperimentet, der indholder instrumentindstillingerne, fra side 8. Indstil Display Mode (visningstilstand) til detektion af kanal F2. 3. Klik på knappen Edit Samples for at åbne skærmen Sample Loading. 6

7 4. Klik på Run. 5. Indtast prøvenavn og prøvetype på skærmen Sample Loading i overensstemmelse med det faktiske prøveindsættelsesskema. 6. Vælg kommandoen File/Save As/ på menulinjen på skærmen Loading, og indtast et navn til filen. Prøveoplysningerne gemmes som en separat fil i bruger-/protokolmappen. 7. Klik på Done for at vende tilbage til skærmen Programming. 8. Klik på Save Experiment File. 9. Klik på Run for at starte kørslen. 10. Udfør analysen Melting Curve, når kørslen er fuldført, for at foretage en genotypebestemmelse af det humane genomiske DNA. INSTRUMENTKALIBRERING Kalibrering er ikke nødvendig. KVALITETSKONTROL For at kunne foretage en entydig genotypebestemmelse, er det nødvendigt, at den negative FVL-kontrol (FVL DIL, rør 4, farveløst låg) i position 1 og den positive FVL-kontrol (FVL CT, rør 3, lilla låg) i position 2 i LightCycler -karrusellen analyseres med hvert batch med prøver. Bemærk! Den anbefalede Crossing Point-grænseværdi (cp) er 33. Hvis den er højere, skal genotyperesultaterne rapporteres som equivocal. Crossing Points kan ses efter udførelse af amplifikationen ved at klikke på knappen Quantification på skærmen Data Analysis Front for at gå videre til skærmen Quantification. Negativ kontrol: Smeltekurveanalysen for den negative kontrol skal altid vise et negativt resultat (cp 41). Hvis dette ikke er tilfældet, er kørslen ugyldig, og hele proceduren (prøveforberedelse, amplifikation og detektion) skal gentages. Kontakt den lokale Roche-repræsentant for at få teknisk hjælp, hvis den negative kontrol konstant giver et ikke-negativt resultat. Positiv kontrol: Smeltekurveanalysen for den positive FVL-kontrol (FVL CT, rør 3, lilla låg) skal altid vise to smeltetoppe, den første top med hhv. en lavere T M på 57 C ± 2,5 C og den anden top med en T M på 65 C ± 2,5 C. T mellem disse to smeltetoppe er 8 C ± 1,5 C. Hvis dette ikke er tilfældet, er kørslen ugyldig, og hele proceduren (prøveforberedelse, amplifikation og detektion) skal gentages. Kontakt den lokale Roche-repræsentant for at få teknisk hjælp, hvis den positive kontrol konstant giver et ikke-positivt (ikke-heterozygot) resultat. Prøveresultat: Analyseresultatet for prøve-dna'et skal altid udvise en smeltekurveprofil for den homozygote vildtype, hhv. homozygot mutant eller heterozygot genotype. Denne profil skal være i overensstemmelse med kriterierne for kontrolgodkendelsen ovenfor i afsnittet Positiv kontrol. Hvis dette ikke er tilfældet, er resultatet for denne prøve ugyldigt, og hele proceduren (prøveforberedelse, amplifikation og detektion) skal gentages. Kontakt den lokale Roche-repræsentant for at få teknisk hjælp, hvis prøveresultatet konstant giver et negativt genotype-resultat. BEGRÆNSNINGER OG INTERFERENS FVL MD Mix (rør 1, gult låg) er sekvensspecifik for det humane Factor V-gen. Høje heparinkoncentrationer kan påvirke PCR-reaktionen. Der kendes ikke til anden mulig interferens. Forventede VÆRDIER/FORTOLKNING AF RESULTATER Smeltekurveprogram De resulterende smeltetoppe giver mulighed for at skelne mellem homozygot (vildtype eller mutant) og heterozygot genotype. Figur 1: Smeltekurveanalyse af de tre mulige genotyper af Factor V Leiden-sekvensen. Det første negative derivat af grafen over fluorescens i forhold til temperatur [ d(f2)/dt] viser toppe med forskellig T M. Smeltetoppene indikerer, at den fuldt homologe sekvens (vildtypegenotypen) har en højere T M end den sekvens, der ikke stemmer overens med mutationsproben (mutant-genotypen). Prøver, der indeholder begge sekvenser (heterozygot genotype), viser to toppe ved nøjagtigt de samme temperaturer som de respektive homozygote prøver. Som negativ kontrol blev skabelon-dna'et erstattet med FVL DIL. Fortolkning Den florocinmærkede H-probe danner et perfekt par med vildttypegenotypen. Dette resulterer i en T M, der kan variere ± 2,5 C fra T M i den anden smeltetop for den positive FVL-kontrol (FVL CT, rør 3, lilla låg) ved 65 C. Når det derimod er mutantgenotypen, der er til stede, vil bindingen mellem hybridiseringsproben og DNA'et være