Test dit eget DNA med PCR Navn: Forsøgsvejledning Side 1 af 8
Formål med forsøget Formålet med dette forsøg er at undersøge jeres arvemateriale (DNA) for et transposon kaldet Alu. Et transposon er en DNA-sekvens, der kan hoppe rundt i vores genom. Vi skal i dette forsøg undersøge Alu sekvenser på kromosom 16 i vores genom (det humane genom), om der her er indsat en Alu sekvens på enten et eller begge sites i kromosom 16 hos hver enkelt af jer. Man kan afgøre om der er indsat en Alu sekvens på kromosom 16 ved at amplificere den region Alu sekvensen indsættes i. Her skal I undersøge et bestemt lokus kaldet PV92. For at få netop denne specifikke region amplificeret bruges teknikken PCR (Polymerase Chain Reaction). Herefter kan størrelsen af det amplificerede DNA visualiseres med gelelektroforese. Alu sekvenser har en størrelse på 300 basepar. Det vides desuden at lokus PV92 har en størrelse på 415 basepar uden Alu sekvensen. Det betyder, at hvis man har indsat en Alu sekvens på begge sine kromosom 16 (man er homozygot for den genotype) vil der vise sig ét kraftigt bånd ved en afstand svarende til en størrelse på 300 + 415 = 715 bp. Er man derimod heterozygot (har kun en sekvens indsat på det ene kromosom, men ikke det andet) vil der fremkomme to bånd på gelen: et ved 415 bp og et ved 715 bp. Har man til gengæld slet ikke indsat nogen Alu sekvens, vil der vise sig ét bånd svarende til størrelsen 415 bp. Side 2 af 8
Del 1 Udtagning af menneskelige celler Plastikkrus 10 ml 0,9 % NaCl opløsning (isotonisk saltvand) i rør, ét pr. elev Følgende udføres af alle: 1 x 2 ml eppendorfrør pr. elev 2 x automatpipetter (1000 µl) m. sterile pipettespids 10 ml saltvand tages i munden og der blandes grundigt rundt i 30 sekunder. Saltvand (+ celler) spyttes ud i et papkrus og denne svinges rundt for at blande cellerne. Automatpipetten indstilles til 1000 µl (1mL) og der suges dette op og puttes i et eppendorfrør med tal på. Tallet bruges på jeres rør resten af dagen, så husk det. Når alle har afgivet en celleprøve, passer I godt på jeres eppendorfrør med celler og begiver jer op i laboratoriet. Del 2.1 Isolering af DNA 1 x Eppendorfrør med DNA (spytprøve) pr. elev (fra Biotéket) 1 x Eppendorfrør med 500 µl 0,9 % NaCl opløsning (isotonisk saltvand) pr. hold 1 x Eppendorfrør med 400 µl Chelex-opløsning pr. hold 1 x 1,5 ml Eppendorfrør pr. elev Jeres Eppendorfrør med 1 ml cellemateriale centrifugeres i en centrifuge i 1 minut ved max rotation (ca 12.000 rpm). OBS! Husk at centrifugen skal være balanceret. Spørg underviserne hvordan. Supernatanten (væsken se billede) suges op med en pipette og smides i affaldsbøtten pas på at pelletten (hvid klump i bunden af røret se billede) ikke ryger med ud. Supernatant Pellet Tilsæt 30 µl 0,9 % NaCl, og resuspendér cellerne (Brug whirlmixeren på jeres bord). Ryst røret med chelex, så de små perler blandes med væsken. Tilsæt 100 µl chelex opløsning med en 1000 µl pipette. Eppendorfrøret placeres i en 99 C varmeblok i 10 minutter. Mens i venter blandes MasterMix (Del 2.2 KUN punkt 1). Efter 10 minutter tages røret op og stilles på is til det er kølet af (ca. 1 min.). Sådan indstilles pipetterne til 10 µl Ryst røret grundigt og centrifuger det i centrifugen ved max rotation (ca. 12.000 rpm i 1 min). Overfør 30 µl supernatant (væske) til et nyt eppendorfrør. OBS! Der må ikke komme noget af bundfaldet eller kuglerne med over) og marker tydeligt med jeres tal. I rørene har I jeres DNA! Side 3 af 8
Del 2.2 klargøring af prøve til PCR 1 x Eppendorfrør med 100 µl MilliQ H 20 (sterilt vand) pr. hold 1 x Eppendorfrør med 45 µl Primermix 715 (Der står PM715 på røret, indeholder både forward og reverse primer) pr. hold 1 x Eppendorfrør med 20 µl dntp (2mM af hvert nukleotid datp, dctp, dgtp og dttp) pr. hold DNA polymerase 1 Eppendorfrør med 40 µl GC-buffer pr. hold I et nyt tomt eppendorfrør (evt. markeret MasterMix) blandes følgende: o 66 µl MilliQ o 40 µl Primermix o 16 µl dntp o 32 µl GC-buffer (pipettér forsigtigt, da den kan skumme) o 3 µl MgCl 2 Blandingen er nok til hele gruppen dvs. til alle jeres 3 DNA prøver. 