72 Tests P/N: CMV Test PG WR

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP 72 Tests P/N: CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 5.1 Liters P/N: Wash Reagent PG WR TILSIGTET BRUG COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test er en in vitro nukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af cytomegalovirus-dna i humant EDTA-plasma ved hjælp af COBAS AmpliPrep-instrumentet til automatisk prøvebehandling og COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til automatisk amplifikation og detektion. Testen kan kvantificere CMV DNA i intervallet kopier/ml. Én kopi af CMV DNA'et (som defineret af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen) svarer til 0,91 internationale enheder (IU) [1,1 cp/iu] baseret på First WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for Nucleic Acid Amplification Techniques (NIBSC 09/162) 40. Denne test er beregnet til anvendelse sammen med det kliniske billede og andre laboratoriemarkører til diagnosticering og behandling af CMV-infektion hos patienter, der er i risiko for CMV-sygdom. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er ikke beregnet til brug som screeningstest for tilstedeværelsen af CMV i blod eller blodprodukter eller som diagnostisk analyse til bekræftelse af CMV-infektion. Resultaterne af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen skal fortolkes på baggrund af alle relevante kliniske og laboratoriemæssige undersøgelser. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Humant cytomegalovirus (HCMV eller CMV) er et humant viralt patogen, der tilhører herpesvirusfamilien, og som findes både i den industrialiserede verden og i isolerede oprindelige befolkningsgrupper. 1,2 Det kan overføres via blod, orofaryngealt sekret, urin, ekskreter fra cervix og vagina, sædvæske, brystmælk, tårer og fæces. 3-9 Primære infektioner med CMV er normalt asymptomatiske hos immunkompetente personer og giver ofte anledning til ikke-detekterede latente infektioner. Mononukleære celler i perifert blod og endotelceller synes at udgøre de vigtigste infektionssteder. CMV forbliver i en latent tilstand i monocytter/makrofager i mennesker. 2 Latent inficerede personer kan fra tid til anden udskille virus i deres kropsvæsker og på den måde inficere andre. Immunkompromitterede personer, herunder for tidligt fødte, transplanterede patienter og AIDSpatienter har høj risiko for at udvikle alvorlige CMV-infektioner, som kan føre til en højere morbiditets- og mortalitetsfrekvens. 10 De kliniske manifestationer for alvorlig CMV-sygdom omfatter CMV-syndrom, retinitis, gastroenteritis, hepatitis, encephalitis, esophagitis, enterocolitis, pancreatitis og lungebetændelse Laboratoriemetoder til diagnosticering af dissemineret infektion og aktiv organsygdom på grund af human cytomegalovirus omfatter isolering af virus ved dyrkning af leukocytter fra perifert blod (PBL), biopsihistologi, serologiske metoder, måling af pp65-antigen og detektion af CMV DNA ved hjælp af PCR (polymerase chain reaction). 14 Analysemetoder, der baser sig på kulturer, har ringe prædiktiv værdi. De kræver en svartid på mellem 48 timer og 3 uger, og er af begrænset værdi især for immunkompromitterede patienter. pp65-antigenæmianalysen er arbejdskrævende og kræver, at blodet analyseres inden for seks timer fra udtagningen på grund af faldet i antigenæmi under opbevaring. 15,22 pp65-analysen er også vanskelig at udføre på alvorligt neutropene patienter. Positive resultater for CMV DNA i plasma ved hjælp af PCR har vist sig at korrelere godt med PBL-kulturpositivitet og med øget risiko for udvikling af systemisk CMV-sygdom. Flere undersøgelser har påvist sammenhængen mellem den virale CMVbelastning og risikoen for at udvikle CMV-sygdom Risikoen for CMV-sygdom er klart defineret af en høj viral belastning, hvilket understreger den vigtige rolle, som den virale titer spiller for sygdommens patogenese. 18,27,30,31 Undersøgelser med transplantationsmodtagere og AIDS-patienter har vist, at PCRdetektion af CMV DNA i høj grad er prædiktivt for sygdommens efterfølgende udvikling og kliniske resultat. 17,23-26 Kvantitative vurderinger af CMV DNA-niveauer har vist, at høje virale belastninger, samt en stigende viral belastning over tid, kan korreleres med dårligere klinisk prognose for flere af CMV-risikotilstandene. 18,27,28 Hertil kommer, at kvantitative PCR-analyser gør det 26,29,30, 32 muligt at overvåge effekten af den antivirale behandling og evaluere virussens modstandskraft indirekte. Brugen af CMV-virusbelastning anbefales i de gældende behandlingsretningslinjer til overvågning af risikoen for udvikling af CMV-sygdom hos organtransplanterede patienter og behovet for forebyggende behandling og til overvågning af patienter med aktiv CMV-sygdom for behandlingsrespons. 21,22 Det anbefales også som en del af de diagnostiske kriterier til identifikation af CMV-sygdom hos modtagere af hæmatopoietiske stamcelletransplantater. 33 Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument DA 1 Doc Rev. 5.0

