Mælkesyrebakterier og holdbarhed Navn: Forsøgsvejledning
Mælkesyrebakterier og holdbarhed Formål med forsøget Formålet med denne øvelse er at undersøge mælkesyrebakteriers og probiotikas evne til at øge holdbarheden af kød ved at: 1. Undersøge forskellen på bakterieantal og -sammensætning i ubehandlet kød, kød tilsat Cultura og Cultura alene, som har stået ved stuetemperatur i to dage og som ikke har stået særlig længe 2. Undersøge om en eventuel forskel kan skyldes en ph-forskel. Teori Inde i kroppen har probiotika evne til at undertrykke væksten af andre bakterier, hvilket er en af forklaringerne på deres sundhedsfremmende effekt. Mange probiotika er mælkesyrebakterier, og det er et generelt træk for mælkesyrebakterier, at de kan udelukke andre bakterier. Dette benyttes i produktionen af mange varer fx pølser, ost og ensilage. Tilsætning af mælkesyrebakterier til fødevaren bevirker, at fødevarerne kan holde sig meget længe selv ved stuetemperatur. Den forlængede holdbarhed skyldes hovedsageligt, at mælkesyrebakterierne danner mælkesyre, som gør fødevaren sur, hvilket gør det sværere for andre bakterier at overleve. Bakterieantallet og -sammensætningen i frisk Cultura, kød og i blandingen (Cultura + kød) undersøges ved pladespredning på to forskellige plader en plade, der indeholder et medie (TSA), som de fleste bakterier kan vokse på, og en plade med et andet medie (MRS), hvor kun mælkesyrebakterier kan vokse. I teorien vil der i frisk kød ikke være mange bakterier. Hvis der er bakterievækst, er det mest sandsynligt at der er forskellige bakterier på TSA pladen, men ingen på MRS-pladen (fordi der ikke er mange mælkesyrebakterier i kød). For Cultura vil der være mange bakterier og lige mange bakterier på TSA-pladen som på MRS-pladen (fordi alle bakterierne i Cultura er mælkesyrebakterier). I blandingen (Cultura + kød) er der i teorien ¼ af de bakterier, som findes i Cultura. Hypoteser Efter inkubering vil der observeres en stor stigning i antal af bakterier i kød, hvoraf få af dem er mælkesyrebakterier og der vil være mange forskellige slags bakterier. I blandingen med Cultura og kød vil der hovedsageligt være mælkesyrebakterier. I Cultura vil der kun være mælkesyrebakterier. Mælkesyrebakterier hæmmer dermed væksten af andre bakterier i kød. Side 2 af 11
Inden vi starter Når man arbejder med bakterier, er det vigtigt at arbejde sterilt, da der ellers kan komme andre bakterier frem, end dem man ønsker at undersøge. Alt udstyr (pipettespidser, podenåle, agar plader mm.) er sterilt, og skal holdes væk fra andre bakterier. Hvis en pipettespids for eksempel har rørt hånden, er det vigtigt, at der tages en ny. Udstyr opbevares i lukkede poser eller beholdere, og man skal kun røre på de steder, der ikke kommer i kontakt med anvendte bakterier og medier. HUSK at skrive navn og dato på alle anvendte eppendorfrør, plader mm. På pladerne skrives der langs kanten på bunden, da lågene kan byttes om. Det er vigtigt ikke at indtage mad og drikkevarer, når der arbejdes med bakterierne. Husk at vaske hænder grundigt med sæbe inden I starter. Sprit bordet af og sørg for kun at have de ting fremme, der skal bruges. Øvelsen afsluttes med at vaske hænderne grundigt med sæbe. Inden besøget Følgende er blevet udført af lærerne 1. Autoklavering af materialer: Eppendorfrør (19 x antal grupper), Falcon rør hvis de ikke allerede er sterile (6 x antal grupper), 0,9 % NaCl opløsning (150 ml pr. gruppe), pipettespidser til 1000 μl og 100 μl. 2. Forberedelse af overnats-prøver, som indeholder henholdsvis ren frisk Cultura (C), rent frisk fedtfattigt hakket kød (K) og en blanding med 75 % kød og 25 % Cultura (M). 3. Udpladning af friske prøver på MRS og TSA plader. Disse fungerer som reference inden behandling. 4. Et eksempel på udpladning af overnats-prøverne. Side 3 af 11