2 µl pfu x7 DNA polymerase hentes hos underviserne og pipetteres som det sidste i blandingen. OBS! Polymerasen bliver nedbrudt, når den ikke er på frost. Bland indholdet forsigtigt ved at suge op og ned et par gange med en 100 µl pipette indstillet til 30 µl. MasterMixen fordeles ud i 3 PCR-rør. Der skal 39 µl i hvert rør. Herefter tilsættes 1 µl af jeres DNA til jeres eget PCR rør med MasterMix. Rørene sættes nu i PCR-maskinen ved 4 C. PCR-programmet sættes i gang af underviserne. OBS! Husk at skrive jeres nummer på PCR-rørene! Til dette forsøg bruges følgende PCR-program: I. 98 C 2:00 Pre-denaturering (vigtigst ved anvendelse af store templates eksempelvis genomisk DNA) II. 94 C 0:30 Denaturering III. 77 67 C 0:30 Primer annealing (-1 C/cyklus) Punkt II-IV gentages i 10 runder IV. 72 C 1:00 DNA syntetisering V. 94 C 0:30 Denaturering VI. 70 C 0:30 Primer annealing Punkt V-VII gentages i 20 runder VII. 72 C 1:00 DNA syntetisering VIII. 72 C 5:00 DNA syntese af al resterende DNA IX. 4 C Opbevaring af reaktionen indtil afhentning i maskinen Efter PCR rørene er sat i PCR maskinen, kontakt underviserne om støbning af agarosegeler. Side 4 af 8
Del 3 Støbning af gel til gelelektroforese Da der kun er 10 brønde i hver gel skal der som udgangspunkt støbes 3 geler. Underviserne udpeger de grupper der står for dette. 0,5 g Agarose (er afmålt og findes på fællesbordet i 250mL flaske med blåt låg) 50 ml 1X TAE buffer (buffer med Tris Eddike og EDTA) Nitrilhandsker 5 µl SYBR-safe (har læreren, da det er lysfølsomt og derfor ikke skal stå fremme) Tilsæt de 50 ml TAE buffer til glassene med 0,4 g agarose og opløs agarosen i mikrobølgeovnen ved 620 W (det tager ca. 1-2 minutter). Al agarose er opløst når blandingen er helt klar! Husk at løsne låget på flasken og at flasken bliver meget varm! Brug grydelapperne, som I finder ved siden af mikroovnen, til at holde på flasken. Når det hele er smeltet afkøles væsken til ca. 60 C (til man kan holde på flasken uden at brænde sig) SYBR-safe er potentielt Påfør nitrilhandsker. kræftfremkaldende og der skal derfor Tilsæt 5 µl SYBR-safe, som hentes oppe ved fællesbordet. bæres handsker i forbindelse med Nu hældes blandingen op i en af støbeformene, hvor kammen støbning og håndtering af gelen. er sat i, så der kan dannes brønde i gelen. Gelerne stilles til afkøling i mindst 20 minutter. Side 5 af 8
Del 4 Gelelektroforese Støbt gel Jeres rør med PCR-produkt (ét pr. elev) 20 µl 2X Loading buffer pr. hold Pipette + spidser Hent jeres PCR rør fra PCR maskinen. Tilsæt 5 µl loading buffer(lb) til PCR røret. Loading bufferen vil falde til bunds, så søg for at blande godt ved at pipettere op og ned i røret. En underviser dækker gelen med 1X TAE buffer (elektroforesebuffer) En underviser tilsætter 6 µl DNA-ladder som demonstration af fremgangsmåden. Tilsæt 25 µl af jeres prøve med loading buffer til en tom hver. o! Når I afsætter prøven, så stik ikke pipettespidsen helt ned i gelen, men lad den svæve i brønden (der er tilsat loadingbuffer for at DNA et falder til bunds i brønden). Husk også at trække pipetten op af brønden igen inden stemplet slippes, så prøven ikke suges op igen. Gelen køres nu ved 100 V og 400 ma i 20 minutter. Her kan I notere i hvilke brønde I har påsat de forskellige prøver: Brønd 1 Brønd 2 Brønd 3 Brønd 4 Brønd 5 Brønd 6 Brønd 7 Brønd 8 Brønd 9 Brønd 10 Elektroforese kar nr: Side 6 af 8
Del 5 Resultatbehandling Grupperne hørende til de forskellige geler, kommer til at tage billede af gelen på skift med en underviser. Billedet sammen med DNA ladder nedenfor bruges til at svare på følgende spørgsmål: 1. Hvilken genotype tyder jeres prøver på? Notér resultatet nedenstående skema (1 for hvert hold): Navn Antal bånd og størrelse Genotype (++, +- eller --) 2. Er der andre bånd på gelen end ved de forventede størrelser? Hvis ja, kan I så komme på nogen grunde til dette? (Undervisere vil gå rundt og høre jeres svar). 100bp DNA Ladder (New England Biolabs) Side 7 af 8
Brønde Del 6 Evaluering Vi ville blive rigtig glade hvis i efter endt dag, ville bruge 5-10 minutter på at evaluere dagen på nettet. Du kan enten klikke på linket herunder, eller gå ind på vores Facebookside. Ved at like vores Facebookside får du også mulighed for at blive opdateret på spændende emner inden for Bioteknologi. http://www.bioengineering.dtu.dk/skolegymnasier/eduforce/evaluering-af-gymnasiebesoeg Facebook: Fremtidens Bioingeniører Synes godt om Om Our story Her ligger et link til evalueringsskemaet Side 8 af 8