) DANMARK (11) DK 176987 Bi

) DANMARK (11) DK 176987 Bi dl> (12) PATE.NTSKRFT Patent- og Varemærkestyrelsen (5) Int.Ci. 8 : A 01 N 47/34 (200.8,01).4 61 K 31/17 (2006.01) (21) Patentansøgning nr: PA 2000 01822 (22) Indleveringsdag: 2.000-12-05 (24) Løbedag: 1999-05-31 (41) AH. tilgængelig: 2000-12-27 (45) Patentet rrieddelelae bk.g. den: 2010-09-21 (86) International ansøgning nr: PeTliB99/00988 (36) International indleveringsdag : 1999-05-31 (30) Pnontet: 1998-05-09 NO 19982550 (73) F'aterithaver: Pharrnaq AS, Skogmo Industriområde, N-7363 Overhalia, Norge (72) Opfinder: Svein Alexandersen, Seetaisensgate 50, N-4024 Stavanger, Norge øystein Etertsen, Maimovelen 346, N-0198 Oslo, Norge Christian Syvertsen, Nordlia :35, N-1900 Fetsund, Norge Bernt Martinsen, BMgveien 40, N-1385 Asker, Norge (74) Fuldmægtig: Plougmann & Vingloft AIS, Sr ndkrogsgade 9, 2100 Kobenhevn Ø, star mark (54) Benævnelse: Kontrol af parasitintestationer hos opdrættede og vi/de fisk (66) Fremdragne publikationer: (57) Sammendrag: Fremgangsmåde til kontrol af parasitinfestationer med iaitselus og i'scpoda-arter hos opdrættede fisk, r ltviiken fremgangsmåde ariti-parasitært aktive substanser forrnulers som et injicerbart præparat, eventuelt fiskevacolne, og hvor de antl-pit:, rasitæitt aktive substanser ligeledes beskytter fiskene mod parasitter E en betydelig tidsperiode efter injektion. Et præparat ti3 terapeutisk og protilaktisk kontrol af parasitter hos opdrættede fisk og vildfisk., hviiket præparat omfatter hexaflumoren, eller andre kitinsynteseinhibitorer. som den aktive substans, beskrives ligeiedes. Hexatiamorien kan administreres som en bad-bel:landing, oiait gennem foderet eller som særskilte injektioner. Præparatet har en terapeutisk virkning mod parasitter, som allerede findes på fiskene og bibringer beskyttelse mod nye parasitinfestationer i en lang periode efter behandling. fortsæt tes

?.{.mpum.1 -,-3q a9up.m.iwidspw.jiaddn.#d & ff>uft,laq ffi3 in2u

1 Opfindelsens område. Den foreliggende opfindelse angår præparater omfattende forbindelsen hexafiumuron tii kontrol af parasitinfestationer hos fisk, såsom opdrættede fisk, og mere ;pecifikt., præpara- 5 ter til behandling af ogleiler forebyggelse af infestationer med lak.selus og andre krebsfiskeparasitter, herunder injicerbare præparater til en sådan behandling ogieller forebyggelse. Opfindelsen angår desuden anvendelse af hexafiumuron fremstillingen af el præparat til behandling ogleller forebyggelse af prarasitinfestationer hos fisk. 10 TEKNISK BAGGRUND OG KENDT TEKNiK Parasitinfestationer udgør betydelige probierrier fiskeopdrætningserhver,;et og også vilde fisk. Dette angår især opdrættede fisk i ferskvand og havvand. Skader som følge af parasi- 15 tinfestationer resulterer i betydelige tab og øget arbejdsbyrde for fiskeopdrætterne. Infestation med lakselus (Lepeophthei,rus saimonis og Cafigus olongatus) anses for at være et af de væsentligste sygdomsprobierner opdræt af laksefisk, især hos atlantiske laks (Selmo Solar) og regnbueørred (Oncorhynchus mykiss). Ud over de omkostninger, som er forbundet med behandling, bidrager ringere klassifikationer af slagtet fisk og reduceret væ.kstha- 20 stigned som følge. af reduceret foderindtag til fiskeopdrætterens okonomiske tab. Ud over de skader, der forårsages hos opdrættede fisk, har nylig forskning vist, at lakselus kunne være den vigtigste enkelte årsag til svækkelse af adskillige stammer af vilde laks, Emigrationen af lakseyngel fra flodsystemerne falder hyppigt sammen med stigende hav- 25 vandstemperatur fjord- og kystområderne, hvilket forer til massivt angreb af copedoditter (lakseluslarver) på ynglen. Et angreb på 40 eller flere lakselus på lakseyn,gel er fatalt for fisk, der vejer under 25 gram, og i adskillige regioner i Norge er præmatur tilbagevenden af havørred efter yngelstadiet blevet observeret. Nedgangen i bestande ar laksefisk, som er blevet dokumenteret i adskiilige norskelaksefioder i de sidste få år, kunne være relate.,ret til 30 det faktum, at mængden af lakselus i forbindelse med fiskeppdræt bliver oget. Op til nu involverer den mest almindelige behandling af fiskeparasitter badebehandling eller neddypning af fiskene i behandlingsopløsning, som omfatter en antiparasitært aktiv forbindelse. Det angår både hud-mg gælleparasitter. Badebehandling i formalin er en ud- 35 bredt behandling mod mande parasitter, især i fe,rskvand, mens badebehandling organo-

2 fosfater (metriofonat, dichiorvos, azarnethiphos), pyrethroider (pyre.thrum, cypermethrin, deltametrin) eller hydrogeriperoxid er de mest almindelige badebehandlinger mod fx lakselus (Lepeophtheirus se/monis'. Galigus elongatus). Disse substanser virker direkte på paresitterne via vandet, og en mulig absorbtion af den aktive forbindelse.. ) seive fiskene er uden 5 betydning for virkningen af de aktive substanser på parasitten. Substanser til oral administration, som er effektive mod parasitinfestationer, lige/e- des blevet testet hos fisk. Substanser, såsom chitinsynteseinhibitorer, difiubenzuron og fluberizuron og ivermectin er eksempler på substanser, som, såfremt de administreres oralt, kan 10 være effektive mod parasitsygdornme hos fisk.. Ud over de ovennævnte subs,tanser har iæbefisk (l_abriclae) været anvendt ekstensivt til at hclide iakselusinfektioner under kontrol. Substanser til badebehandling af parasitaert infesterede fisk, såsom aflak.selusinfestatiorier, skal blandes i vandet, hvor fiskene normalt svømmer, Nogie af de substanser, som 15 anvendes, er VW1dopløselige (azarnethiphos), mens andre ikke er vandopløselige (cyperrnethrin, deltamethrin), og derfor forbliver den sidste gruppe af substanser som en suspension eller emulsion i vand, På fisk, som holdes tanke, kan badebehandllngen udføres ved at tilsætte substansformuleringerne direkte til tanken, hvor fisken holdes. Til behandling af fisk, som holdes i havbure, løftes bunden af buret manueit med henbiik på at reducere be- 20 handlingsvolumenet. En presenning anbringes omkring buret, således at fiskene indesluttet; fuidstamdigt, hvorefter behandlingssubstansen tilsættes til buret. Fiskene svømmer i opløsningen i 20-60 minutter, afhængig af behandlingssubstansen, Oxygen skal tilføres til buret, hvor fisken behandles. Behandling med en presenning uden bund, deri såkaldte skørt-behandling, anvendes ligeledes i betydeligt omfang. Da behandlingsvolumenet i så- 25 danne tilfælde ikke kan defineres nøjagtigt, er det nødvendigt at anvende en større mængde aktiv substans ved denne administr:-:itionsvej, end tilfældet er, når der anvendes en lukket presenning. Det bliver også mere almindeligt at udføre badebehandlinger dambåde. Organophosphater og hydrogenperoxid er kun virksomme mod før-voksen-og voksen- 30 stadierne af /akse- lus (de sidste tre stadier af i all, 8 stadier, som findes på laksefisks hud), mens pyrethroider ivermeetin også har en mere eller mindre veldefineret virkning mod de øvrige 5 stadier, Inden af disse substanser beskytter mod nye infestationer efter at behandlingen er blevet afsluttet.

