May the force be with you

Transkript

1 May the force be with you Esben Thormann, Department of Chemistry, Surface Chemistry, Royal Institute of Technology, Stockholm. Adam C. Simonsen og Ole G. Mouritsen, MEMPHYS-Center for Biomembran fysik, Institut for Fysik og, Syddansk Universitet, Odense Den nyeste instrumentelle udvikling har gjort det muligt direkte at måle de fysiske kræfter, som virker mellem ganske små partikler (kolloider) samt mellem enkelte makromolekyler. Hermed er der åbnet et nyt vindue til en forståelse af de forhold, som bestemmer stabiliteten af alt fra biologiske systemer til komplekse væsker og overflader. Det er i dette kolloide domæne, hvor fysik, kemi, biologi og teknologi møder hinanden. Mange kemiske og tekniske processer er baseret på kolloide systemer og på, at man kan kontrollere og ændre på kræfterne mellem kolloiderne for eksempel ved at ændre på det medium, som de er opløst i. Processer som flokkulation, papirfremstilling og produktion af emulsioner i fødevareindustrien bygger alle på, at man forandrer kræfterne på en sådan måde, at systemet får de ønskede egenskaber. Helt afgørende for at kunne kontrollere dette er dog, at man har kendskab til de forskellige typer af vekselvirkninger og forstår, hvordan de reguleres. I denne artikel vil vi beskrive en eksperimentel metode til at måle sådanne vekselvirkninger og give nogle eksempler herpå. Eksemplerne viser også, hvor flydende grænserne er blevet mellem moderne fysik, kemi, biologi og teknologi. Kolloide opløsninger Kolloider er en betegnelse for partikler i den kolloide størrelsesorden, som strækker sig fra en nanometer og op til nogle få mikrometer. En kolloid opløsning er således en opløsning af kolloider, der kan være alt fra enkeltvise makromolekyler, aggregater af mindre molekyler, krystallinske eller amorfe nanopartikler eller større partikler. Ofte vil en kolloid opløsning dog bestå af en blanding én eller flere af de nævnte bestanddele. På grund af de kolloide partiklers små størrelser kan de Brownske bevægelser holde partiklerne i opløsning, så de ikke bundfælder. Kolloide opløsninger kan således dække et utal af forskellige systemer, som strækker sig fra biologien over kemien og videre til fysik og ingeniørvidenskaber. Ikke desto mindre har sådanne systemer som tilsyneladende kun har størrelsen tilfælles fået deres egen gren indenfor videnskaben: kolloid videnskab. Det, som især binder feltet sammen, er forståelsen af de kræfter, som virker mellem kolloiderne. Hvad enten vi bevæger os inden for cellebiologi eller kigger på kommercielle produkter som maling, printerblæk, cremer, shampoo mm. afhænger stabiliteten af disse systemer af, at der er en balance mellem de frastødende og tiltrækkende vekselvirkninger. Kraftmålinger atomar kraftmikroskopi Det atomare kraftmikroskop (AFM) er et instrument, der oprindeligt blev udviklet som et redskab til at afbilde overfladers topografi på en atomar eller molekylær skala. En μm lang og μm bred, blød og fleksibel bladfjeder, udstyret med en skarp spids for enden, er den helt centrale del af instrumentet. Vekselvirkninger mellem den skarpe spids og en given prøve vil føre til en afbøjning af bladfjederen. Selv meget små afbøjninger kan måles ved hjælp af et optisk vægtstangsprincip, hvor en laserstråle, som fokuseres på bagsiden af bladfjederen, reflekteres ind i en fotodetektor (se figur 1). Relative bevægelser mellem bladfjederen og prøven bliver desuden styret med en præcision ned til 0,1 nm af piezoelektriske elementer og af feedbackelektronik. Princippet i den topografiske billeddannelse består i at skanne prøven i (x,y)-planen, mens man opretholder en konstant afbøjning af bladfjederen ved at bevæge den i z-retningen. Hvis det antages, at en konstant afbøjning af bladfjederen svarer til en konstant kraft og dermed en konstant afstand mellem spidsen og prøven, vil en afbildning af z- positionen som funktion af (x,y)-positionen frembringe det topografiske billede. Udover at fungere som et væktøj til at danne topografiske billeder kan AFM instrumentet også 42 LMFK-bladet, nr. 2, marts 2008