2 PRINCIPPER FOR PROCEDUREN COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er en nukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af cytomegalovirus (CMV) DNA i humant plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er baseret på to hovedprocesser: (1) prøveforberedelse for at isolere CMV DNA og (2) samtidig PCR-amplifikation af target-dna og detektion af spaltede dobbeltmærkede oligonukleotide detektionsprober, der er specifikke for target. Med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen kan der foretages automatisk prøveforberedelse efterfulgt af automatisk PCR-amplifikation og påvisning af CMV target-dna og CMV kvantificeringsstandard (QS) DNA. Master Mixreagenset indeholder primere og prober, der er specifikke for både CMV DNA og CMV QS DNA. Detektionen af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targetspecifikke og QS-specifikke dobbeltmærkede oligonukleotide prober, der tillader en uafhængig identifikation af CMV-amplikonet og CMV QS-amplikonet. Kvantificeringen af CMV-virus-DNA udføres med CMV QS. Dette kompenserer for virkningen af hæmning og fungerer som kontrol for klargøringen og amplifikationsprocessen for at give mulighed for en mere nøjagtig kvantificering af CMV DNA i hver prøve. CMV QS er en ikke-infektiøs DNA-konstruktion, der indeholder primerbindingsregioner, der er identiske med dem, der findes i CMV-target-DNA og en unik probebindingsregion, der gør det muligt at skelne CMV QS-amplikonet fra CMVtargetamplikonet. CMV QS tilsættes til hver prøve med et kendt kopiantal, hvorefter der udføres prøveforberedelse og samtidig PCR-amplifikation og påvisning af spaltede dobbeltmærkede oligonukleotid detektionsprober. COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet beregner CMV DNA-koncentrationen i patientprøverne ved at sammenligne CMV-signalet med CMV QSsignalet for hver enkelt prøve og kontrol. Valg af target Der anvendes generisk siliciumbaseret prøveklargøring til at opfange CMV DNA'et og CMV QS DNA'et, og definerede oligonukleotider anvendes som primere ved amplifikationen af CMV DNA og CMV QS DNA. En targetspecifik og en QS-specifik dobbeltmærket oligonukleotid probe tillader en uafhængig identifikation af CMV-amplikonet og CMV QS-amplikonet. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen benytter to amplifikationsprimere til PCR. En signalgenererende dobbeltmærket probe hybridiseres til en af de to strenge og spaltes af Z05 DNA-polymerase under forlængelse af primerne. Klargøring af prøver COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen anvender automatisk prøveklargøring på COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjælp af en generisk siliciumbaseret capture-teknik. Proceduren behandler 500 μl plasma. CMV-viruspartiklerne lyseres ved hjælp af inkubation ved en forhøjet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter det frigivne CMV DNA fra DNaser i plasma. Der tilsættes protease og et kendt antal CMV QS DNAmolekyler til hver enkelt prøve sammen med lyseringsreagenset og magnetiske glaspartikler. Derefter inkuberes blandingen, og CMV DNA'et og CMV QS DNA'et bindes til overfladen på de magnetiske glaspartikler. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes ved vask af de magnetiske glaspartikler. Efter separation af de magnetiske glaspartikler og udførelse af vasketrinene elueres de adsorberede nukleinsyrer ved en forhøjet temperatur med en vandig opløsning. Den behandlede prøve, der indeholder det frigjorte CMV DNA og CMV QS DNA, tilsættes til amplifikationsblandingen og overføres til COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. PCR-amplifikation PCR-amplifikationsreaktionen udføres med det termostabile rekombinante enzym Thermus specie Z05 DNA-polymerase (Z05). Under tilstedeværelse af magnesium (Mg 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 DNA-polymerase-aktivitet. 34 Dette gør det muligt at udføre PCR-amplifikation samtidig med real-time påvisning af amplikonet. Behandlede prøver tilsættes til amplifikationsblandingen i amplifikationsrørene (K-tubes), hvor PCR-amplifikationen foregår. Under tilstedeværelsen af Mg 2+ og overskydende deoxynukleotidtrifosfater (dntp'er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytocin, deoxyuridin og deoxyuridintrifosfater, forlænger Z05-polymerase de anealede primere, hvorved der dannes DNAstrenge. Amplifikation af target Thermo cycleren i COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet opvarmer reaktionsblandingen for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og blotlægge de specifikke primertargetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder primerne sig til target-dna'et ved annealing. Under tilstedeværelsen af Mg 2+ og overskydende deoxynukleotidtrifosfater (dntp'er) forlænger Z05 de bundne primere langs targettemplate og producerer dobbeltstrengede DNA-molekyler, kaldet amplikoner. COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammeret i COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på CMV-genomet. Hele CMV-genomet amplificeres ikke DA 2 Doc Rev. 5.0

3 Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af targetnukleinsyre fra prøven opnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen ved hjælp af enzymet AmpErase (uracil-n-glycosylase) og deoxyuridintrifosfat (dutp). Enzymet AmpErase genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 35, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat som et af dntp'erne i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør det kontaminerende amplikon modtagelig for nedbrydning med enzymet AmpErase før amplifikationen af target-dna'et. Desuden vil alle ikkespecifikke produkter, der dannes efter den første aktivering af Master Mix ved hjælp af magnesium, blive ødelagt af enzymet AmpErase. Enzymet AmpErase, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridinholdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus brydes amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA'et ikke amplificeres. Enzymet AmpErase forbliver inaktivt i længere tid, når det udsættes for temperaturer over 55 C, dvs. under thermo cycler-processen, og ødelægger derfor ikke target-amplikonet, der dannes under amplifikation. Påvisning af PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen benytter real-time 36,37 PCR-teknologi. Anvendelsen af dobbeltfluorescerende prober gør det muligt at foretage real-time påvisning af PCR-produktopbygningen ved at overvåge emissionsintensiteten i de fluorescerende rapportfarvestoffer, der frigives under amplifikationen. Proberne består af CMV- og CMV QS-specifikke oligonukleotidprober, der er mærket med et rapportfarvestof og et quencher-farvestof. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen mærkes CMV- og CMV QS-proberne med forskellige fluorescerende rapportfarvestoffer. Når proberne er intakte, undertrykkes rapportfarvestoffets fluorescens på grund af nærheden af quencherfarvestoffet på grund af Förster-energioverførselseffekten. Under PCR-reaktionen hybridiseres proben til en targetsekvens og spaltes af 5' 3'-nukleaseaktiviteten i den termostabile Z05 DNA-polymerase. Når rapport- og quencherfarvestofferne frigives og separeres, stopper quenching-effekten, og rapportfarvestoffets fluorescensaktivitet øges. Amplifikationen af CMV DNA og CMV QS DNA måles uafhængigt ved forskellige bølgelængder. Denne proces gentages et bestemt antal gange, og hver cyklus øger effektivt emissionsintensiteten i det individuelle rapportfarvestof, hvilket giver mulighed for en uafhængig identifikation af CMV DNA'et og CMV QS DNA'et. Den PCR-cyklus, hvor en vækstkurve starter sin eksponentielle vækst, står i forhold til mængden af udgangsmateriale ved begyndelsen af PCR-reaktionen. Grundprincipper for kvantificering i COBAS TaqMan testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen giver kvantitative resultater over et meget bredt dynamisk område, idet monitoreringen af amplikonet foregår under amplifikationens eksponentielle fase. Jo højere CMV-titeren er for en prøve, jo tidligere stiger rapportfarvestoffets fluorescens for CMV-proben til over baseline fluorescensniveauet (se figur 1). Da mængden af CMV QS DNA er konstant i alle prøver, bør rapportstoffets fluorescens for CMV QS-proben optræde i en tilsvarende cyklus for alle prøver (se figur 2). I prøver, hvor QS-fluorescensen påvirkes, justeres koncentrationen tilsvarende. Tilstedeværelsen af de specifikke fluorescerende signaler rapporteres som en kritisk grænseværdi (Ct). Ct-værdien defineres som det delcyklusnummer, hvor fluorescensen i rapportfarvestoffet overstiger en foruddefineret grænse (det tildelte fluorescensniveau), og starter en eksponentiel vækstfase for dette signal (se figur 3). En højere Ct-værdi angiver en lavere titer af det oprindelige CMVtargetmateriale. Generelt korrelerer en fordobling af titerværdien med et fald på 1 Ct for target-cmv DNA'et, mens en 10-dobling af titerværdien korrelerer med et fald på 3,3 Ct. Figur 1 viser eksempler på targetvækstkurver for en fortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Når viruskoncentrationen øges, skifter vækstkurverne til tidligere cyklusser. Vækstkurven helt til venstre svarer derfor til det højeste virale titerniveau, mens kurven helt til højre svarer til det laveste virale titerniveau. Figur 1 Targetvækstkurver for en fortyndingsserie over et 5-log 10 -interval Normaliseret fluorescens Højeste titer Laveste titer Cyklusnummer DA 3 Doc Rev. 5.0