3 Hydrogen er korrosivt, og skal derfor håndteres med stort omhu. Transport af hy- drogeriperoxid kræver visse sik.k.erhedsforanstaltninger, Ci3 dot i store mængder er defineret som farligt gods. Organophosphaterne er toksiske for mennesker og skal derfor be.- handles med forsigtighed, Organophosphaterne kan absorberes gennem huden og føre til 5 forgiftning. Den terapeutiske margin for orgariophg.:isphater og hydrogenperoxid er lille. Fiskernortalitet er blevet beskrevet ved adskiiiige iejligheder som følge af overdoseringer af sådanne lægemidler. Ud over deroo virkning på præ-voksne og voksne lakselus, har pyrethroider også en virk- 10 ning på de vedhæftede stadier. De er ikke akut toksiske for brugeren, men er en lægemiddelgrupoe, som er toksisk for fisk, især små fisk, Mulig overdosering og øget mortalitet er såiedes mulig. Alle de ovennævnte lægerniddelgrupper administreres via badebehandlinger. Dette er ar- 15 bejdskrævende og kan også udgøre en stressfaktor for fiskene. Ud over badehandlinder er orale behandlinger. med henblik på parasitkontrol hos fisk blevet udviklet. To chitinsynteseinhibitorer, diflubenzuron tefiubenzuron, er bievet dokumenteret til anvendelse mod lakselus mod laks. Den rnakrocykliske. lacton, ivermectin, anvendes 20 lige.ledes mod pm,anitterhoa skmefiaki Chile, irland og Skotland. Difluberizuron teflubenzuron, som tilhører den samme substansoruppe som hexaflurnuron, virker ved at inhibere produktionen af chitin, som er en vigtig del af insekters og krebsdyrs cutikula. Ved hvert hudskifte &ler ectdyse, kræves en ny syntese af chitin til udvikling. 25 Såfremt syntesen inhiberes, vil udviklingen insektet eller krebsdyret blive standet, og dyret under udvikling vil de. princippet vil chitinsynteseinhibitorer være effektive mod alle organismer, der indeholde chitin. Fisk og pattedyr indeholder ikke chitin og vil derfor ikke blive påvirket af substanser inden for denne lægerniddelgruppe. Dette afspejles i meget lav toksicitet for fisk og pattedyr, herunder mennesker, Difluberizuron og teflubenzuron admini-.. 30 streres til fiskene via foderet, absorberes og distribueres til huden og slimhinder, hvor koncentrationen vil være tilstræ.kkelig hej til at inhibere udviklingen af parasitten, Ulempen ved difiubenzuron og teflubenzuron er, at disse substanser ikke har nogen virkning mod voksenstadiet af parasitter, som ikke aktivt syntetiserer chitin. Ligeledes har de ikke nogen effekt ud over behandlingsperiode.n, da angreb af nye parasitter kan optræde inden for dage 35 efter afslutningen af behandlingen. Dette skyldes det faktum, at substanserne elimineres

4 relativt hurtigt, således at koncentrationen af substansen faider under terapeutisk niveau i huden og på siimhinder. Behandlingen må derfor gentages, såfremt der er en vedvarende risiko for parasitinfektion fra omgivelserne, hvilket under norrnaie omstændigheder ofte er tilfaeidet. iverrnectln hæmmer overføringen af neurale impulser hos insekter og krebsdyr. Dette fører til paralyse og død. Pattedyr og fisk påvirkes også af ivermectin, Den samme overføringsmekanisme, som påvirkes hos insekter, findes imidlertid kun hjernen hos fisk og pattedyr. Pattedyr har en avanceret blod-hjerne-barriere, som forhindrer toksisk virkning af lavere 10 koncentrationer, Blod-hjerne-barrieren hos fisk er mindre udvikiet, og dette bevirker en væsentlig overføring tii hjernen af ivermectin hos behandiede fisk, og toksiske symptomer findes ved relativt iave koncentrationer. lverrnectin er imidlertid effektiv til behandling af parasitter hos fisk, forudsat at der tages forholdsregler med hensyn til doseringen. Toksiske virkninger og mortalitet kan stige, såfremt fiskene overdoseres, ivermectin doseres ofte en 15 eller to gange om ugen for at kontrollere lakselusinfestationer hos 1.- ksefisk.. Dette betyder, at substansen må tilsættes kontinuerligt for at opretholde terapeutisk virkning og for. at holde fiskene rimeligt. fri for lus. Ivermectin elimineres langsomt, hvilket betyder at virkningen af behandlingen opretholdes i 2 ti! 3 uger efter at behandlingen er blevet afsluttet. Dette betyder imidlertid også, at behandlingen invoiverer en lang tibageholdelsesperiocle før fi- 20 skene kan slagtes og konsumeres, ivermectin er ikke bievet dokumenteret og godkendt til anvendelse til fisk i noget land. Tilstrækkelig dokumentation om tilbageholclelsesperioder, toksicitet for fisk og for marine omgivelser er derfor. ikke tilgængelige, Som det fremgår af den ovennævnte korte beskrivelse af. teknikkens stade, er der et indu- 25 stridt behov for forbedrede midler til kontrol med parasitinfestationer hos fisk, hviike midler er anti-parasitært effektive og non-toksiske for fiskene, og som kan administreres på en industrielt bekvem måde og som beskytter fiskene i en længere periode efter administration. En sådan forbedring, som tilvejebringes ved opfindelsen, er behandlingen af fisk med henblik på at kurere eller forebygge parasitinfestationer ved at administrere hexaflumuron 30 og administrationen af antiparasitær aktive substanser ved injektion. En sadan administrationsvej har ikke været anvendt tidligere, da det hidtil er blevet anset for at være arbejdsintensivt samt stressende for fiskene, og derfor uegnet.

KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN 5 I overensstemmelse hermed angår opfindelsen et første aspekt et præparat til behandling og/eller profylakse af parasitinfestationer hos fisk, hvilket præparat omfatter hexaflumuron. 5 I særiige udførelsesformer angår opfindelsen et injicerbart præparat tii simultant behandling og/eller profylakse af parasitinfestationer og infektiøse sygdomme hos fisk, hvilk.et præparat omfatter hexaflumuron og en immunologisk aktiv antigensubstans, som ved administration til fiskene bibringer beskyttelse mod mindst en virus- eller bakterie..rt. Ifblge 10 disse udførelsesformer er den immunologisk aktive antigensubstans valgt fra druppen bestående af et inaktiveret virus, et svækket virus, et fragment af et virus, levende bakteriecelær. svækkede bakterieceller, ikke-levedygtide bakterieceller og en bakteriecelle.bestanddel. 15 yderligere aspekter angår opfindelsen anvendelse af hexaflumuron I fremstillingen af et præparat til behandling og/eller forebyggelse af parasitinfestationer hos fisk, såsom lnfesta- :ioner med krebsdyr-parasitter, herunder lakseius og Isopoda-aiter I overensstemmelse med opfindelsen kan præparatet administreres til fiskene oralt, ved tilsætning til fiskenes habitat eller ved injektion. 20 opfindelsens kontekst omfatter fisk, hvor parasitinfestationer skal kontrolleres, iaksefiskearter. såsom atlantisk, laks (c3ain -io,s;:_der), regnbueørred (Oncorhynchirs rnykiss) og havørred (Salme truit9) havaborre (Dicentramhus fabrax). 25 DETALJERET BESKRIVELSE. AF OPFINDELSEN Et væsentligt formål med den foreiiggende opfindelse har været at finde substanser og præparater til behandlingen ogleiier forebyogelseri at infestationer hos fisk med parasitter, 30 især lakselus ; og som ikke er forbundet med de ulemper, som er forbundet med andre kendte substanser og som tillige beskytter behandlet fisk mod infektioner i et vist tidsrum efter at behandlingen er blevet afsluttet, Opfindelsen angår også anvendelsen af den chitinsynteseinhiberende forbindelse, he- 35 xaflumuron til fremstillingen af præparater til injektion til fisk, hvilke præparater er nyttige til