Del 1 Lugt Materialer 3 x Falcon rør med overnatsprøver Ske eller spatel Et lille bægerglas med 70 % ethanol Bunsenbrænder Fremgangsmåde 1. Prøverne i Falconrørene tages frem. De blandes grundigt (fx med en teske husk at gøre teskeen ren mellem hver prøve med ethanol og flambering). 2. Åben forsigtigt låget og bemærk om der er forskel på deres lugt. 3. Notér lugten i svarskemaet sidst i vejledningen. Del 2 Udpladning af prøver Når man skal udplade prøver, er det vigtigt at forberede passende fortyndinger, så der ikke kommer for mange bakterier på pladerne, og det er umuligt at tælle. I Cultura er der for eksempel omkring 10 9-10 10 CFU/mL, så hvis man tager 100µL fra en ufortyndet prøve og plader ud, vil der være 10 8-10 9 CFU på pladen. Dette er selvfølgelig umuligt at tælle, både fordi der er så mange, men også fordi der ikke dannes enkeltstående kolonier, og bakterierne ses som én stor masse på pladen. Der skal derfor fortyndes i et passende omfang, så der på pladen kommer et antal bakterier, som kan tælles (mellem 30-300 CFU). Der udplades opløsninger af overnats-prøverne af hakket kød, Cultura og blandingen for at kunne undersøge bakterieantallet og -sammensætningen i hver af de tre prøver. Materialer 3 x Falcon rør med overnats-prøver 3 x Falcon rør (50 ml) med låg 80 ml 0,9 % NaCl opløsning eller Demi-vand (autoklaveret) Lang teske eller spatel 19 sterile eppendorfrør (6 pr. opløsning for kød og blanding, 7 til Cultura) Sterile 1000 L og 100 L pipettespidser 1000 L og 100 L pipetter 9 TSA agar plader (3 pr. opløsning Cultura, kød, blanding) 9 MRS agar plader (3 pr. opløsning Cultura, kød, blanding) Drigalski-spatel Et lille bægerglas med 70 % ethanol Bunsenbrænder Tændstikker Vægt Side 4 af 11
Fremgangsmåde Del 2.1 Pladerne tørres Alle de anvendte agar plader skal være tørre, hvis ikke de er det allerede sættes de ind i en LAF bænk i ca. 20 minutter inden brug. Pladerne sættes med bunden opad på skrå hen over låget, så bakterier i luften ikke falder ned på pladen (se figur nedenfor). Del 2.2a. Fremstilling af fortyndinger For hver af de tre prøver Cultura (C), kød (K) og blandingen (M for mix) udføres følgende: Husk at skifte vejeskål for hver gang, der vejes en ny prøve. 1. Marker de sterile 50mL Falcon rør med hvilken prøve, det skal indeholde, gruppenavn, dato og at det er en 10-1, fortynding. Vigtigt at vide: Falcon-rørene er sterile, så de skal ikke ligge og flyde med åbent låg, da de kan blive kontamineret af andre bakterier. 2. Vej 2 g overnats-prøve direkte i det tilhørende Falcon rør. Stil Falconrøret i et bægerglas, så det er nemmere at få prøven ned i røret - husk at nulstille. Blandingen af kød og Cultura er allerede blandet i forholdet 1:4 (dvs. 25 % Cultura, 75 % kød). 3. Tilføj 20 ml 0,9 % NaCl til hvert Falconrør. Sæt låg på, whirly mix rørene og lad stå, indtil den skal bruges (så opløses prøven lige så stille). 4. Sæt 19 sterile eppendorfrør i et stativ og mærk dem på låget med hvilken prøve der skal i: o 7 eppendorfrør til Cultura, o 6 til kødet og o 6 til blandingen Skriv på rørene C = Cultura, K = Kød, M = Mix, gruppenavn (forkortet version eller tal) og fortyndingsgrad (x10-2, x10-3, x10-4, x10-5, x10-6, x10-7 og for Culturaen x10-8 ). 