4 Figur 2 viser eksempler på kvantificeringsstandardvækstkurver for prøver fra en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval. Mængden af kvantificeringsstandard, der tilsættes til hver prøve, er konstant for alle reaktioner. Kvantificeringsstandardens Ct-værdi er den samme, uafhængig af den virale titer. Figur 2 Kvantificeringsstandardvækstkurver for en virusfortyndingsserie over et 5-log 10 -interval Normaliseret fluorescens Laveste titer Højeste titer Cyklusnummer Figur 3 viser et eksempel på, hvordan fluorescensværdierne for hver cyklus normaliseres for hver vækstkurve. Delcyklusnummeret (Ct) beregnes for det sted, hvor fluorescenssignalet krydser det tildelte fluorescensniveau. Figur 3 Fluorescensværdierne for hver cyklus normaliseres for hver vækstkurve Normaliseret fluorescens Tildelt fluorescensniveau Ct-værdi = 27,3 Cyklusnummer DA 4 Doc Rev. 5.0

5 CMV DNA-kvantificering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen kvantificerer viralt CMV DNA ved hjælp af en ekstra targetsekvens (CMV-kvantificeringsstandard), der tilsættes til hver patientprøve i en kendt koncentration. CMV QS er en ikke-smitsom DNAkonstruktion, der indeholder fragmenter af CMV-sekvenser med primerbindingsregioner, som er identiske med dem, der findes i CMV-targetsekvensen. CMV QS indeholder CMV-primerbindingsregioner og genererer et amplifikationsprodukt af samme længde og basesammensætning som CMV-target-DNA'et. Detektionsprobebindingsregionen på CMV QS er ændret for at kunne skelne CMV QS-amplikonet fra CMV-targetamplikonet. Under PCR-reaktionens annealingfase på COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet belyses og exciteres prøverne med filtreret lys, og der indsamles filtrerede emissionsfluorescensdata for hver prøve. Aflæsningerne fra hver prøve korrigeres derefter for instrumentudsving. Fluorescensaflæsningerne sendes af instrumentet til AMPLILINK-softwaren og gemmes i en database. Der foretages præ-check for at afgøre, om data for CMV DNA og CMV QS DNA repræsenterer gyldige datasæt, og der genereres markeringer, hvis dataene falder uden for de angivne grænser. Når alle præ-check er udført og godkendt, behandles fluorescensaflæsningerne for at generere Ct-værdier for CMV DNA'et og CMV QS DNA'et. De lotspecifikke kalibreringskonstanter, der følger med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen, bruges til at beregne titerværdien for prøverne og kontrollerne, baseret på Ct-værdierne for CMV DNA'et og CMV QS DNA'et. Titerresultaterne angives i internationale enheder/ml (IU/ml) eller kopier/ml (cp/ml). REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (Reagenskassette med magnetiske glaspartikler) Magnetiske glaspartikler Tris-base-buffer 0,09 % natriumazid 0,1 % methylparaben CMV CS2 (CMV-lyseringsreagenskassette) Natriumcitratdihydrat 42,5 % guanidinthiocyanat 3,6 % polydocanol 1,8 % dithiothreitol Xn 42,5 % (w/w) guanidinthiocyanat CMVCAP 72 test 1 x 72 test 1 x 72 test Sundhedsskadelig R20/21/22-R52/53-R32: Farlig ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse. Skadelig for organismer, der lever i vand; kan forårsage uønskede langtidsvirkninger i vandmiljøet. Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre. S24/25-S36/37/39-S61: Undgå kontakt med huden og øjnene. Brug særligt arbejdstøj, egnede beskyttelseshandsker og -briller/ansigtsskærm. Undgå udledning til miljøet. Se særlig vejledning/leverandørbrugsanvisning DA 5 Doc Rev. 5.0

6 CMV CS3 CMV-multireagenskassette, der indeholder: Pase (proteinaseopløsning) Trisbuffer < 0,05 % EDTA Kalciumklorid Kalciumacetat 7,8 % proteinase Glycerol Xn 7,8 % (w/w) proteinase 1 x 72 test 1 x 3,8 ml Sundhedsskadelig R36-R42: Irriterer øjnene. Kan give overfølsomhed ved indånding. S23-S45: Undgå indånding af dampe. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig; vis etiketten, hvis det er muligt. EB (elueringsbuffer) Tris-base-buffer Natriumhydroxid 0,09 % natriumazid CMV CS4 CMV-testspecifik reagenskassette, der indeholder: CMV QS (CMV-kvantificeringsstandard) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infektiøst plasmid-dna (mikrobielt) indeholdende CMV-primerbindingssekvenser og et unikt probebindingsområde 0,05 % natriumazid CMV MMX (CMV Master Mix) Tricinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroxid < 20 % dimethylsulfoxid Glycerol < 0,05 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01 % upstream- og downstream-cmv-primere < 0,01 % oligonukleotid aptamer < 0,01 % fluorescensmærkede oligonukleotidprober, der er specifikke for CMV og CMV-kvantificeringsstandarden < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobielt) 0,09 % natriumazid MgCl 2 (CAP/CTM-magnesiumopløsning) < 0,6 % magnesiumklorid 0,09 % natriumazid 1 x 8,1 ml 1 x 72 test 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml DA 6 Doc Rev. 5.0