at behandle og beskytte mod parasitter, især lakselus: Særligt interessant er anvendelsen af nexafiumuron i blandinger. med vacoinebestanddele, til freinstiilingen af et præparat, som giver aktiv immunologisk beskytteise mod bakteriesygdomme og virussygdomme, og som bibringer profylaktisk beskyttelse mod parasitter, især lakselus. U denne sammenhæng 5 indehoider præparatet en eller flere immunologisk aktive anticensubstanser -Mat fra druppen bestående af et inaktiveret virus, et svækket virus, et fragment af et virus, levende bakterieceller, svækkede bakterieceller, ikke-levedygtige bakterieceller og en bakteriecellebestariddei. 10 kombinationen af vaccine- og profylaktisk behandiing i et produkt resulterer beskyttelse 15 mod bakteriesygdomme., virussygdomme oglelier parasitsygdomme, Et kombineret produkt som dette vil hverken forårsage yderligere stress for fiskene eller øget arbejdsbyrde for fi.- skeopdrætteren. da anvende/sen af injektlonsvacciner mod bakteriesygdornme og virus-._ sygdomme allerede er veletableret i fiskeopdrætningsindustrien, Injicerbare præparater ifølge oprindelsen kan formuleres som en opløsning, suspension eiler emulsion ar nexafiumuron, med eller uden vaccinebestanddele. Anvendelsen af inlicerbare præparater til at beriandie og beskytte fisk mod parasitinfesta- 20 tioner vil stor udstrækning eliminere de rniii/ømæssige problemer, der findes i dag, og som er associeret med anvendelsen af kemiske substanser til at kontrollere parasitproblemer hos fisk. Anvendelsen af injicerbare præparater kan give anledning til udslip til omgivelserne i form af sekretioner af den aktive substans fra injicerede fisk, Denne form for udsiip er imidlertid meget begrænset sammenlignet med udslippet fra foder, fæces fra oral behand- 2.5 ling og udslip direkte fra badeoplosninger efter badebehandlinder. Formelen ror nexaflumuron er: CONHCONH OCF2CHF2 30

7 1--lexaflumuron kan tilsættes til et præfabrikeret fiskefoder elie.r piller, eller det kan blandes med de øvrige bestanddele, i fiskefoder, før der fremstilles piller. Hexaflumuron kan ligeledes tilsættes som kapsler eller sammen med andre vehikler, som fisken æder, fx Akvaie.tter"r" (fiskefodertabletter). 5 Den aktive substans, hexaflumuron, kan ligeledes fremstilles som en formulering, som kan tilsættes direkte til det vand, hvor fisken svømmer. Formuleringen kan derefter være en opløsning at den aktive substans, en suspension, af den aktive substans, en emulsion, som indeholder den aktive substans, eller den aktive substans som en faststofforrridering (fx i 10 form af et pulver eller et granulat). Den aktive substans kan også formuleres til injektioner som et opløsnings-, suspensions- eller emulsionspræbarat af den aktive substans. Uanset hvordan hexafiurnuronpræparatet administreres, vil fisken absorbere den aktive substans, og terapeutisk koncentration af substansen vil blive opretholdt et vist tidsrum_ 15 Denne koncentration er tilstrækkeligt høj til at forebygge yderligere udvikling af parasitter og til at forhindre, at nye parasitter vedhæftes og udvikler sig en vis tid efter behandling, Besk.yttelsesperioden afhænger af formulering, administrationsvej og den hastighed, hvormed hexafiumuron udskilles fra fisken, Udskillelseshastigheden vil afhænge af fiskearten, vandtemperaturen og formuleringen af substansen, (især ti/ injektion), Forsøg med he- 20 xaflurriuron viser, at beskyttelsesperioden for såvel oral administration som badeadministration vil være mindst 8 uger, mens en emuisionsvaccine, SOM bærer af den aktive substans, vil give betydeligt længere beskyttelse, Den aktive form af hexaflumuron distribueres til alle væv og organer i målfiskene, herunder 25 slimhinder, hud, gæller og tarme. Parasitter, som påvirkes af hexafiumuron, og som er lokaliseret i væv med en antiparasitært effektiv koncentration, vil blive inhiberet i deres videre udvikling og dø, Mulig lokalisering af parasitter er hud, ga?..11er, tarme eller andre indre organer. 30 Hexaflurnuron inhiberer syntesen af ohitin hos insekter ogkrebsdyr og kan eventue_,it også påvirke andre parasitter, som er afhængige af deres egen syntese af chitin. Parasitter, som er afhængige af chitinsyntese for at udvikle sig, vil do inden for en bestemt periode efter indtagelse af hexaflumuro.n. krebsdyr vil ikke være i stand til at gennemgå hudskifte og vil derefter dø. Dette vil fx være tilfældet med lakse/us, som er afhængige af chitinsyntese 35 mellem hvert hudskifte. Voksenstadier, som ikke har en aktiv chitinsyntese, vil ikke blive

8 påvirket af hexaflumuron. IGyro&.,:ix(yius-arter kunne chitinsynte.sen af forreste elementer eventuelt biive undertrykt. Hexafik.Jmuron kan også indvirke på kvaliteten af æg fra hunlakselusen, således at disse klækkes unormalt eller udvikle.s unormalt med lanle.misdannelser og manglende evne til at gennemgå en normal udviklingscyklus. Det er meget overraskende, at hexakimuron, ud over at have en terapeutisk effekt, også beskytter fisk mod nye angreb af jtrvenile parasitter i en længere periode efter afslutning af behandlingen, Laksearter er beskyttet mod nye etableringe.r af lakse/us i en periode på mindst 8 uger ; såsom mindst 12 uger, herunder. mindst 6 måneder og endog op til 10 må- 10 riede.r efter overførelse til havvand. Det er stor modsætning til de nært beslægtede substanser : diflubenzuron teflubenzuron, som ikke beskytter mod nye angreb af lakselus (se eksemplerne 6 og 8). modsætning til andre behandiinger mod parasitter hos fisk, kan hexaflumuron administreres som en injektion (se eksemplerne 7, 8 og 10) og beskytte fiskene mod nye etableringer af lakselus. Dette er også en væsentlig forbedring relation til 15 nuværende behandiingsaltemativer og udgør en mulighed for at beskytte værdifulde fisk individuelt mod parasitinfestationer. Beskyttelsesperioden mindst 8 uger efter behandling er saerligt gunstig, da behovet for gentagne behandlinger vii blive reduceret væsentligt. Dette reducerer forurening med tera- 20 peutiske substanser i omgivelserne, og det er endvidere omkostnings- og arbejdsbesparende for fiskeopdrætteren. Såfremt opfindelsen anvendes til vilde fiskepopulationer, vil den også give beskyttelse til vildiakseyngel orredyngel, som emigrerer fra floder og flodsystemer til deres habitat i havvandet (se eksempel 3). 25 Der er ikke blevet påvist bivirkninger ved anvendelsen af hexaflumuron i nogen af de udførte forsøg, hverken ved injektion eller ved anvendelsen af hexaflumuron som en badeopløsning eller som oral behandling.. Dette angår alle de doseringer, som er blevet undersøgt, og de forskellige administrationsmåder, som er blevet anvendt. -30 Som nævnt ovenfor, er det et vigtigt formål med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde til at kontrollere infestationer hos fisk med parasitter, såsom parasitiske krebsd:yrarter, hvilken fremgangsmåde omfatter administration af hexafiumuron til fiskene ved injektion. Fremgangsmåden er fx nytting til kontrol af infestationer af lakselusarter, herunder Lepeophthefrus saimoni's Caligus elongatus og Isopoda-arter, herunder fx Ani- 35 locra physodes.