mere ustabil. Dette betyder, at T M kan variere ± 2,5 C fra T M i den første smeltetop i den positive FVL-kontrol (FVL CT, rør 3, lilla låg) ved 57 C. Heterozygote genotyper har to smeltetoppe med de relevante T M 'er på hhv. 57 C og 65 C. Skabelon-DNA, der indeholder Antal smeltetoppe T M i smeltetoppe T mellem smeltetoppe Homozygot vildtype-genotype 1 65 C ± 2,5 C Heterozygot genotype 2 65 C ± 2,5 C 8 C ± 1,5 C 57 C ± 2,5 C Homozygot mutantgenotype 1 57 C ± 2,5 C Bemærk! Den samlede præcision blev bestemt i overensstemmelse med NCCLS-anbefalingerne (3) på tre forskellige, eksterne laboratorer ved hjælp af en human heterozygot DNA-forberedelse. Der blev opnået median-smeltetemperaturer på 56,83 C og 64,72 C og en median-cv på 0,23%. SPECIFIKKE PERFORMANCE-DATA Analytisk specificitet En sekvensanalyse påviste at de valgte primere (oligonukleotider) specifikt amplificerer et 222 bp-fragment på Factor V-genet, der indeholder Factor V Leiden-sekvensen. Sekvensanalysen afslørede desuden, at de valgte H-prober under smeltekurveanalysen tydeligt identificerer Factor V Leiden-mutationen på position Smeltekurveanalysen vil dog medføre et ukendt resultat for de kendte, men meget sjældne mutationer på position 1689, 1692 og

8 Analytisk sensitivitet Oprenset humant heterozygot DNA med Factor V Leiden-mutationen, blev fortyndet i fire serielle fortyndingstrin. Hver fortynding blev analyseret i seks kopier, og der blev foretaget en statistisk fortolkning af resultaterne. Der blev beregnet en minimumsdetektionsgrænse på 50 kopier pr. reaktion for Factor V Leiden-kittet. Diagnostisk sensitivitet og specificitet I en prospektiv undersøgelse af nyligt indsamlede og opbevarede humane DNA-prøver, blev 559 prøver fra patienter af kaukasid race med mistanke om trombofili analyseret ved hjælp af Factor V Leiden-kittet, og der blev udført enkelt- eller dobbeltstrenget sekvensanalyse på et MegaBACE 500 Sequencing System ved hjælp af Cimarron Base Caller, softwareversion Begge paneler repræsenterer alle rutinemæssigt indsamlede trombofiliprøver fra patienter på et enkelt universitetshospitalslaboratorium i et angivet tidsinterval. Overensstemmelsen mellem Factor V Leiden Kit og sekvensanalysen var 99,8% (558/559). Detaljerede data vises i tabellen nedenfor. Tabel 1: Factor V Leiden Kit i forhold til sekvensanalysen Sekvensanalyse Factor V Leiden Kit vildtype (wt) heterozygot (het) mutant (mut) wt het mut Bemærk! 40,6% af de humane DNA-prøver blev indsamlet fra patienter med mistanke om venøse tromboemboliske hændelser i overensstemmelse med konsensuserklæringer fra enten ACMG (American College of Medical Genetics) eller CAP (College of American Pathologists) (2,4), 37,9% fra patienter med arterie-trombotiske sygdomme (f.eks. slagtilfælde), 19,1% fra patienter med mistanke om trombofili af andre årsager og 2,3% af ukendte årsager. Genotypen for én prøve kunne ikke bestemmes med Factor V Leiden-kittet. Tabel 2: Instrumentindstillinger 1: Denaturation 2: Amplification 3: Melting Curve Analysis 4: Cooling Cycle Program Data Value Cycles Analysis Mode None Quantification Melting Curves None Temperature Targets Segment Target Temperature ( C) Incubation Time (sec) Temperature Transition Rate ( C/s) Second Target Temperature ( C) Step Size ( C) Step Delay (cycles) Acquisition Mode None None Single None None None Cont. None BEMÆRKNING TIL KØBER Købet af dette produkt giver brugeren ret til at bruge det til amplifikation og detektion af nukleinsyresekvenser i forbindelse med human in vitro-diagnostik. Der gives ingen generelle patent- eller andre licensrettigheder i forbindelse med købet, bortset fra brugsretten. REFERENCER 1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening. JAMA, 277, Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in Medicine, 3, Vol.2, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN X). NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa , USA (1999). 4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia Roche Molecular Systems, Inc. Varemærker og patenter Se Produceret i Tyskland Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, Mannheim, Tyskland For USA: Distribution i USA: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA Teknisk kundesupport i USA: /