7 CMV H(+)C (CMV høj positiv kontrol) < 0,001 % Lambda-fag, der indeholder CMV DNA Humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test for antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA, HBsAg. CMV DNA kan ikke detekteres med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300, konserveringsmiddel Xi (3:1) blanding af 5-chlor-2-methyl-2H-isothiazol-3-on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 0,65 ml Lokalirriterende S24-S37: Undgå kontakt med huden. Brug egnede beskyttelseshandsker under arbejdet. R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. CMV L(+)C (CMV lav positiv kontrol) < 0,001 % Lambda-fag, der indeholder CMV DNA ved en middelkoncentration, der er cirka 100 gange lavere end middelkoncentrationen af CMV DNA i CMV H(+)C Humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test for antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA, HBsAg. CMV DNA kan ikke detekteres med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300, konserveringsmiddel Xi (3:1) blanding af 5-chlor-2-methyl-2H-isothiazol-3-on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 0,65 ml Lokalirriterende S24-S37: Undgå kontakt med huden. Brug egnede beskyttelseshandsker under arbejdet. R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. CMV ( ) C (CMV negativ kontrol) Humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test for antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2 og HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA, HBsAg. CMV DNA kan ikke detekteres med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300, konserveringsmiddel Xi (3:1) blanding af 5-chlor-2-methyl-2H-isothiazol-3- on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on 6 x 0,65 ml Lokalirriterende S24-S37: Undgå kontakt med huden. Brug egnede beskyttelseshandsker under arbejdet. R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. CMV H(+)C Clip (CMV høj positiv kontrol, stregkodeclip) CMV L(+)C Clip (CMV lav positiv kontrol, stregkodeclip) CMV ( ) C Clip (CMV negativ kontrol, stregkodeclip) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) Natriumcitratdihydrat < 0,1 % N-methylisothiazolon-HCl PG WR 1 x 6 clips 1 x 6 clips 1 x 6 clips 1 x 5,1 l DA 7 Doc Rev. 5.0

8 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er beregnet til brug med humant plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. E. Undgå mikrobiel og nukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra kontrolflaskerne. F. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNase-fri pipettespidser. G. Kontroller fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes. H. Reagenskassetter eller kontroller fra forskellige kit må ikke blandes. I. COBAS AmpliPrep-kassetterne må ikke åbnes, og der må ikke byttes, blandes, fjernes eller indsættes flasker. J. Ubrugte reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. K. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. L. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger (MSDS) hos Roche. M. Prøver og kontroller skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. som beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 og i CLSI-dokumentet M29-A3. 39 Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet opløsning af 0,5 % natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25 %. En 1:10 fortynding af et sådant blegemiddel giver en 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit. N. FORSIGTIG: CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C indeholder humant plasma, der stammer fra humant blod. Kildematerialet er ved test fundet ikke-reaktivt for tilstedeværelsen af hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), antistoffer mod HIV-1/2 og HCV samt HIV p24-antigen eller HIV-1 RNA. Test af negativt humant plasma ved hjælp af PCR-metoder påviste ikke forekomst af CMV DNA. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer humant blod, kan overføre smitstoffer. Alt materiale, der stammer fra mennesker, skal derfor betragtes som potentielt smittefarligt. CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. som beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 og i CLSI-dokumentet M29-A3. 39 Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet opløsning af 0,5 % natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. O. MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 og CMV MMX indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. P. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. Q. Lad ikke CMV CS2 og flydende affald fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, der indeholder guanidinthiocyanat, komme i kontakt med opløsninger med natriumhypoklorit (blegemiddel). Denne blanding kan danne en meget giftig gas. R. Ved bortskaffelse af brugte COBAS AmpliPrep-SPU'er (Specimen Processing Units), der indeholder guanidinthiocyanat, skal enhver kontakt med natriumhypokloritopløsning (blegemiddel) undgås. Denne blanding kan danne en meget giftig gas DA 8 Doc Rev. 5.0

9 KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING A. Reagenser og kontroller må ikke nedfryses. B. Opbevar CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning kan disse reagenser holde sig i 70 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser, op til 100 timer i alt på COBAS AmpliPrep-instrumentet. Reagenser skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. C. Opbevar CMV H(+)C, CMV L(+)C og CMV ( ) C ved 2-8 C. Kontrollerne kan holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning skal ubrugt materiale kasseres. D. Stregkodeclips [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip og CMV ( ) C Clip] ved 2-30 C. E. Opbevar PG WR ved 2-30 C. PG WR kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Dette reagens kan i åbnet tilstand holde sig i 28 dage ved 2-30 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. MEDFØLGENDE MATERIALER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMVCAP CMV CS1 (CMV-reagenskassette med magnetiske glaspartikler) CMV CS2 (CMV-lyseringsreagenskassette) CMV CS3 (CMV-mulitreagenskassette) CMV CS4 (CMV-testspecifik reagenskassette) CMV H(+)C (CMV høj positiv kontrol) CMV L(+)C (CMV lav positiv kontrol) CMV ( ) C (CMV negativ kontrol) CMV H(+)C Clip (CMV høj positiv kontrol, stregkodeclip) CMV L(+)C Clip (CMV lav positiv kontrol, stregkodeclip) CMV ( ) C Clip (CMV negativ kontrol, stregkodeclip) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) DA 9 Doc Rev. 5.0

10 NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Instrumenter og software COBAS AmpliPrep-instrument COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrument Valgfrit: Dockingstation Valgfrit: cobas p 630-instrument AMPLILINK Software, Version 3.3 Series Datastation til AMPLILINK-softwaren, med printer. AMPLILINK Software v3.3 Series-manualer: Instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet til brug sammen med COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet eller cobas p 630-instrumentet og AMPLILINK-softwaren, version 3.2 og 3.3 Series Instrumentmanualen til COBAS TaqMan -analyseinstrumentet (plus valgfri dockingstation) til brug sammen med applikationsmanualen til AMPLILINK-softwaren, version 3.2 og 3.3 Series Instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til brug sammen med applikationsmanualen til AMPLILINK-softwaren, version 3.2 og 3.3 Series Applikationsmanualen til AMPLILINK-software version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og cobas p 630-instrumentet. Valgfrit: Brugerhåndbogen til cobas p 630-instrumentet, Software Version 2.2 Forbrugsartikler Prøvebehandlingsenheder: SPU'er S-tubes (Sample input tubes) med stregkodeclips Racks med K-tips Racks med K-tubes ANDRE NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Prøverack (SK 24-rack) Reagensrack SPU-rack K-carrier K-carrier-transportør K-carrier-rack (kun nødvendigt til brug med COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet) Der skal anvendes pipetter med aerosolbarriere eller DNase-fri positive displaceringsspidser (kapacitet 1000 μl)* Engangsbeskyttelseshandsker, uden talkum Vortex-mixer * Pipetter må højst afvige 3 % fra den angivne mængde. Der skal anvendes aerosolbarriere eller DNase-fri positive displaceringsspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner DA 10 Doc Rev. 5.0