Opfindelsen vil nu blive forklaret i yderligere detaljer de følgende eksempler, som viser virkningen af forskeliige formuleringer tii injektion til opnåelse af profylaktisk beskyttelse mod parasitter hos fisk, samt virkningen af hexaflurnuron som effektiv terapeutisk og profy- 5 laktisk substanse mod parasitter hos opdrættede fisk og viidfisk, i følgende tegninger, hvor: Figur 1 opsummerer forsøget i eksempel 1, som blev udført med atlantiske laks (Salm salar). Den viser antallet af lakselus før og efter behandling med hexaflumuron sammenlid- 10 net med en ikke-behandlet kontrolgruppe, Behanffingsdoseringen var 9 mg hexaflumuron pr. kg fisk pr. dag i 10 dage. Dette er angivet som "GrupperlTidspurikter" i figuren: Figur 2 angår forsøget. i eksempel 2, som blev udført med atlantiske laks (Saf mo solar). Denviaer@nta ataf ehne uaførogeftarbohandun8rmcdhmxa0unnmmoncgouazuron i 15 sammenligning meden ikke-behandlet kontrolgruppe. Behandlingsdoseringen varierede mellem 3-9 mg hexaflumuron og 9-12 fluazuron pr. kg fisk pr. dag. Dette er angivet med "Grupperf Fidspunkter" i diagrammet. Forkortelsen "8 d.p. beh." betyder 8 dage efter behandling, og * angiver, at den aktive substans er blevet administreret som "Akvaletter" (fiskefodertabletter). 20 Figur 3 vedrører forsøget i eksempel 4, som blev udført med atiantiske laks (Salm saiar).. Den viser antallet af lakselus på forskellige tidspunkter efter oral behandling med hexaflumuron ferskvand for overføring til havet. De behandlede grupper sammenlignes med en ikke-behandiet kontroigruppe. Behandlingsdoseringen var 4 mg hexaflumuron pr. kg fisk 25 pr, dag i 5 dage. Dette angives ved "Grupper/Tidspunkter" figuren. Bur 2 = kontroiier, bur 4-6 = behandlede grupper, 16.6.97 =UdepunktforoverfmhngbU havvand og 5,8.974= kontroller behandlet med badning med deitamethrin; Figur 4 vedrører det i eksempel 5 beskrevne forsøg, som blev udført med havorred (Sairno 30 trult,'::i). Den viser antallet af lakselus på' forskellige tidspunkter efter oral behandling eller badebehandling med nexafiumuron ferskvand, for overføring til havvand. De behandlede grupper er sammeniignet med en ikke-behandlet kontrolgruppe. Doseringen til oral behandling var 4 mg hexaflurnuron pr. kg fisk 5 dage, og 5 ppm h..exaflurni.iron som en 30 minutters badebehandling. Dette er angivet ved "Grupperffidspunkter" i figuren. Bur 1.4 t. 35 kontroller, bur 1.3 oral behandling, bur 1.2 badebehandling. Tidspunkterne for de for-

10 skellige perioder er; 26.5,97 = overføring til havvand; 9,6.97 = kontroller behandlet med badning med deltametbrin efter tælling af lakselus; 26.6.97 -= kontroller behandlet med badning med deltarnethrin efter tælling af akselus, 16,7,97 = kontroller behandlet med badning med deltamethrin efter tælling af lakselus; 5 Figur 5 vedrører forsøget eksempel 6 og viser antallet af lakselus atlantlsk. laks (Saimo safari på tidspunkterne 1-4 efter oral behandling eller oral behandling med hexaflurnuron ferskvand før overføring til havvand. De behandlede grupper er sammenllgnet med en ikke-behand/et kontrolgruppe, og en gruppe, som er blevet behandlet oralt med nex:, -fflurnu- 10 ron (10 mg/kg teflubenzuron pr, kg fisk pr, dag i 7 dage). Doseringen for oral behandling var 5,6 mg hexafiumuron pr. kg fisk pr. dag i '7 dage, og 5 ppm nexafiumuron som 30 minuttr.,,.rs badebehandling. Figuren viser bur 1 = oral behandling, nexaflumuron, bur 2 = badebehandling, hexaflumuron, bur 3 = oral behandling, teflubenzuron, bur 4 kontroller, ikke behandlet. Afslutning på behandling: 22./0.97, overføring til havvand: 23.10.97. T1 =3 15 uger efter afslutning af behandling, T2 5 uger efter afslutning af behandling, T3 9 uger efter afslutning af behandling, T4 = /2 uger efter afslutning af behandling; Figur 6 vedrører forsøget i eksempei 7 på tldsounkterne 4-6 med de samme forsegsparametre som for figur 5. T5 = 15 uger efter afslutning af behandling, T6 = 17 uger efter afslut- 20 ning på behandling. Bur 3 og 4 blev behandlet med badning med deltamethrin efter lakselustaslling ved T4 (12.01.98); Figur 7 vedrører det i eksempel 7 beskrevne forsøg, hvor laks blev injiceret den 17.12.97 med to formuleringer (henholdsvis gruppe L og gruppe R) af he. xaflumuron og en vaccine- 25 formulering uden hexaflumuron (kontrol). Figuren viser det gennemsnitlige antal lakselus på følgende stadier, Chalimus Chalimus præ-voksen og voksen gennem forsøget. De vaccinerede fisk blev overført til havvand den 09-01-98, Figur 8 opsummerer forsøget i eksempel 8, hvor lakseyngel blev injiceret med 9 forskellige 30 aktive substanser den 08.07,98, Der er kun vist resultater for Moxidectin (Mox.), Lufenuron (Luf.) og hexaflumuron Apojectl-fural (Hex..Apo) og i animalsk olie (Hex,olle), og; Figur 9 opsummerer det i eksempel 10 beskrevne forsøg, hvor laks blev injiceret den 03.12.97 med tre forskeillge formuleringer af nexatlurnuron (Hexa 1, Hexa 2 og Hexa 3). 35 Fiskene blev overført til havvand ved 'TO.

11 EKSEMPEL 1 Ca. 800 atlantiske laks (Salinc., safar), som gennernsnitiigt jede800grom ` hlevholdtii to 5 forskellige bure med 400 fisk i hvert. Fiskene blev eksponeret for naturlig infektion, De brev kraftigt inficeret, og behandling med hexafiumuron blev påbegyndt i et af burene, mens fiskene det andet bur forbiev ubehandlet blev anvendt som negative kontroiler. be.- handlingsburet blev hexaflumuron administreret oralt, Substansen biev påført som en overtrækning på den ydre overflade af almindelige fiskepiller. Fiskene modtag således en dosis 10 på 9 mg hexafiumuron pr, kg hver dag i 10 dage via de medicinerede fiskepiller, som indeholdt 1.5 g hexafiurnuron pr. kg foder. Fiskene biev fodret med disse medicinerede piller, idet der blev fulgt normale fodringsprocedurer, hvorimod kontrolfiskene fik almindeligt fiskefoder fra T. Skretting (Nutreco). Vandternperaturen var 7,6-9,4 9C under forsødet. Figur 1 viser, at hexaflurnuronbehandlingen reducerede antallet at lus med mere end 90% 15 sammenlignet med kontrolgruppen, Reduktionen af følsomme Chaiirnus- og før-voksenstadier var ca. 95% EKSEMPEL 2 20 Ca. 600 atlantiske laks (Safino -salar), som gennemsnitligt vejede 1000 gram, blev holdt i et minibur. Fiskene blev eksponeret for natunig infektion. Før behandling blev initieret, havde fiskene været eksponeret for en omfattende lakselusinfektion med et gennemsnit på ca. 93 lus pr. fisk. Før behandling blev fiskene vilkårligt fordelt på 6 forskellige minibure med 100 fisk i livet. Fiskene i tre af disse bure blev behandlet med hexaflumuron, to med fluazuron 25 (en anden chitinsynteseinhibitor), og ét fungerede som negativ kontrol, DooerinDoni de forskellig bure er vist nedenstående tabel.

Tabel 1. Dosering i behandlings- og kontrolbure 12 Bur nr., gruppe nr, 1 100 2 100 H- 3 100 4 Antal fisk 100 100 6 100 Formulering Overtrukket foder Akvaletter Akvaletter Akv.aletter Overtrukket foder Substans 1 Dosis Antal pr. dag behandlingsdage He.xaflurnuron 9,0 mg 7 dage Hexaflumuron 3,0 mg 7 dage Kontrol Hexafiurnuron 9,0 mg 7 dage Fluazuron 12,0 mg 7 dage Fluazurori 9.0 mg 7 dage Alle burene blev behandlet på det samme tldspunkt. Fiskene kontrolburet fik almindeligt 5 fiskefoder fra EkVOS. Vandtemperature,ri var 8,0-9,8 C under forsøget. Flgur 2 viser, at hexaflurnuroribehandlingen reducerede antallet.af lus med mere end 70% sammenlignet med kontrolbehandlingen alle grupperne behandlet med hexaflumuron. Reduktlonen af følsomme Challmus- og før-voksen-stadier var over 90%. For grupperne, som fik den højeste dosenng, var reduktionen over 99%, Figur 2 viser også, at grupperne behandlet med fluezuron kun udvlste en reduktion på 25% sammenlignet med kontrolgruppen, EKSEMPEL 3 Ca. 2.000 vilde havørreder (Salm irvita) blev delt i to grupper og mærket med Carlin- 15 mærker i to forskellige farver (gul eller rød), således at enkeltindivider med lethed kunne skelnes fra hinanden, når de blev observeret i vandet. Gruppen med gule Carlin-mærker fik foder indeholdende hexaflumuro.n. Dosis var om. 3 mg hexeflumuron pr. fisk pr. dag i 6 dage. Fodringen blev gennemført den sidste uge før de blev overført til havet i begyndelsen af maj. Kontroigruppen havde røde Carlln-mærker og blev fodrel med almindeligt fiskefoder 20 lndtil overføring til havet. Begge gruppe af fisk blev overført til havet 200 meter fra flodmundingen af Bondhus-floden Hordaland i Norge. Fra overføring til havvand (8. maj) til 7. august blev omgivende floder og flodmundinger omkring dlsse floder undersøgt hver uge, idet anvendtes fiskning ved anvendelse af højspænding og netfiskning. Mærkede fisk blev Ikke fanget før 20. juni. Fra 20, juni til 7, august blev 22 k.ontrolfisk og 13 behandlede fisk 25 fanget. De ikke-behandiede fisk blev fanget i de nedre dele af floderne og var kraftigt infice-

