Fotoaktive proteiner atomfysiske motoder anvendt på biologiske problemstillinger. Lars H Andersen IFA

Transkript

1 Fotoaktive proteiner atomfysiske motoder anvendt på biologiske problemstillinger Lars H Andersen IFA

2 Molekylær fysik i grænsefladen: Physics: Accelerators, ion sources, lasers, storage rings etc Biology: Proteins Chemistry: Synthesis, theory

3 Lagerringe Storage rings for anti-proton physics (LEAR): [1986] Aarhus storage ring ASTRID: [1990] Electrostatic ion Storage Ring, Aarhus ELISA: [1997]

4 Hvorfor benytte en lagerring? (Bio)molekylerne har tid til at opnå temperaturligevægt med omgivelserne (stuetemperatur) de indre frihedsgrader! Vi kan opbevare molekylerne indtil de har haft tid til at respondere på absorptionen af lys (statistisk henfald) Effektiv måling af fotofragmenter pga. kinetiske energi

5 Det grønne fluorescerende Protein (GFP) Fra vandmanden Aequorea victoria; (Shimomura et al. in 1961); Kloning af GFP i 1992; fusion af DNA sekvensen i proteiner. 42 Å 24 Å 238 amino acids 11-stranded β-barrel.

6 In vivo og real time billeder af planteceller med GFP Leaf cells expressing the trans-membrane domain-gfp fusion exhibited a population of highly fluorescent mobile organelles located in the cortical cytoplasm of epidermal cells, the dynamics of which can be viewed in a movie. Chris Hawes & Alan Betteridge,Research School of Biological & Molecular Sciences,Oxford Brookes University, Oxford, OX3 0BP, UK Petra Boevink, Simon Santa Cruz & Karl Oparka, Scottish Crop Research Institute, Dundee,UK

7 GFP 11-stranded β-barrel

8 GFP

9 H 3 C 9 13 N + H

10 Hjertet i opsin proteinerne er Retinal H 3 C trans 9 13 N + H H 3 C cis 9 N + H

11 Alle synsproteiner indeholder den samme kromofor, retinal Forskellig absorptionsbølgelængde. Hvordan??

12 Protein with retinal 7 transmembrane α-helices

13 Øjets protein: Rhodopsin

14 Forstyrrelser i proteiner Polar int. Amino Acids Proton overførsel: Bestemmer ladningen. Water

15 Fotoaktive proteiner Protein signal Proton transfer Conformational changes (fs-studies) S 1 absorption Chromophore S 0

16 Molekylære kromoforer i forskellinge omgivelser In a protein In vacuo hν 1 Electronic excitation hν 0 In solution O O hν 2 N N

17 Den eksperimentelle teknik (ELISA)

18 Produktion af ioner 2-4 kv Heated capillary Octupole Ion trap needle Ion bunch 1.2 spray solution Pumps yield time [μs]

19 Electrospray masse spektrum GFP kromofor anion NO 3 - NO - 2 O - 2 anions (215 amu) anion cation M/q M/q

20 Lagerringen ELISA Ion source and accelerator Electron target Laser Detector for neutral fragments

21 In reality:

22 Storage lifetime in ELISA 1,000 w7 cation counts (6 revolutions) 100 y=a1.exp(-t/t1) Chi^2 = R^2 = A ± t ± τ=5.9 s time [s] 1000 w7 anion counts (6 revolutions) 100 Chi^2 = R^2 = A ± t ± τ=4.7 s time [s]

23 Fotoabsorption at ELISA

24 De neutrale fotofragmenter ions injection into the ring laser firing Neutral counts [m s] Time after injection [ms]

25 Absorption og fragmentering

26 Beregning af henfaldskurven 1000 E a =3.08 ev A=10 17 (n=1) experiment Yield 100 curved due to: σ = k B C T 0 10 GFP nm Time (ms)

27 Absorptionspektrum af Green Fluorescent Protein (GFP) GFP: neutral HO O O 1 N N NH HO NH O anion Gas-fase model kromofor (anion): O O N N λ [nm]

28 O+Neutral+-NC3H3ONNNCH3H3σ abs (λ) [arb. units] H Vacuum Neutral Neutral + Anion λ [nm] Protein OCNOAnion H

29 neutral protein anion GFP-kromoforen I forskellige omgivelser Absorption [arb. units] gas phase cation anion ph<1 ph=7 ph= H 2 O solution λ [nm]

30 Konklusion: Det indre af vandmandens protein ligner mere vakuum end vand!

31 GFP 11-stranded β-barrel

32 GFP

33 Kvantemekaniske beregninger

34

35 Der kan ikke være vakuum-tilstande i alle fotoaktive proteiner

36 Protein with retinal

37 gas-fase absorption måling ved ELISA 1.0 Vacuum 0.5 σ Absorption [arb. units] Solution O O N N CH3 CH3 Protein Opsin shift Wavelength[nm]

38 Forstyrrelser En negativ partner-ion π π*: e - H 3 C ½+ S 1 ½ N + H D - H 3 C S 0 S 1 N + H D - S 0 Blue shift

39 En drejet ring H 3 C S 0 N + H Limit the conjugation

40 Vi kan placere ladninger på kromoforen H 3 C 9 13 N N + H 3 C 9 13 N + CH3 N H 3 C 9 13 N + H N + H 3 C H

41 N N + NMe 3 σ abs [arb. units] N + NMe λ [nm] No charges nm 480 nm

42 Dynamikken ændres af omgivelserne PYP (Groenhof et al JACS 2004)

43 Vi får molekylerne fra andre laboratorier

44 Steen Brøndsted Nielsen Lutz Lammich

45 Hvor kommer pengene fra? FNU (Forskningsrådet for Natur og Univers) Carlsbergfondet Lundbeckfonden