11 INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Alle prøver og kontroller skal håndteres som potentielt smittefarlige. Bemærk! Denne test er kun valideret til brug med humant plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. Test af andre prøvetyper kan medføre unøjagtige resultater. A. Indsamling af prøver COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen er beregnet til brug med plasmaprøver. Blod skal indsamles i sterile rør med EDTA (lavendelblå top) som antikoagulerende middel og blandes tilstrækkeligt i henhold til instruktionerne fra rørproducenten. B. Transport af prøver Fuldblod skal opbevares ved 2-25 C i højst 6 timer. Plasma skal separeres fra fuldblod inden for 6 timer efter indsamling ved centrifugering ved x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Plasmaet overføres til et sterilt polypropylenrør. Transport af fuldblod eller plasma skal foregå i overensstemmelse med de nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer. 41 Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og skal centrifugeres inden for 6 timer efter indsamling. Plasma kan transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C. C. Opbevaring af prøver Plasmaprøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 7 dage. Plasmaprøver har vist sig at være stabile i 6 uger, hvis de nedfryses ved -20 C. Det anbefales at opbevare prøverne i mængder på μl i sterile 2,0 ml polypropylenrør med skruelåg (f.eks. Sarstedt ). Figur 4 viser data for prøvernes holdbarhed fra undersøgelser af prøveopbevaring udført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. Figur 4 Holdbarhed af CMV i EDTA-plasma 3,50 Log10-titer (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Prøve 2-8 ºC 0 d 2-8 ºC 3 d 2-8 ºC 7 d -20ºC 6 u Plasmaprøverne kan nedfryses og optøs op til 3 gange uden signifikant tab af CMV DNA. Figur 5 viser data for undersøgelser af nedfrysning/optøning af prøver udført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen DA 11 Doc Rev. 5.0

12 Figur 5 CMV-resultater efter op til 3 nedfrysninger/optøninger (EDTA-plasma) 3,50 Log10-titer (cp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Prøve 0 x frysning/optøning 1 x frysning/optøning 2 x frysning/optøning 3x frysning/optøning BRUGSANVISNING Bemærk! For en detaljeret brugsanvisning, en detaljeret beskrivelse af de mulige konfigurationer, udskrivning af resultater samt fortolkning af markeringer ("flag") og fejlmeddelelser henvises der til (1) Instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet til brug sammen med COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet eller cobas p 630-instrumentet, og AMPLILINK-softwaren, version 3.3 series; (2) Instrumentmanualen til COBAS TaqMan -analyseinstrumentet (plus valgfri dockingstation) til brug sammen med applikationsmanualen til AMPLILINK-softwaren, version 3.2 og 3.3 Series; (3) Instrumentmanualen til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til brug sammen med applikationsmanualen til AMPLILINK-softwaren, version 3.2 og 3.3 Series; (4) Applikationsmanualen til AMPLILINK-software version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet og COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og cobas p 630-instrumentet; (5) Valgfrit: brugerhåndbogen til cobas p 630-instrumentet, Software Version 2.2. Batchstørrelse Hvert kit indeholder nok reagenser til 72 test, der kan udføres i batches på fra 12 til 24 test. Der skal inkluderes mindst én bestemmelse af hver af CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C i hver batch (se afsnittet "Kvalitetskontrol"). Arbejdsgang Kørslen på COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet skal startes inden 120 minutter efter endt automatiseret prøve- og kontroloprensning. Bemærk! Behandlede prøver og kontroller må ikke nedfryses eller opbevares ved 2-8 C. Prøve- og kontrolklargøring Bemærk! Hvis der benyttes frosne prøver, skal prøverne placeres ved stuetemperatur, indtil de er fuldstændig optøede, og vortex-mixes i 3-5 sekunder før brug. Hvis kontrollerne opbevares ved 2-8 C, skal de tages ud og tempereres til den omgivende temperatur før brug DA 12 Doc Rev. 5.0

13 Opsætning af COBAS AmpliPrep-instrumentet Del A. Vedligeholdelse og priming A1. COBAS AmpliPrep-instrumentet er klar til brug i standby-tilstand. A2. Tænd for datastationen til AMPLILINK-softwaren (ON). Klargør datastationen på følgende måde: a. Log på Windows XP operativsystemet. b. Dobbeltklik på ikonet for AMPLILINK-softwaren. c. Log på AMPLILINK-softwaren ved at indtaste bruger-id og adgangskode. A3. Kontroller beholdningen af PG WR på skærmbilledet Status, og fyld op, hvis det er nødvendigt. A4. Udfør de vedligeholdelsesprocedurer, der er angivet på fanen Due. COBAS AmpliPrep-instrumentet primer automatisk systemet. Del B. Indsættelse af reagenskassetter Bemærk! Alle reagenskassetter skal fjernes fra opbevaringen ved 2-8 C og omgående indsættes i COBAS AmpliPrep-instrumentet, hvor de skal henstå i mindst 30 minutter for at blive tempereret til den omgivende temperatur, før den første prøve skal behandles. Reagenserne må ikke tempereres til den omgivende temperatur uden for instrumentet, da der kan dannes kondens på stregkodeetiketterne. Hvis der dannes kondens på stregkodeetiketterne, må disse ikke tørres af. B1. Placer CMV CS1 på et reagensrack. Placer CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4 på et separat reagensrack. B2. Indsæt det reagensrack, der indeholder CMV CS1, i rackposition A på COBAS AmpliPrep-instrumentet. B3. Indsæt det reagensrack, der indeholder CMV CS2, CMV CS3 og CMV CS4, i rackposition B, C, D eller E på COBAS AmpliPrep-instrumentet. Se tabel 1 for yderligere oplysninger. Del C. Indsættelse af forbrugsartikler Bemærk! Bestem det antal COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, SPU'er (Sample Processing Units), input-s-tubes (S-tubes), K-tips og K-tubes, der skal bruges. Der skal bruges én SPU, én input-s-tube, én K-tip og én K-tube til hver prøve eller kontrol. Det er muligt at anvende flere forskellige arbejdsgange med COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Der henvises til tabel 1 for yderligere oplysninger. Afhængigt af den valgte arbejdsgang indsættes det relevante antal reagenskassetteracks, prøveracks med input S-tubes, SPU-racks, K-tip-racks, K-tuberacks og K-carriers på K-carrier-racks i de respektive rackpositioner på COBAS AmpliPrep-instrumentet (se tabel 1 for yderligere oplysninger). C1. Placer SPU'erne i SPU-racket/-rackene, og indsæt racket/rackene i rackpositionerne J, K eller L på COBAS AmpliPrepinstrumentet. C2. Afhængigt af den valgte arbejdsgang indsættes de(t) fulde K-tube-rack(s) på rackposition M, N, O eller P på COBAS AmpliPrep-instrumentet. C3. Indsæt fulde K-tip-racks på rackposition M, N, O eller P på COBAS AmpliPrep-instrumentet. C4. I forbindelse med arbejdsgang 3 med COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet indsættes K-carriers på K-carrier-rack(s) på rackposition M, N, O eller P på COBAS AmpliPrep-instrumentet DA 13 Doc Rev. 5.0