2 Figur 1: Til venstre er vist princippet i det atomare kraftmikroskop. En skarp spids monteret på en følsom bladfjeder skannes hen over en overflade, og udfra dette kan der dannes et topografisk billede af overfladen. Øverst til højre er vist et konkret eksemplar på en bladfjeder med et spids. På billedet nederst til højre er en kolloid partikel blevet monteret på bladfjederen. Billederne er optaget ved hjælp af et elektronmikroskop. bruges til at måle ganske små kræfter med meget stor præcision. Enhver vekselvirkning mellem spidsen på bladfjederen og en prøve vil føre til en afbøjning, Δz, af bladfjederen, som vi kan måle som beskrevet ovenfor. Hvis fjederkonstanten, k, yderligere er kendt, kan denne afbøjning herefter nemt omsættes til en kraft ved hjælp af Hookes lov, F = k Δz. På denne måde kan vi måle kræfter så små som 1 pn (10-12 N). Til sammenligning kan nævnes, at nøjagtigheden på gode laboratorievægte er af størrelsesorden nogle få mikrogram (svarende til en tyngde på ca N). Hvis bladfjederen nu yderligere bevæges vertikalt relativt til prøven, kan vekselvirkningen bestemmes som funktion af afstanden mellem spidsen og prøven (se figur 2). Figur 2: Ved kraftmålinger mellem spidsen på en bladfjeder (eller en kolloid partikel monteret på en bladfjeder) og en given overflade, fl yttes bladfjederen langsomt relativt til overfl aden, således at kraften kan bestemmes som en funktion af afstanden mellem de to elementer. I et sådan forsøg genererer vi normalt to kurver: én som giver kraften, når spidsen føres ind mod overfl aden, og én som giver kraften, når spidsen efterfølgende trækkes væk fra overfladen igen. LMFK-bladet, nr. 2, marts

3 Figur 3: Tre eksempler på kolloide vekselvirkninger. Øverst: Langtrækkende og frastødende dobbeltlagskraft mellem hydrofile overflader i vand og i en NaCl opløsning. I midten: Tiltrækkende kraft mellem hydrofobe overflader i vand. Den tiltrækkende kraft skyldes, at en mikroskopisk luftboble er dannet mellem de to overflader. Nederst: To hydrofobe overfl ader i pentanol vekselvirker ikke med hinanden, før de føres helt tæt sammen. Hvis vi imidlertidigt ønsker at sammeligne målte vekselvirkninger med teoretiske modeller, er det ikke altid optimalt at måle kraften mellem spidsen på bladfjederen og en given prøve, hvilket bl.a. skyldes, at geometrien af denne spids ikke er veldefineret. Desuden fremstilles sådanne bladfjedre med indbygget spids kun af få forskellige materialer, og det er begrænsende for, hvilke typer af vekselvirkninger, der kan måles. I stedet for fremstiller vi derfor vores egne måleredskaber med de ønskede egenskaber. Bladfjedre uden indbygget spids kan købes, og for enden af en sådan limer vi så en lille kolloid partikel af en størrelse på 1-10 μm. Dette gøres under et mikroskop og kræver lidt ekstra udstyr og en del fingerfærdighed. Til gengæld giver denne teknik os nogle klare fordele. Den påhæftede kolloide partikel har en helt veldefineret geometri, og det giver os næsten uanede muligheder for at undersøge vekselvirkninger mellem forskellige typer af overflader. Man kan selvfølgelig vælge partikler af forskellige typer af materialer, men ofte vil vi vælge partikler af SiO 2 eller guld, som nemt kan dækkes med bestemte kemiske stoffer og derved give en ønsket kemi på overfladen. 44 LMFK-bladet, nr. 2, marts 2008