5. Der fyldes 900 µl 0,9 % NaCl vand i hvert af de 19 rør med en 1000 µl pipette. 6. Ryst Falcon rørene med de 10 gange fortyndede prøver grundigt i to minutter. Nu skal fortyndingsrækkerne laves, og der skal arbejdes med én prøve (C/K/M) ad gangen. 7. Brug 100 L pipetten til at overføre 100 L fra Falcon røret med Cultura til det første eppendorfrør markeret C x10-2.. 8. Brug 1000 L pipetten til at overføre 100 L fra Falcon rørene med Blanding og Kød til de første eppendorfrør markeret hhv. M x10-2 og K x10-2 I prøverne, som indeholder kød, kan der være klumper og fedt, hvilket kan forhindre pipetten i at suge op sørg for at pipetten får suget hele mængden (100 L) op. 9. Bland væsken i eppendorf røret ved at suge op og ned et par gange med pipetten. Side 5 af 11
10. Skift pipettespids og overfør 100 L fra det første rør (x10-2 ) til det næste (x10-3 ) og sug igen op og ned et par gange for at blande. 11. Dette udføres indtil x10-7 (for kødet og blandingen) og x10-8 (for Culturaen) fortyndingerne er lavet. 100 L prøve kommes i 900 L 0,9 % NaCl-opløsning, dvs. der sker en 10 gange fortynding for hvert trin i fortyndingsrækken. Side 6 af 11
Del 2.2b Udpladning Der skal laves 3 TSA plader og 3 MRS plader pr. prøve med x10-6, x10-7 og x10-8 fortyndingerne for Culturaen og x10-5, x10-6 og x10-7 fortyndingerne for kødet og blandingerne. Dvs. 9 af TSA og 9 MSA agar plader. Antallet af bakterier i Cultura er formodentlig ca. 10 9-10 10 CFU/mL, og man kan derfor regne med, at der på x10-7 pladen vil komme omkring 10-100 (siden der kun udtages 100 µl). 1. Pladerne markeres i bunden med pladetype (TSA eller MRS), dato, gruppenummer, prøve (K, C eller M) og fortyndingsgrad x10 -x. Det er vigtigt, at der skrives på bunden og ikke på låget, for låget kan risikere at blive byttet om med et andet. 2. Udtag 100 µl prøve af de fortyndinger, som er nævnt ovenfor, og kom prøven på den mærkede agarplade. Tjek, at prøven inkl. fortyndingen stemmer med det, der står på petriskålen. Husk at skifte pipettespids mellem hver prøve. 3. Drigalski spatlen steriliseres ved at blive dyppet i 70 % ethanol og flamberet over bunsenbrænderen. Det er vigtigt at spatelen tages hurtigt ud af ilden, da den ellers sprænger. Ved denne metode går der ild i spritten, som herefter damper af. 4. Afkøl spatelen ved at holde den mod agaren (væk fra bakterierne) i et par sekunder. 5. De 100 µl prøve spredes ud med den sterile Drigalski spatel til pladen er HELT tør! 6. Drigalski spatelen steriliseres igen, og en ny fortynding spredes ud på en ny plade. Dette gentages indtil alle pladerne med de forskellige fortyndinger er lavet. 7. Når pladerne er tørre (den væske I har puttet på) kommes der folie omkring. 8. Pladerne fordeles mellem gruppens medlemmer Evt. sådan at ét medlem har første udpladning (laveste fortynding af alle typer), et andet medlem anden udpladning (miderste fortynding) osv 9. Inkuber pladerne på hovedet (agaren opad) ved 37 C i 3-4 dage (kan til nød også gøres ved stuetemperatur) 10. Skriv resultatet fra hver medlems plader til de andre medlemmer i gruppen når pladerne har inkuberingen. På den måde kan der sammenlignes med det eksempel lærerne har lavet inden I kom. Pladerne inkuberes helst ved 37 grader og ikke ved stuetemperatur, for ellers ville de probiotiske bakterier, som er vant til at vokse i menneskekroppen, vokse for langsomt. Når pladerne inkuberes er det vigtigt, at de stilles med bunden i vejret, så eventuel kondensvand ikke løber ned på agaren. Side 7 af 11
Side 8 af 11