14 Tabel 1 Mulige arbejdsgange ved brug af COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet Arbejdsgang Overførselstilstand til COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrument Racks, carriers og forbrugsartikler Position på COBAS AmpliPrepinstrumentet K-tubes i fulde K-tube-racks M P COBAS AmpliPrepinstrument, K-tips i fulde K-tip-racks M P 1 plus dockingstation og COBAS TaqMan analyseinstrument Automatisk overførsel af K-carrier Indsæt S-tubes med prøver og kontroller i prøveracks SPU'er i SPU-racks CS1 i kassetterack F H J L A CS2, CS3, CS4 i kassetterack B E K-tubes i fulde K-tube-racks M P K-tips i fulde K-tip-racks M P 2 COBAS AmpliPrepinstrument, plus COBAS TaqMan analyseinstrument Manuel overførsel af K-tubes via prøverack(s) på COBAS TaqMan analyseinstrumentet Indsæt S-tubes med prøver og kontroller i prøveracks SPU'er i SPU-racks CS1 i kassetterack CS2, CS3, CS4 i kassetterack F H J L A B E Efter udførelse af prøvebehandling: K-tubes på prøveracks (klar til manuel overførsel) Samme som ovenfor (F H) K-tubes på prøveracks F H K-tips i fulde K-tip-racks M P Indsæt S-tubes med prøver og kontroller i prøveracks F H 3 COBAS AmpliPrepinstrument, plus COBAS TaqMan 48- analyseinstrument(er) Manuel overførsel af K-carrier via K-carrier-rack(s) til COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet SPU'er i SPU-racks CS1 i kassetterack CS2, CS3, CS4 i kassetterack Tom stregkodet K-carrier på K-carrier-rack J L A B E M P Efter udførelse af prøvebehandling: K-tubes i K-carrier på K-carrier-racks Samme som ovenfor (M P) DA 14 Doc Rev. 5.0

15 Del D. Bestilling og indlæsning af prøver Bemærk! Se brugerhåndbogen til cobas p 630-instrumentet ved brug af cobas p 630-instrumentet til prøveforberedelse. D1. Klargør prøveracks som følger: Sæt en clip med stregkodemærkat på alle de prøverackpositioner, hvor der skal placeres et prøverør (S-tube). Sæt en af de clips med stregkodemærkat, der er specifikke for kontrollerne [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C], på hver prøverackposition, hvor der skal placeres en kontrol (S-tubes). Clipsene med stregkodemærkater til kontrollerne skal have det samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrolflaskerne i kittet. Sørg for at tilknytte den rigtige kontrol til positionen med den tilhørende kontrolstregkodeclip. Placer en input-s-tube på hver position, der indeholder en clip med stregkodemærkat. D2. Opret ved hjælp af AMPLILINK-softwaren prøveordrer for hver prøve og kontrol i mappen Sample i vinduet Orders. Vælg den relevante testfil, og afslut ved at gemme. D3. Tilknyt prøve- og kontrolordrer til prøverackpositioner i mappen Sample Rack i vinduet Orders. Prøveracknummeret skal være til det rack, der blev klargjort i trin D1. D4. Udskriv rapporten Sample Rack Order, og brug den som arbejdsark. D5. Klargør prøve- og kontrolracks i det angivne område for tilføjelse af prøver og kontroller på følgende måde: Bland hver prøve og kontrol på vortex-mixer [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] i 3 til 5 sekunder. Undgå at kontaminere handskerne ved håndtering af prøver og kontroller. D6. Overfør 500 μl af hver prøve og kontrol [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C] til den relevante stregkodemærkede input-s-tube ved hjælp af en mikropipette med aerosolbarriere eller DNase-fri positiv displaceringsspids. Undgå at overføre partikler og/eller fibrinclots fra den oprindelige prøve til input-s-røret. Prøver og kontroller skal overføres til de rørpositioner, der er tildelt og registreret på arbejdsarket under trin D4. Clipsene med stregkodemærkater til kontrollerne skal have det samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrolflaskerne i kittet. Sørg for at tilknytte den rigtige kontrol til positionen med den relevante kontrolstregkodeclip. Undgå at kontaminere den øverste del af S-tubes med prøver eller kontroller. D7. I forbindelse med arbejdsgang 1 og 2 indsættes prøverack(s) fyldt med input S-tubes på rackpositionerne F, G eller H på COBAS AmpliPrep-instrumentet. D8. I forbindelse med arbejdsgang 3, og under anvendelse af COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, indsættes prøverack(s) med input S-tubes og K-tubes (én for hver input S-tube, indsat i den højre position ved siden af input-s-tubes) på rackpositionerne F, G eller H på COBAS AmpliPrep-instrumentet. Del E. Start af kørslen på COBAS AmpliPrep-instrumentet E1. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjælp af AMPLILINK-softwaren. Del F. Afslutning af kørslen på COBAS AmpliPrep-instrumentet og overførsel til COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet (kun til arbejdsgangene 2 og 3) F1. Kontroller for markeringer eller fejlmeddelelser. F2. Fjern de behandlede prøver og kontroller fra COBAS AmpliPrep-instrumentet i prøverackene (for COBAS TaqMan analyseinstrumentet uden dockingstation) eller K-carrier-rackene (for COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet), afhængigt af den valgte arbejdsgang (der henvises til del G for yderligere oplysninger). F3. Fjern affald fra COBAS AmpliPrep-instrumentet. Bemærk! De behandlede prøver og kontroller må ikke udsættes for lys efter fuldførelsen af prøve- og kontrolklargøringen. Amplifikation og detektion Opsætning af COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet Kørslen på COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet skal startes inden 120 minutter efter færdiggørelsen af prøve- og kontrolklargøringen. Bemærk! Behandlede prøver og kontroller må ikke nedfryses eller opbevares ved 2-8 C DA 15 Doc Rev. 5.0