4 Eksempler på måling af vekselvirkninger I figur 3 har vi vist tre eksempler på vekselvirkninger, som er målt mellem en kolloid partikel og en plan overflade. I det første tilfælde er vekselvirkningen målt mellem to hydrofile overflader i henholdsvis rent vand, 10 mm NaCl og 100 mm NaCl (figur 3a). Det ses tydeligt, at der findes en langtrækkende og frastødende kraft mellem partiklen og overfladen i rent vand, og at denne kraft reduceres, når der tilsættes salt. Hydrofile overflader vil altid være mere eller mindre elektrisk ladede, når de er i vand. I dette tilfælde, hvor overfladen er af SiO 2, stammer denne ladning fra en frasplatning af protoner fra OH-grupper, hvilket gør overfladen negativt ladet. Denne ladning på overfladen bliver modsvaret af ioner i opløsningen, som sikrer, at systemet totalt set er ladningsneutralt. Disse ioner er ikke helt frie til at bevæge sig rundt i opløsningen, men vil diffundere rundt i et lag tæt på overfladen. Når to sådanne overflader bringes tættere på hinanden, vil de to lag af løst bundne ioner begynde at overlappe, hvilket resulterer i et slags osmotisk tryk, som prøver at skubbe overfladerne fra hinanden. Denne kraft kaldes derfor dobbeltlagskraften. Ved tilsætning af salt, vil de nyankomne ioner skærme for alle elektrostatiske vekselvirkninger i systemet, så deres rækkevidde bliver kortere. Det er derfor, at dobbeltlagskraften får en meget kortere rækkevidde ved tilsætning af NaCl. Efterfølgende er disse overflader blevet behandlet med et lag af kulbrinter, hvilket gør dem hydrofobe. Dette ændrer radikalt på vekselvirkningen mellem partiklen og overfladen som vist i figur 3b. Efter at overfladerne er blevet gjort hydrofobe, er de ikke længere elektrisk ladede i vand, og derfor ses der ikke længere nogen frastødende dobbeltlagskraft. I stedet måler vi en usædvanlig form for kraftkurve, hvor vekselvirkningen afhænger stærkt af, om partiklen bevæges hen mod overfladen eller trækkes væk fra overfladen. Idet partiklen bevæges hen mod overfladen, ses ingen vekselvirkning før i en given afstand, hvor partiklen i et ryk trækkes ind til overfladen. Idet partiklen efterfølgende trækkes væk fra overfladen, observeres en tiltrækkende kraft, som aftager kontinuert med afstanden til overfladen. Ved en afstand på ca. 70 nm forsvinder enhver vekselvirkning i et diskontinuert spring. Forklaringen på denne særprægende vekselvirkning mellem den hydrofobe partikel og den hydrofobe overflade skal netop findes i det faktum, at hydrofobe overflader skyer vand. Derfor samler nanoskopiske luftbobler sig på den hydrofobe overflade. Idet den hydrofobe partikel bringes i kontakt med overfladen, samler disse luftbobler sig til en større mikroskopisk luftboble, som danner en bro mellem overfladen og partiklen, når denne trækkes væk. At dette alene har at gøre med overfladernes anstrengte forhold til vand ses i figur 3c, hvor vi har beholdt den samme overflade og partikel, men har udskiftet vandet med pentanol. For dette system ses nu hverken en frastødende dobbeltlagskraft eller en tiltrækkende hydrofob kraft. Dette er et tydligt eksempel på, at det er overfladekemien såvel som mediet, der er ansvarlig for vekselvirkningen mellem kolloider. Helt ned til enkeltmolekylniveau For biologiske kolloider er kræfter som dem beskrevet ovenfor naturligvis også vigtige, men for sådanne systemer findes desuden andre typer af vekselvirkninger, som kan være meget dominerende under de rette omstændigheder. Proteiner fungerer ofte som receptorer, der kan binde stærkt til andre typer af molekyler (ligander), som de evolutionært er blevet udviklet til at kunne genkende. Sådanne specifikke bindinger kan være meget stærke. Med små ændringer i kraftmålingen beskrevet ovenfor er vi faktisk blevet i stand til at kunne manipulere med enkelte molekyler eller at kunne måle vekselvirkninger mellem enkelte par af molekyler. Først dropper vi vores kolloide partikel og vender tilbage til udgangspunktet med en bladfjeder, som er udstyret med en skarp spids i enden (som i figur 1). Enden af sådan en spids vil typisk have en krumningsradius på omkring nm, hvilket faktisk er i samme størrelsesorden som store molekyler såsom syntetiske polymerer eller proteiner. Det er dette sammenfald i størrelse sammenholdt med vores mulighed for at kunne måle selv yderst svage vekselvirkninger, som betyder, at vi nu kan bevæge os helt ned på molekylært niveau. Et eksempel på en protein-ligandbinding er bindingen mellem proteinet streptavidin og liganden LMFK-bladet, nr. 2, marts Fysik og kemi