Del 2.3 ph Materialer 3 x Falcon rør med overnats-prøver 70 % Ethanol Bunsenbrænder Vægt Fremgangsmåde 1. Brug Falcon-rørene fra fortyndingsrækken til at måle ph- 2. Da prøven har stået lidt, ryst grundigt i to minutter. 3. Mål ph med et ph indikator papir og noter resultatet i svarskemaet sidst i vejledningen. Husk at bruge forskelligt ph-indikatorpapir til hver prøve. Del 3 - Undersøgelse af bakterieantal og sammensætning i friske og overnats-prøver (her og derhjemme). Materialer Pladerne fra den friske udpladning (dem lærerne har lavet inden i kom) Pladerne fra overnats-prøverne (dem lærerne har lavet inden i kom) Del 3a Kolonier på pladerne tælles Efter inkubering vil man kunne se en masse små prikker på pladerne. Disse prikker kaldes kolonier, og i teorien er hver prik fremkommet af én enkelt bakterie, som har formeret sig og dannet så mange bakterier, at de danner en synlig prik. Denne bakterie kaldes en colony forming unit (CFU). Antallet af CFU'er skulle derfor gerne stemme overens med, hvor mange bakterier, der har været fra start. Man kan derfor finde ud af, hvor mange bakterier der er i 1 ml af det, der undersøges (N), ved at tælle CFU'er og gange med fortyndingsfaktoren (10 n+1 ). repræsenterer tallet skrevet på eppendorf rørene. Fremgangsmåde 1. Tæl kolonier (CFU er) på pladerne fra den friske udpladning og fra overnatsudpladningerne som lærerne har lavet inden I kom. Kolonierne tælles nemmest på pladen med den fortynding, der giver omk. 30-300 kolonier. Hvis der ikke er nogen bakterier på pladen med den største fortynding noteres dette. Der skal tælles på mindst 12 plader (MRS og TSA fra hver prøve (C/K/M) og fra både frisk og overnats-prøver - 2x3x2). Notér antallet (også selvom det er 0). Tip: Tæl kolonierne ved at tage en tusch og sætte en prik på hver koloni, der er talt, så man kan huske, hvor man er kommet til. Side 9 af 11
Del 3b Pladerne observeres Fremgangsmåde Læg mærke til forskelle på pladerne og notér alle observationer. 1. Hvor mange bakterier er der på pladerne fra friske prøver i forhold til overnats-prøverne? 2. Hvor mange mælkesyrebakterier (vokser både på MRS og på TSA mediet) er der i forhold til andre bakterier (vokser kun på TSA mediet)? 3. Er der forskelle mellem pladerne fra de forskellige prøver? På TSA pladerne vil der typisk være mange forskellige slags bakterier, hvor kolonierne også ser forskellige ud. Hvis kolonierne observeres vha. stereolup (under mikroskop) kan man se, at der faktisk er endnu flere forskellige bakterier, end man kan se forskel på med det blotte øje. Bakteriekolonier, der tilsyneladende ser ens ud, kan rent faktisk være forskellige, de kan være rynkede eller glatte, have en skarp eller diffus kant, være gennemsigtige eller ugennemsigtige osv. Notér observationerne og resultaterne i svarskemaet sidst i vejledningen. Side 10 af 11
Friske prøver TSA Overnats-prøver TSA - eksempel Overnats-prøver TSA Egne plader Friske prøver MRS Overnats-prøver MRS- Eksempel Overnats-prøver MRS Egne plader Friske prøver Antal mælkesyrebakterier Overnats-prøver Antal mælkesyrebakterier Svarark - Resultater Cultura yoghurt (C) Kød (K) Kød + Cultura (M) Lugt ph Udseende (beskrivelse af kolonierne på pladerne) Antal CFU i 1 ml Cultura x10-6 Cultura x10-7 Cultura x10-8 Kød x10-5 Kød x10-6 Kød x10-7 Kød + Cultura x10-5 Kød + Cultura x10-6 Kød + Cultura x10-7 Spørgsmål Stemmer antallet af CFU/mL med det forventede? Har mælkesyrebakterierne fra yoghurten kunne forhindre væksten af andre bakterier i kød? Kan denne forskel skyldes produktion af mælkesyre (en sænkning af ph)? Side 11 af 11