16 Del G. Indsættelse af behandlede prøver G1. Udfør de relevante trin for at overføre K-tubes til COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, alt efter den valgte arbejdsgang. Arbejdsgang 1: Automatisk overførsel af K-carrier via dockingstationen til COBAS TaqMan analyseinstrumentet. Dette kræver ikke indgreb fra brugeren. Arbejdsgang 2: Manuel overførsel af K-tubes i prøverack(s) til COBAS TaqMan analyseinstrumentet. Arbejdsgang 3: Manuel overførsel af K-carrier på K-carrier-rack(s) til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Manuel overførsel af K-carriers til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet ved hjælp af K-carrier-transporteren. Del H. Start af kørsel på COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet H1. Start COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet med en af nedenstående indstillinger, alt efter den valgte arbejdsgang: Arbejdsgang 1: Arbejdsgang 2: Arbejdsgang 3: Kræver ikke indgreb fra brugeren. Automatisk start af COBAS TaqMan analyseinstrumentet efter indsættelse af prøverack(s). Fyld K-carrieren med tomme K-tubes, hvis den indeholder færre end 6 K-tubes. Vejledning til opfyldningen vises af AMPLILINK-softwaren. Åbn dækslet til thermo cycleren, indsæt K-carrieren, og luk låget. Start kørslen på COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Del I. Afslutning af kørslen på COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet I1. Udskriv resultatrapporten, når kørslen på COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet er fuldført. Kontroller, om der er markeringer eller fejlmeddelelser i resultatrapporten. Prøver med markeringer og kommentarer skal fortolkes som beskrevet i afsnittet "Resultater". Gem dataene, når resultaterne er godkendt. I2. Fjern de brugte K-tubes fra COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. RESULTATER COBAS TaqMan - eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet bestemmer automatisk CMV DNA-koncentrationen for prøverne og kontrollerne. CMV DNA-koncentrationen udtrykkes som kopier (cp)/ml. Omregningsfaktoren mellem CMV DNA kopier/ml (som defineret af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen) og internationale enheder (IU)/ml er 1,1 cp/iu [0,91 IU/cp], når man bruger First WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for Nucleic Acid Amplification Techniques (NIBSC 09/162) 40. Denne omregningsfaktor mellem "kopi" og "IU" kan være anderledes for andre CMV-DNA-analyser. AMPLILINK-software: Bestemmer cyklusgrænseværdien (Ct) for CMV DNA'et og CMV QS DNA'et. Bestemmer CMV DNA-koncentrationen på baggrund af Ct-værdierne for CMV DNA'et og CMV QS DNA'et og de lotspecifikke kalibreringskoefficienter, der er angivet på kassettestregkoderne. Angiver, at de beregnede cp/ml CMV L(+)C og CMV H(+)C ligger inden for de fastlagte intervaller. Validering af batch AMPLILINK version 3.3 Series Kontroller resultatvinduet i AMPLILINK-softwaren eller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at batchen er gyldig. For kontrolordrer foretages en kontrol for at bestemme, om cp/ml-værdien for kontrollen er inden for det fastlagte interval. Hvis cp/ml-værdien for kontrollen er uden for intervallet, genereres der en markering ("flag") for at angive, at kontrollen ikke lykkedes. Batchen er gyldig, hvis der ikke vises markeringer for nogen af kontrollerne [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C]. Batchen er ikke gyldig, hvis der vises nogen af følgende markeringer for CMV-kontrollerne: DA 16 Doc Rev. 5.0

17 Negativ kontrol Markering ("flag") Resultat Fortolkning NC_INVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller et "gyldigt" resultat, der ikke er negativt for CMV-target CMV lav positiv kontrol Markering ("flag") Resultat Fortolkning LPCINVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller en kontrol uden for intervallet CMV høj positiv kontrol Markering ("flag") Resultat Fortolkning HPCINVALID Invalid Et ugyldigt resultat eller en kontrol uden for intervallet Hvis batchen er ugyldig, skal hele batchen gentages, herunder prøve- og kontrolklargøring, amplifikation og detektion. Fortolkning af resultater Hvis batchen er gyldig, skal det for hver enkelt prøve kontrolleres, om der er markeringer eller kommentarer på udskriften. Resultaterne skal fortolkes på følgende måde: En gyldig batch kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater afhængigt af, om der er genereret markeringer og/eller kommentarer for de individuelle prøver. Prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: Kopier/ml Internationale enheder/ml Titerresultat Target Not Detected <1.50E+02 cp/ml 1.50E+02 cp/ml og 1.00E+07 cp/ml >1.00E+07 cp/ml <1.37E+02 IU/mL 1.37E+02 IU/mL og 9.10E+06 IU/mL >9,10E+06 IU/ml Fortolkning Resultaterne skal rapporteres som "CMV DNA ikke påvist". De beregnede kopier/ml er under den lave kvantificeringsgrænse for analysen. Resultaterne skal rapporteres som "CMV DNA påvist, mindre end 150 CMV DNA cp/ml". Beregnede resultater, der er større end eller lig med 150 CMV DNA cp/ml og mindre end eller lig med 1,00E+07 CMV DNAcp/ml, er inden for det lineære interval for analysen. De beregnede kopier/ml er over analyseintervallet. Resultaterne skal rapporteres som "større end 1,00E+07 CMV DNA cp/ml". Hvis der ønskes kvantitative resultater, skal den oprindelige prøve fortyndes med CMV-negativt humant EDTA-plasma og analysen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. De beregnede IU/ml er under den lave kvantificeringsgrænse for analysen. Resultaterne skal rapporteres som "CMV DNA påvist, mindre end 137 CMV DNA IU/ml". Beregnede resultater, der er større end eller lig med 137 CMV DNA IU/ml og mindre end eller lig med 9,10E+06 CMV DNAIU/ml, er inden for det lineære interval for analysen. De beregnede IU/ml er over analyseintervallet. Resultaterne skal rapporteres som "større end 9,10E+06 CMV DNA IU/ml". Hvis der ønskes kvantitative resultater, skal den oprindelige prøve fortyndes med CMV-negativt humant EDTA-plasma, og analysen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. Bemærk! Prøver, som er over analyseintervallet, og som giver et ugyldigt resultat med markeringen QS_INVALID, må ikke rapporteres som 9,10E+06 IU/ml eller > 1,00E+07 cp/ml. Den oprindelige prøve skal fortyndes med CMV-negativt humant EDTA-plasma, og testen gentages. Multiplicér det rapporterede resultat med fortyndingsfaktoren. Bemærk! Titerresultat "Failed". Fortolkning: Prøven blev ikke korrekt behandlet. Bemærk! Titerresultat "Invalid". Fortolkning: Et ugyldigt resultat DA 17 Doc Rev. 5.0