5 Figur 4: Styrken af en binding mellem proteinet streptavidin og liganden biotin måles ved fastgøre den ene slags molekyle til en overflade og det andet molekyle til spidsen på vores bladfjeder. Når spidsen bringes i kontakt med overfladen, kan de to molekyler binde til hinanden. Efterfølgende trækkes spidsen så tilbage, indtil bindingen brydes. Brydningskraften afhænger bl.a. af den hastighed, hvormed spidsen trækkes tilbage. I den nederste del af fi guren er vist resultaterne for den mest sandsynlige brydningskraft ved en given hastighed, F* (fundet ud fra den stokastiske fordeling af brydningskræfter), afbildet som funktion af den naturlige logaritme til en parameter r, som er produktet af tilbagetrækningshastigheden og fjederkonstanten af bladfjederen. De to lineære områder fortæller os, at to forskellige energibarrierer er ansvarlige for at holde molekylerne sammen, afhængigt af hvor hurtigt vi trækker. biotin (vitamin H). Vekselvirkningen mellem sådan et par af molekyler kan undersøges ved eksempelvis at fastgøre streptavidin til en overflade og biotin til spidsen på vores bladfjeder. For at give de to molekyler mulighed for at finde hinanden, når spidsen bringes tæt på overfladen, er det en fordel at fastgøre molekylerne til spidsen og overfladen via en fleksibel polymer, som giver dem en vis bevægelsesfrihed. Eksperimentet udføres nu ved at bringe spidsen tæt på overfladen og håbe på en binding mellem de to molekyler, hvorefter spidsen igen trækkes væk fra overfladen, samtidigt med at der måles, hvor stor en kraft, der skal til for at bryde bindingen mellem de to molekyler. Princippet i dette eksperiment er illustreret i figur 4. Den kraft, der skal til for bryde en binding mellem sådan to molekyler, er dog langt fra en absolut størrelse, men en størrelse som afhænger af, hvordan vi udfører eksperimentet. F.eks. afhænger kraften af, hvor hurtigt vi trækker spidsen væk fra overfladen og af fjederkonstanten for vores bladfjeder. Ydermere vil to eksperimenter, som er udført på præcis samme måde, aldrig give helt det samme resultat, hvilket skyldes, at brydningen af bindingen er en såkaldt stokastisk proces, som udover vores påvirkning også er styret af den (tilfældige) termiske energi i systemet. Alt dette komplicerer selvfølgelig analysen af de resultater, der kommer ud af sådan et forsøg, men vi kan faktisk vende denne komplikation det til vores egen fordel. Ved at gentage forsøget mange gange og systematisk ændre f.eks. den hastighed, hvormed spidsen trækkes væk fra overfladen, kan vi sammenligne resultaterne med en stokastisk model. På den måde kan vi få et helt unikt indblik i bindingen mellem de to molekyler. I figur 4 er vist, hvordan sådan et forsøg fører til, at vi kan påvise, at bindingen mellem streptavidin og biotin (og brydningen af denne) er domineret af to energibarrierer. Ved langsomme hastigheder (tæt på ligevægt) er det den yderste energibarriere, som holder de to molekyler sammen, mens den inderste energibarriere bliver ansvarlig for brydning af bindingen, når systemet er langt fra ligevægt. Fremover Det må forventes, at de metoder, som er beskrevet i denne artikel, fremover vil få stigende betydning for den kvantitative beskrivelse af systemer af voksende kompleksitet. Ved at give indsigt på lille skala vil metoderne bl.a. medvirke til kvantificeringen af cellebiologien og den molekylære biologi samt give helt nye muligheder for på rationel vis at designe og kontrollere stabiliteten af tekniske produkter inden for fødevare-, bioteknologi- og biomedicinsk industri. 46 LMFK-bladet, nr. 2, marts 2008