13 ret med lak.selus. De 13 behandlede fisk blev udelukkende fanget i flodmundingerne omkring floderne (i havvand), ingen blev fanget i ferskvand. Ingen af de behandlede fisk viste tegn på lakselus. 5 Følgende gennemsnitlige længder og vægte b ev regit>treret for de fisk, som blev fanget perioden: Kontrolfisk: Gennemsnitsvægt 50,4±48,8 gram. Gennemsnitslærigde 19,7 ± 13,3 cm, 10 Behandlede fisk: Gennernsnitsvægt 87,1 69,6 gram. Gennernsnitslængde 35,9 ± -19,1. Resultaterne af dette forsøg viser, at hexafiumuron beskytter havørredyngel mod lakselusinfektioner i en periode efter overføring til havvand, en periode, hvor ynglen er meget såbar for lakselusinfektioner, Fravær af lakse/us i den hexafiumuronbehandlede gruppe er 15 den eneste logiske forklaring på den øgede vækst i denne gruppe sammenlignet med den ikke-behandlede kontrolgruppe, EKSEMPEL 4 20 Ca. 2.500 laks (Salm s&ar) med en gennemsnitsvæøt på 42 gram blev behandlet oralt med en daglig dosering på 4 mg hexaflumuron pr, kg fisk i 5 dage. Behandlingen blev ud-. fort ferskvand en ude før fiskene blev overført til havvand. havvandet blev fiskene fordelt i tre forskellige minibure med 800-850 fisk i hvert. På samme tid blev 1.000 ikkebehandlede fisk (fra en anden fiskefarm), som vejede gennemsnitligt 50 gram, overført til 25 havet i et nærved liggende bur, Efter at være overført til havvand blev fiskene eksponeret for naturlig lakselusinfektion. Antallet af lus på 10 fisk fra hver: bur blev talt hver 3. uge for at tjekke, om der var nogen forskel i antal af lus i burene, Ved afslutningen af forsøget, c..a. 12 uger efter at fiskene var blevet overført til havet, blev fiskene hver:. bur vejet for at undersøge mulige forskelle med hensyn til vækst (SGR, specifik væksthastidhed). Vandtern- 30 peraturen varierede mellem 10 og 16."C under forsøget. Figur 3 viser det gennemsnitlige antal lus i hvert bur under undersøgelsen. Figuren viser også, at behandlede fisk 3 og 6 uder. efter, at fiskene var blevet overført til havet (tidspunkt 1 og 2) havde et væsentligt lavere antal lus, som var større end Chalimus 11, Fra 9 uger og derefter var den ingen forskel mellem grupperne. Den dosering, som blev anvendt dette forsøg, dvs. 4 mg hexafiumuron 35 pr, kg fisk. pr, dag, er meget lav, Ved at øge doseringen vil beskyttelsesperioden sandsyn-

14 ligvls forlænges. 7 uger inde i forsøget blev kontrolfiskene behandlet med en badehandling indeholdende deltarnethrin for at reducere antallet af præ-voksen-kis. Denne behandling lykkedes ; og antallet af lus blev reduceret til et niveau, som var lavere end eller lig med de grupper., som var blevet behandlet oralt for overføring tl havet. Det var ikke nødvendigt at 5 administrere em badebehandling i burene med oralt behandlede fisk på dette tidspunkt.,3p.g'en blev målt efter ca. 12 uger og blev estimeret til 1,79% kontrolgruppen, og 1,95-2,00% de behandlede grupper. Eftersom kontrolfiskene og de behandlede fisk var af forskeaige. oprindelser, kan man ikke 10 konkludere, at denne forskel skyldtes færre lus behandlede grupper, Det er imidlertid muligt, at et mindre antal lus forårsagede den bedre væksthastighed. Forsøget viste, at heixaflumuronbehandlingen beskyttede fiskene mod lakselusinfestatiori i 6-9 uger efter de var blevet overført til havet. dette forsøg var der ikke behov for badehandling de oralt behandlede grupper i de første 9 uger, hvorimod kontrolgruppen måtte beh@nd eaengang i 15 den samme tidsperiode. EKSEMPEL. 5 Ca. 300 havørreder (Salme; trutta) med en gennemsnitsvægt på 150 aram blev delt tre 20 grupper på hver 100 fisk. Hver gruppe fik oral behandling i én uge før de blev overført til havet med en daglig dosering på 4 mg hexafkimuron pr. kofisk i 5 dage, Den anden gruppe blev behandlet med en badeberiandllng under anvendelse af en dosering på 5 ppm hexafiumuron 30 minutter med en formulering indeholdende 10% hexafiumuron, mens den sidste gruppe forblev ikke-behandlet. Elehandlinge.rne. blev udført i ferskvand i den sidste 25 uge før fiskene blev overført til havvand. I havvandet blev fiskene fordelt i tre minibure med.100 fisk hver. Fiskene blev derefter. eksponeret for naturlig lakselusinfektion_ Lus fra 6-10 fisk fra hvert bur blev talt hver 3. uge for at vurdere, om der var nogen forskel i antallet af lus i burene. Ved afslutningen af forsøget, dvs. 13 uger efter at fiskene var blevet overført til havet, blev fiskene i hvert bur vejet for at undersøge mulige forskelle i SGR. Vandtempe- 30 returen varierede inden for intervallet 12-22"C under forsøget. Figur 4 viser det gennemsnitlige antal kis i hvert bur undersøgelsesperioden. Figuren viser, at behandlede fisk havde et signifikant lavere antal lus større end Chelimus il ved henholdsvis 2, 5 og 8 uger efter overføring til havet etldspunkterne 1, 2 og 3).

Efter 11 uger var der ingen forskel mellem grupperne, men antallet af kis var meget lavt i a/le grupper > hvilket gør det vanskeligt at bestemme længden beskyttelsesperioden. Do-. seringen som blev anvendt i dette forsøg, dvs, 4 mg hexafiumuron pr. kg fisk pr, dag, er meget lav. En forøgelse af doseringen vll sandsynligvis forøge bttskyttelsestide.ri. Kontrolfi-- 5 skene måtte behandles 2 > 5 og 8 uger efter at de var blevet overført. til havet på grund af det høje antal lus (26-34). En badebehandling indeholdende deltamethrin anvendtes til be-. handlingen. Behandlingen lykkedes, og antallet af lus blev reduceret t:: et lavt niveau, Det var ikke nødvendigt at administrere en badebehandling til burene, som tidligere var blevet behandlet med hexaflumuron. SGR blev bestemt efter ca. 13 uger. Den blev bestemt til at 10 være 0,37% i kontrolgruppen oo 0,84-0,98% de behandlede grupper, Lid over et højt antal lus i kontro:gruppen var lav SGR. forårsaget af meget høje temperaturer og problemer med fiskemodning samtlige grupper, Forskellen i væksthastighed mellem kontroidruppen og de behandlede grupper var statistisk signifikant. 15 Forsøget viser, at hexaflumuronbehandlingen beskyttede fiskene mindst 8 uger efter de var blevet overført til havet. i dette forsøg var der ikke behov for badebehandling af de he.- xaflurriuronbehandlede grupper i 13 uger, hvor forsøget var i gang, mens kontrolgruppen måtte behandles tre gange i samme periode.. 20 EKSEMPEL. Ca. 400 atlantiske iaks (Salm() salat) med en gennernsnitswegt på 80 gram blev delt fire grupper på hver 100 fisk. Hver gruppe fik en oral behandling med 5.6 mg hexaflumuron pr. kg fisk pr. dag i 7 dage før overføring til havet. Gruppe to fik en badebehandling med en 25 dosering på 5 ppm 'mg/l) hexaflumuron i 30 mlnutter med en formulering indeholdende 10% hexaflumuron. Gruppe tre fik oral behandling med en daglig dosering på 10 mg teflubenzuron pr, kg fisk i 7 dage, mens den sidste gruppe forblev ubehandlet. Alle behandlinger blev udført i ferskvand i den sidste uge før fiskene blev overført til havvand. havvand blev fiskene fordelt i 4 forskellige minibure med 100 fisk i hvert bur. Flskene blev derefter 30 eksponeret for naturlig la.kselusinfestation, Hver. 3. uge blev lus fra 3 fisk hvert bur talt for at vurdere, om der var en forskel i antallet af lus mellem burene. Forsøget blev afsluttet ca. 17 uger efter at fiskene var blevet overført til navet, Vandtemperaturen varlerede mellem 4,5 og 10,5''C under forsøget.