18 KVALITETSKONTROL Der skal inkluderes én bestemmelse af hver af kontrollerne COBAS TaqMan Negative Control, CMV Low Positive Control og CMV High Positive Control i hver testbatch. Batchen er gyldig, hvis der ikke vises markeringer for nogen af kontrollerne [CMV ( ) C, CMV L(+)C og CMV H(+)C]. Kontroller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at batchen er gyldig. Negativ kontrol CMV ( ) C skal give resultatet "Target Not Detected". Hvis CMV ( ) C markeres som ugyldig, er hele batchen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolklargøring, amplifikation og detektion). Hvis CMV ( ) C konstant er ugyldig i flere batches, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. Positive kontroller De acceptable titerintervaller for CMV L(+)C og CMV H(+)C er angivet på stregkoderne på reagenskassetterne til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen. CMV DNA cp/ml-værdierne for CMV L(+)C og CMV H(+)C skal ligge inden for de acceptable titerintervaller. Hvis én eller flere af de positive kontroller markeres som ugyldig, er hele batchen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolklargøring, amplifikation og detektion). Hvis CMV DNA-titeren for én af eller begge de positive kontroller konstant er uden for de acceptable intervaller i flere batches, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik, for at analysen skal kunne fungere korrekt. PROCEDUREBEGRÆNSNINGER 1. Denne test er kun valideret til brug med humant plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. Test af andre prøvetyper kan medføre unøjagtige resultater. 2. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvetagning, transport, opbevaring og behandling. 3. Tilstedeværelsen af enzymet AmpErase i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens Master Mix reducerer risikoen for amplikon-kontaminering. Kontaminering fra CMV-positive kontroller og kliniske prøver kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i denne indlægsseddel. 4. Dette produkt må kun anvendes af personer, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. 5. Dette produkt må kun anvendes med COBAS AmpliPrep-instrumentet og COBAS TaqMan eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet. 6. Selvom de er sjældne, kan mutationer i de bedst konserverede regioner i virusgenomet, som er dækket af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testprimere og/eller -prober medføre underkvantificering eller manglende detektion af virus. 7. Påvisningen af CMV DNA er afhængig af det antal viruspartikler, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøvetagningsmetoder og patientfaktorer (f.eks. alder, forekomst af symptomer og/eller infektionsstadiet). 8. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at kvantificere teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden. 9. Grænserne for klinisk beslutning for virale indlæsningsværdier i internationale enheder/ml (IU/ml) er ikke blevet fastsat. Læger rådes til at bruge den korrekte omregningsfaktor fra IU/ml til kopier/ml (cp/ml), når de foretager kliniske beslutning ved hjælp af resultater, der er rapporteret i IU/ml DA 18 Doc Rev. 5.0

19 INTERFERERENDE STOFFER Det er påvist, at høje koncentrationer af triglycerider (op til 3300 mg/dl), konjugeret bilirubin (op til 20 mg/dl), ukonjugeret bilirubin (op til 20 mg/dl), hæmoglobin (op til 200 mg/dl) og humant DNA (op til 0,4 mg/dl) i prøver samt tilstedeværelsen af autoimmune sygdomme eller respektive markører som f.eks. systemisk lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA) og antinukleært antistof (ANA) ikke interfererer med kvantificeringen af CMV DNA eller påvirker COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens specificitet. Evalueringen blev udført i overensstemmelse med CLSI-retningslinjen EP7-A2 41 med ét lot af COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testreagenser. Der er påvist, at følgende lægemiddelstoffer, når de blev testet ved 3 gange topplasmakoncentrationen (Cmax), ikke interfererer med kvantificeringen af CMV DNA eller påvirker COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testens specificitet: Immunosuppressiva Azathioprin Cyclosporin Mycophenolat mofetil Mycophenolat natrium Sirolimus Tacrolimus Everolimus Prednison Anti-CMV Ganciclovir Valganciclovir Cidofovir Foscarnet Antibiotika Sulfamethoxazol Trimethoprim Cefotetan Piperacillin Tazobactam natrium Kaliumclavulanat Dinatrium-ticarcillin Vancomycin Antisvampemiddel Fluconazol DA 19 Doc Rev. 5.0

20 EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE A. Sporbarhed til First WHO International Standard for Human Cytomegalovirus Der er anvendt flere standarder og kontroller under udviklingen af denne test for at opnå sporbarhed til WHO-standarden [First WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for Nucleic Acid Amplification Techniques (NIBSC 09/162)]. 40 De standarder, der er anvendt under udviklingen af denne test, omfatter CMV WHO-standarden, RMS CMV Secondary Standard, RMS CMV Secondary Standard-kildematerialet og RMS CMV-kalibreringspanelet (Lambda CMA1.2). Standarderne, kalibreringspanelet og en uafhængig CMV klinisk prøve blev testet ved ensartede nievauer. Det koncentrationsinterval, der blev testet for CMV WHOstandarden, var fra 5,00E+02 IU/ml til 5,00E+05 IU/ml (2,70 5,70 log 10 IU/ml), RMS CMV Secondary Standard-kildematerialet blev testet fra 5,00E+02 IU/ml til 1,00E+07 IU/ml (2,70 7,00 log 10 IU/ml), RMS CMV-kalibreringspanelet blev testet fra 5,23E+02 til 9,30E+06 IU/ml (2,72 6,97 log 10 IU/ml), og den uafhængige CMV kliniske prøve blev testet fra 5,00E+02 IU/ml til IU/ml (2,70 4,36 log 10 IU/ml). Alle materialer opførte sig på samme måde og demonstrerede kolineær fortyndingsperformance i hele det lineære interval for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen (CAP/CTM CMV) (figur 6). Figur 6 Sporbarhed for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV-testen til First WHO International Standard for Human Cytomegalovirus Gennemsnitlig target Ct-værdi Log 10 WHO-standardbaseret koncentration (IU/ml) WHO-standard: y = -3,9472x + 45,64; R 2 = 0,9971 Klinisk prøve: y = -3,8549x + 45,386; R 2 = 0,9979 CMV SS-kilde: y = -3,9358x + 45,514; R 2 = 0,9987 CAP/CTM CMV-kalibreringspanel: y = -3,8574x + 45,383; R 2 = 0,9955 CMV WHO-standard Klinisk prøveantal N SS-kildemateriale AD169 CAP/CTM CMV-kalibreringspanel CMV SS, ufortyndet DA 20 Doc Rev. 5.0