Restriktionsenzymer findes Genkendelsessekvens

Transkript

1 Restriktionsenzymer Skanning Restriktionsenzymer findes i bakterier (forsvarsmekanisme) IKKE i eukaryote celler Restriktionsenzyme Genkendelsessekvens Palindromisk Otto, Anna, radar Madam I m Adam 5 -GAATTC-3 3 -CTTAAG-5 5 -GAATTC...GAATTC-3 3 -CTTAAG...CTTAAG-5 EcoRI 5 -G-OH 3 -CTTAA-P P-AATTC...G-OH HO-G...CTTAA-P P-AATTC-3 HO-G-5 1

2 Kløvning af DNA H H E E E H HindIII H H H EcoRI E E E 2

3 DNA gel-elektroforese 1 Påsætning af prøve 2 Elektroforese 3 Visualisering under UV-lys Langt Kort Agarose-gel med ethidium-bromid + 3

4 Southern blot 1. Kløvning 4. Hybridisering X Hybridisering med enkelstrenget radioaktiv probe 2. Elektroforese - Denaturering 5. Eksponering Enkeltstrenget DNA-probe + X Røntgenfilm 3. Blotting 6. Autoradiografi med båndmønster Blotting = overførsel Gel Membran 4

5 Cyklus Cyklus 1 Sekvens som skal amplificeres PCR 3 5 Uamplificeret DNA 2 strenge Primer Cyklus 3 Denaturering og annealing af primere Denaturering og annealing 5 af primere Primer Cyklus 2 Primer ekstension Nu 4 strenge Primer ekstension Nu 16 strenge Denaturering og annealing af primere Primer ekstension Nu 8 strenge 5 Cyklus 4-25

6 Restriktionskort 1 For at kunne orientere sig i en meget lang DNA-sekvens laves et såkaldt restriktionskort Det pågældende DNA kløves med flere forskellige restiktionsenzymer enkeltvis eller i forskellige kombinationer På basis af de fremkomne/resulterende DNA-fragmenter samles et restriktionskort visende de relative positioner for kløvningsstedet af hvert af enzymerne 6

7 Restriktionskort 2 Enzym A B A+B DNA Restriktions enzyme(r) A, B eller A+B Elektroforese DNAfragmenter 6 kb 3 kb 2 kb 7 kb 4 kb 5 kb 3 kb 2 kb Kort 1 kb A B A 3 kb 1 kb 5 kb 2 kb 7

8 Kloning Plasmider Klippe/klistre med restriktionsenzymer/ligaser Rekombinant DNA Genomisk DNA cdna Prober vs primere 8

9 Sekventering Enkeltstrenget DNA template 3 ACACAGTCTATCTCGTA 5 Primer Består typisk af + ca. 20 nukleotider 5 TGTG 3 + Nukleotider dntp datp dctp dttp dgtp Fluorescerende ddntp ddatp ddctp ddttp ddgtp Separering efter størrelse Detektor 5 TGTG T 3 5 TGTG TC 3 5 TGTG TCA 3 5 TGTG TCAG 3 5 TGTG TCAGA 3 5 TGTG TCAGAT 3 5 TGTG TCAGATA 3 5 TGTG TCAGATAG 3 5 TGTG TCAGATAGA 3 5 TGTG TCAGATAGAG 3 5 TGTG TCAGATAGAGC 3 5 TGTG TCAGATAGAGCA 3 5 TGTG TCAGATAGAGCAT 3 Primer Ny-syntetiseret sekvens + DNA polymerase Laser + Gel/kapillar Computeranalyse Den læste sekvens 5 TCAGATAGAGCAT 3 Komplementær sekvens (template) 3 AGTCTATCTCGTA 5 9

10 Eksempel på automatiseret DNA-sekventering Mutant N= G og T G>T Farvekode: A G T C T Normal 10

11 Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH) på f.eks. metafasekromosomer eller interfasekromosomer 1. Blodprøve 7. Hybridisering med fluorescerende denatureret probe 2. Dyrkning af celler 6. Denaturering 3. Tilsæt colchicine (ødelægger téntrådsapparatet) 4. Fikśer celler 5. Spred celler på præparatglas vha. dråbeteknik 11

12 Eksempler på FISH 1. Identifikation af ClpX genet på kromosom 15q22. Bemærk at alle fire søsterkromatider indeholder probe-signal 2. Balanceret translokalisation t(2;8) detekteret v.h.a. chromosome painting Kromosom 2 Kromosom 8 12

13 FISH: Anvendelsesmuligheder Translokation Deletion Duplikation Lokalisation af unik DNA-sekvens f.eks. genlokalisation Kønsbestemmelse Aneuploidi-undersøgelse 13

14 DNA-typer Single-copy DNA (45%) Disperseret repetitivt DNA (45%) Satellit DNA (10%) 14

15 DNA-typer (2) Kernen (~3x10E9 bp, haploid) Single-copy (f.eks. gener: ~30.000) Ekstragenisk Tandem repeats Satellit DNA α-satellitter Mini-satellitter Micro-satellitter F.eks. Trinukleotid repeat ekspansioner. Disperseret repetitivt DNA SINE (Short INterpersed Elements) LINE (Long INterpersed Elements) Mitokondriet 2 rrna gener 22 trna gener 13 protein-kodende gener (oxidativ fosforylering) 15 Satellit Gen Mini- og mikro- satellitter er af speciel interesse, da de varierer i antal blandt individer - disse DNAmarkører er derfor velegnede til koblingsstudier. De optræder i arvemassen i gennemsnit 1 pr. 2 kb og udgør ialt 3% af arvemassen.

16 VNTR-polymorfier Individ A Individ B Individ C Homologe kromosomer Detekteres vha.: Southern blot med probe der er komplementær til Tandem Repeat-sekvenserne eller PCR med primere der flankerer Tandem Repeatsekvensen Individ A B C 16