16 Figurerne 5 og 6 viser det gennemsnitlige antal lus i hvert bur under forsøget, Figurerne viser, at fiskene, der blev behandlet med hexaflurnuron, havde et væsentligt lavere antal lus, som var større end Chalimus ved 5, 8 og 11 uger (tidspunkterne 2, 3 og 4), Gruppen behandlet med teflubenzuron havde det samme antal lus som den ubehandlede kontrol- 5 gruppe ved hver vurdering, hvilket viser, at teflubenzuron ikke har den samme beskyttende virkning som hexaflumuron. Efter registrering af lus ved. 1-4 (11 uger efter behandling) var blevet afsluttet, blev kontrolgruppen og den teflubenzuron'oehandlede behandlet med en badebehandling indeholdende deltamethrin for at kontrollere lakselusinfektion, Behandlingen lykkedes, og antallet af lus blev reduceret til at lavt niveau også i disse grupper, Be- 1 0 slutningen om at behandle to bure (kontr)l, teflubenzuron) blev taget samråd med fiskeopdnk..-ttereri, og fisk (ikke-behandlede) i kommercielle bure i farmen blev behandlet på samme tidspunkt, 15 og /7 (tidspunkterne 5 og 6) efter at fiskene var blevet overført til havet, var den ingen forskel mellem grupperne. Antallet af lus var medet lavt i alle grupperne på disse tidspunkter (lngen nye angreb), hvilket gør det vanskeligt at bestemme den nøjag- 15 tige beskyttelsesperiode, Fiskene var imidlei -tid beskyttet i mindst 11 uger, To dage efter oral behandling var blevet afsluttet og på tidspunktet 3 (65,dage efter afsluttet medicinering) blev muskel-lhudvæv fra 5 fisk i gruppe 1 analyseret kemisk for at undersøge konbentratione,n af hexaflun -iuron. Den gennemsnitlige koncentration af hexaflumurc.m 20 2 dage efter afsluttet medicinering var 4,4 fj-8/g væv, 65 dage efter var det gennemsnitlige koncentrationsniveau 1.2.ug/g væv, EKSEMPEL 7 25 Ca. 80 laks (Saimo salat-) med en gerinernsnitsvægt på ca. 80 gram blev delt i to grupper og injiceret med to forskellige formuleringer af hexaflumuron med en dosering på ca. 50 mg/kg. Begge formuleringer blev fremstillet på basis af en vaccine mod furunculose, som indeholder inaktiverede celler af Aeromonas salmonicide subsp. saimonigicla. Hexa..flunnuron blev blandetiformuleret vaccinen på to forskellige måder for at undersøge virkningen 30 af formuleringen på depotvirkningen i fiskene og på stabilitetsegenskaberne fra vaccineemulsionerne. Fiskene blev doseret (injiceret) mens de var i ferskvand og 23 dage efter administrationen blev de overført til havvand (minibure). Parallelt med de to grupper blev en tredje gruppe, 35 som omfattede 40 fisk af samme oprindelse og størrelse, vaccineret med en konventionel

17 vaccine uden hexaflurriuron. Denne gruppe blev holdt i den samme tank (ferskvand) og det samme bur (havvand) som de "hexaflurnuron-injiderede" grupper og tjente som negativ kontrollreferencegruppe med hensyn til lakselusinfestationer. For påbegyndelsen af forsøge: biev grupperne mærket ved indsnit i finnerne. Vandternperaturen varierede mellem 3,8 5 og 16,0'e under forsøget. Figur 7 viser det gent antal lus hver gruppe under forsøget. Der blev ikke fundet lak.seius fisk.erie i dette forsøg indtil tidspunkt 7 (T), dvs. 18 uger efter overføring til havvand. Et gennemsnit på 0,6 fømoksen-lus på fiskene blev registreret i kontrolgrupperi. 10 og antaiiet af lakse.lus øgedes progressivt under forsøget i denne gruppe. Ingen iakselus blev registreret for de to behandlede grupper indtil T10., dvs. 31 uger efter overføring :il havvand. På dette tidspunkt fandtes lakselus på fiskene i hexaflumurongrupperne, men der var konstant signifikant færre lakselus i disse grupper sammenlignet med kontrolgruppen. Det gennemsnitlige antai lus var henholdsvis 4,8 og 1,6 i de behandlede grupper, hvorimod 15 kontrolgruppen havde 19,2 lakselus. Ved henholdsvis T11 og T/2 var der forsat forskelle antallet af lakselus mellem de behandlede grupper og kontrolgruppen. SOM følge af det højre antal af lak.se.11,is kontrolgruppen ved.1-12 blev alle grupperne behandlet. med badebe.handlingspræpara(et ALPHA MAX. (deltarnethrin). Dette resulterede ien nedgang i antallet af lakseius i samtlige grupper ved T13. På dette tidspunkt var der forsat væsentligt fær- 20 re lus de behandlede grupper sammenlignet med kontrolgruppen, Alle fiskene blev behandlet en gang mere med ALPHA MAX (deltarnethrin) efter tællinger af lakselus ved T13. Efter denne behandling blev der ikke fundet lakselusinfestationer nogle af grupperne, nvi - kat mest sandsynligt skyidtes de lavere havvandstemperaturer og det forekommende lavere infe.stationstryk. 25 Vævsprøver (muskler med hud) til kemisk analyse blev udtaget fra tre fisk ved hvert prøvetidspunkt under hele forsøgsperioden med henblik på at rrionitorere koncentrationerne af hexafluinuron, Ved overføring til havvand var muskelihudkoncentrationerne mellem 2 og 3 hexaflumuron pr. gram væv. Yderligere analyser viste en langsom afgivelse af hexaflu- 30 muren. Ved T, dvs. 34 uger efter vaccination, varierede koncentrationen af hexaflumuron mellem 0,49 og 0,53 pr. gram væv, Ved TI 3, dvs, 49 uger efter injektion (46 uger efter overføreise tii havvand) var rnuskellhudkoncentrationen af hexaflumuron de to grupper henhoidsvis 0,13 og 0,11 ggig væv. På samme tidspunkt var forskellige stadier af lakselus blevet etableret på disse fisk. Dette indikerer, at koncentrationen af hexaflumuron var for.

18 lav ti/ at udøve en fuld virkning mod lakselus, men der var fortsat en vis virkning sammenligne.t med kontrolgruppen. Baseret på sammenligninger mellem dette eksperiment og eksperimenter, hvor hexaflumu- 5 ron administreres via oral behandling eller efter badebehandling (se de tidligere forsøg), observeres det. at beskyttelsesperioden forlænges væsentligt ved injektion. 1 dette forsøg observerede vi udmærket beskyttelse mod lakseiusinfestation 7 måneder efter overføring til.havvand og en delvist beskyttende virkning op til 10,5 måneder efter overføring til havvand. I dette forsøg var der rinde forskel i vævskoncentrationer hexafiumuron rrie/lem de 10 to forskellige vacoineformuleringer. EKSEMPEL 8 I dette forsøg blev 9 forskellige aktive substanser testet for beskyttende virkning mcd lak- 15 selus. 1200 lakseyngel blev, før påbegyndelsen af forsøøet, vaccineret med en kommerciel vaccine, ALPHA JECT 5100. Denne vaccine indeholder ikke aktive substanser, som bibringer beskyttelse mod lakselus. En uge efter overføring til havvand blev laksen delt i 12 grupper og injiceret med forskellige 20 formuleringer af de 9 forskellige aktive substanser. Parallelt med de 12 grupper blev en 13, gruppe, som omfattede 50 fisk af samme oprindelse og størrelse, injiceret med en saltvands (PB8)-opløsning uden aktiv substans. Denne gruppe tjente som negativ kontrol/referencegruppe med hensyn til iskselusinfestationer. Grupperne blev mærket ved indsnit i finnerne og fordelt vilkårligt i 3 bure. 25 De aktive substanser, som blev anvendt som injektion, var henholdsvis hexaflumuron, buprofezin, diflubenzuron, fluazuron, iufenuron, iverrnectin, doramectin, rnoxidectin og milbernycinoxim. Samtlige fisk biev injiceret med 0,2 ml af de forskellige injektionsformuleringer, Hexaflurnuron, buprofezin, fluazuron, lufenuron og diflubenzuron blev administreret 30 med en dosering på 50 mg/kg, hvorimod ivermectin, dorameetin og rnoxidectin blev administreret en dosering på 0,2 mgikg (anbefalet dosering til pattedyr), r,ailbemycinoxim blev administreret i en dosering på 0,5 mg/kg (anbefalet dosering ti: pattedyr) Alle substanserne blev administreret som en formulering, der var fremstillet på basis at en vaccine mod furunculose (Apoject 1-Fural), som omfatter inaktiverede bakterier. af Aerornonas saimoni- 35 cida subsp, s;.,,ilmonicida. Endvidere ne,xaflurnuron iverinectin administreret i formule-

19 ring freinstillet på basis af en animalsk olie (uden bakterieb.estanddel) og nexaflurnuron blev endvidere i vandig suspension (PBS). I alt omfattede forsøget 13 forskellige grupper, herunder en kontrolgruppe, 3 grupper injiceret med forskellig formuleringer af hexaflun-iurion (Apojectl-Fural ; animalsk olie, PBS), to grupper injiceret med forskellige for- 5 muleringer ivermectin (Apoject 1-Fural, animalsk olie), og de øvrige substanser blev administreret en formulering baseret på Apoject 1-Fural. Der blev ikke fundet toksiske bivirkninger i nogen af de injicerede grupper. Laksekis på fiskene blev registreret ca. hver 3. til 4, uge. Figur 8 viser det gennemsnitlige 10 antal lus nogle grupper under forsøget. Ved T2, dvs. uger efter injektion, udviste kun de grupper, der var injiceret med nexaflumuron, luferiuron eller moxidectin beskytte:se mod lakselus, Ved T3, dvs. 10 uger efter injektion, var kun fisk, der var blevet injicer:-.,..t med hexafiumuron formuleret Apoject 1-Fure/ eller animalsk die ; og fisk injiceret med lufenuron (Apoject 1-Fura8 beskyttet mod lakselus. gennemsnit havde kontrolgruppen 5,6 lus ved 15 T3, hvorimod de for hexaflumuron (Apoject), hexaflumuron (animalsk olie) og lufentiron (Apoject) var henholdsvis gennemsnitligt 0: 0,8 og 0,6 lus på samme tidspunkt. Fisk injiceret med lufenuro.n udviste god beskyttelse mod lus indtil T5, dvs. 18 uger efter injektion. Hexaflumuron formuleret i Apoject 1-Fural eller anirriaisk olie bibragte væsentlig 20 beskyttelse mod lakselus indtil og inklusive T10, dvs. 9 meneder efter injektion. Vævsprøver (muskel/hud) til kemisk analy.se blev udtaget fra 5 fisk injiceret med de forskelhexaflurnuronformuieringer på hvert prøvetidspunkt under forsøget. Fisk injiceret med hwaflumuron i en vandig suspension (PBS) udviste en meget hurtig udskilielse af aktiv 25 substans og ved T3 var nexaflurnuronkoncentrationerne under 0,02 Disse lave koncentrationer korrelerer godt med paralielle registreringer af lakselus, som viste., at der var nogen beskyttelse mod iakselus ved T3. Ved overføring til havvand varierede rn.uskel- Ihudkoncentrationerne i de to øvrige nexaflumurongrupper (Apoject 1-Fural, animalsk olie) mellem 1 og 2,5 jag hexafiumuronlg væv. Yderligere analyser udviste en langsom udskillel- 30 se af hexaflurriuron, dys, henholdsvis 0 ;26 og 0.27 j.tgig væv i dmto grupper ved TO (31 uger efter )njektion). Ved T8 var antallet af lakselus fortsat væsentligt lavere i de to hexaflumuron-injicerede grupper (Apoject 1-Fural, animalsk olie) sammenlignet med kontrolgruppen.

20 1 dette forsøg er en profylaktisk virkning mod lakseius i op til 10 måneder blevet demonstreret to grupper af fisk injiceret med hexaflumuron. Det er figeiedes blevet vist, at injektion 5 med andre aktive substanser er i stand til at bibringe cd be.skyttelse for en længere tidsperiode efter injektion, I dette forsøg er dette vist forlufenuron og moxidectin. EKSEMPEL 9 1 dette forsøg blev hexaflumuron administreret oralt med henblik på at teste virkningen mod infestationer med den parasitiske Isopoda-art Anilocra physodes hos havaborre (Dicentrar- 10 ehus labreix). 150.000 havaborrer (Dicentrarchus labrax) med en gerinemsnitsvægt på 2 gram blev overført fra et udkleakningsaniæg og fordelt i 5 bure hver indehoidende 30.000 fisk. Forsødet blev udfon spisefiskanlæg i Middelhavet, hvor havvandsternperaturen varierede mellem 15 15,0-25,0 C forsøgsperioden, Fisk i fire bure blev fodret med medicineret foder i en mængde svarende til 0,5% at den totale biomasse pr. dag i 6 dage, svarende til 10 mg hexaflumuron/kg fisk pr. dag. En uge efter medicineringen og efterfølgende hver 3, uge blev antallet af parasitter på fiskene mo- 20 nitoreret. Registreringerne af parasitter viste, at der var et meget lavt infestationstryk i anlægget od meget lave antal parasiter kontrolgruppen, I en uge efter afslutningen af medicineringspenoden fandtes ingen parasitter i de behandlede grupper, hvorimod der blev fundet i gen- 25 nemsnit 0,1 lus kontrolgruppen, Tre uger efter medioineringsperloden fandtes i gennemsnit 0,15 lus i de behandlede grupper, hvorimod kontrolgruppeme havde et gennemsnit på 0,4 lus. Parasitregistreringerne viste således en virkning af nexaflumurr.)n mod Anilocr;-:i physodes i 30 en periode på ca. 3 uger efter medicinerind. infestationstrykket for den resterende del af forsøgsperioden (3 måneder) var meget lavt, hvilket resulterede i, at der ikke kunne påvise signifikante forskelle med hensyn til parasitter mellem de behandlede, grupper og kontrolgruppen ved de øvrige prøvetidspunkter. Ifølge deraf kunne længden af beskyttelsesperioden ikke bestemmes med sikkerhed, 35

21 EKSEMPEL 10 Ca. 600 laks (Salm() salar), som i gennemsnit vejede 100 gram, blev delt i fire grupper, hver på 150 fisk. Grupperne 1-3 Uev iniiceret med 3 forskellige formuleringer omfattende 5 25 mg hexaflurriuron pr. ml. vaccine. Samtlige, formuleringer blev fremstillet på basis af en vaccine mod furunculose, vibriose, koldtvandsvibriose vintersår, hvilken vaccine omfat-. tede inaktivered.e Aerornon;-:is supsb. sairnonicida-,. Vibrio inguiffarurn.-, Vibric salmorticida- og Vibrio viscous-bakterier. Hexaflumuron blev blandetiformuleret i vaccinen på tre forskellige, måder med henblik på at teste virkningen af rormuleringen depotvirk- 10 ningen i fiskene og på stabilitetsegenskaberne for vaccineemulsioneme. Gruppe 4 blev injiceret med en formulering, som ikke indeholdt hexaflumuron, som således tjente som en negativ kontrol med hensyn til følsomhect for lakselus. Fiskene blev injiceret mens de blev holdt i ferskvand, og de blev overført til havvand (rninibure) 5 uger efter administration, 15 Efter overforing til havvand blev fiskene eksponeret for natunig lakselusinfestation. Hver 3. uge blev lus talt på 10 fisk i hver gruppe for at vurdere, om antallet af ;us mellem de for skellige grupper afveg. Forsøget blev afsluttet ca. 18 uger efter overforing til havvand. Vandtemperaturen varierede mellem 3 og 8 C under forsøget. Figur 9 viser det gennemsnitlige antal lakselus i hver gruppe under forsøget, TI og T3 er ikke vist figuren, da /akse- 20 lus ikke blev påvist på disse tidspunkter. Figuren viser, t3t fisk behandlet med hexarlun'euron havde et væsentligt lavere antal iakselus ved 9 og 12 uger efter overføring til havvand (T3 og T4). Efter afslutning af registrering af lakselus ved 12 uger efter overforing til havvand, blev fiskene i samtlide grupper afluset under anvendelse af bactebehandlingspræparatet ALPHA MAS (deltamethrin). Kun fiskene kontrolgruppen havde behov for aflusning, 25 men da alle grupper blev holdt i samme bur, blev alle grupper udsat for badebe.handlingerne. Behandlingen lykkedes, og ved tællingen ved 15 uger efter aflusning, fandtes lakselus ikke i nogen af grupperne. Baseret på de figur 9 viste resultater. kan det således konkluderes med sikkerhed, at he- 30 xaflumuron dette forsøg beskyttede fiskene mod tibaoevendende infestation i mindst 12 uger efter overføring til havvand (18 uger efter injektion), Det er muligt, at beskyttelsen vil være længere, men da forsøget blev afsluttet efter 18 uger uden ny iskseiusinfestation kontrolgruppen, tillader dette forsøg ikke direkte den konklusion, at beskyttelsen kan forlænges ud over 12 uger efter overføring af fiskene til havvand. 35

22 PATENTKRAV 5 1, Præparat til behandling ogleller profylakse af parasitinfestationer hos fisk, hvilket præparat omfatter hexaflumuron. 2. Præparat ifølge krav 1, som er et badebehandiingspreeparat. 3. Præparat ifølge krav 1, som er et fiskefoderpræparat. 10 4. Præparat ifølge krav 1, som er et injicerbart præparat, 5, Præparat :følge krav 4 til simultant ben:,-kndlirsg ogieller profylakse af parasitinfestationer og infektiøse sygdomme hos fisk, hvilket præparat omfatter hexafiumuron og en immunologisk aktiv antigensubstans, som ved administration til fisk.ene bibringer beskyttelse mod 15 mindst én virus.- eller t-.,akterieart, og hvor den immunologisk aktive antigensubstans er valgt fra gruppen bestående af et inaktiveret virus, et svækket virus, et fragment af et virus, levende bakterieceller, svækkede bakterieceller, ikke-levedygtige bakteriebeller og en bakterieceilebestanddel. 20 6. Præparat ifølge krav 5, hvor fiskene er opdrættet fisk. 7. Præparat ifølge krav 6, hvor fiskene er vaigt fra gruppen bestående af enl;rksefiskeart, 25 herunder ;-atlantisk laks (Sairno salar), regnbueørred (Oncorhynchu, mykiss) og havørred (Sa/mo triftta) havaborre (Dicentrarchus iabrax), 8, Præparat ifølge krav 5, som bibringer fiskene beskyttelse mod infestation med en parasitær krebsdyrart. 9. Præparat ifølge krav 8, hvor krebsdyranen hører til lakselusarter, herunder Le- 30,c'ephtheirus salmonis og Caligus elon,gatus. 10. Præparat følge krav 8, hvor kre.bsdyrarten er en isopoda-art, herunder Anilocra physodes.

23 11. Præparat ifølge krav 5, som bibringer fisken bee.;kyttelse mod parasitinfestation i pe-. riode på mindst 12 uger efter administration at præoaratet. 12. A.nvendeise nexaflurnuron i fremstillingen af et præparat til behandling ogieller fore- 5 byggelse af parasitinf.estationer hos fisk. 13, Anvendeise iføige krav 12, hvor præparatet er til oral administration af hexaflurnuron., 14, Anvendelse ifølge krav 13, hvor præparatet er til administration af hexaflumuron via 10 fiskefoder. 15. Anvendelse ifølge krav 12, hvor præparatet er til administration af he,xafiurnuron fil fiskene ved tilsætning af en effektiv mængde af hey,aflumoron til fiskenes habitat. 15 16. Anvendelse ifølge krav 12, hvor præparatet er til administration af hexafiumuron tii fiskene ved injektion. 17. Anvendelse ifølge et hvilket som helst af kravene 12-16, hvor fiskene er opdrættet fisk. 20 18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor fiskene er valgt fra gruppen bestående fra en lakseflskeai -t, herunder atlantisk laks (Salm sa/at), regnbueørred (Oneorhyrichus mykiss) og havørred (Salme, Irtiff.a) havaborre (Dicentrarchus.labrax). 25 19. Anvendelse ifølge krav 12, hvor intestationen er med en parasitisk krebsdyrart. 20. Anvendelse ifølge krav 19, hvor krebsdyrarten hører til lakselusarter, herunder Lepeophtheius S3iM0(1/5 Cafigus eiongatus. 21. Anvendelse ifølge krav 19, hvor krebsdyrarten er en isopoda-art, herunder Anilocre 30 physodes. 22. Anvendelse ifølge krav 12, hvor præparatet bibringer fiskene beskyttelse mod parasitintestation en periode på mindst 12 uger efter administration.

Figur I. Chalimus 90 80-70 - 60 - T.J = 50 40 -- n, 30 -- T5 20 < i0 0 ijijjjiiijjjj E ffl C.3 0 Chalim us In-IV Før voksen Voksen hun Voksen han 111 1.1.11:1L Hexafiu muron cc Før behaaming Grupper/tidspunkter 7 dage efter behandling 1-9 L269LL >K3

Antal laksdus pr fisk C N.21 4t2. Cf) *Cf 0 C C C C C Alle grupper '11111111111111 3 Q, c<4 Kontrol :111111111111IIIIIWA 3 a3i'd ø 9 mg Hexa pr. dag 9 mg Hexa pr, dag : rø 3 mg liexa pr. dag 12 mg fluazuron pr, dag 9 mg fluazuron pr. dag 6/ 1-9 L869LI.

Antal laksis pr. fisk Alle bure 0 s37 sr < rd CD 0 3 = ) Bur 2 Kontrol!lim= Bur 4 oral Bur 5 oral Bur 6 oral Bur 2 Kontrol illilh111111111111111fflinilllillilinillinlinilln.~ Bur 4 oral Bur 5 oral 11Ø: Bur 6 oral Wk,'- Bur 2 Kontrol Bur. 4 oral Bur 5 oral 111111111ffileliffilliffilliin r~ Bur G or& _11H1111111111111111111111/11111111111~ 6/E 49 L869 L4

Antal lakselus pr. fisk }-1 W til 0 U ti 0 ;...(1 til Bur 1,4 Kontrol 11111111i11111111111 111~"," V.) Bur 1,3 oral Bur 1,2 bad.., Bur 1,4 Kontrol Nl ni Bur 1,3 oral ty, CM 5n ko Bur 1,2 bad c (a.) Bur 1,4 Kontrol Bur 1,3 r); -. 1 Bur 1,2 had Bur 1,4 Kontrol Bur 1,3 oral Bur 1,2 bad (71 Bur 1,4 Kontrol - rta' Bur 1,3 oral << n c, 's. 7 a; r.; 5-r3 4-13 < et) 0 3 i 3 = Bur 1,2 bad 6/i' 1-9 L869L )G

5/9 11111111M 111111~11MIK rim111111 1 1 1 1:.::: Jrlig rv rn Q,3 2.12 4"+ 'mg 1 Jng J ng 9-4 CO 111111 z 'ng IIII uo r, st rdr Isg>.ad snlawiel gluv

8 7 Figur Calgus Copepodftt Cha ifrnus Chaffimus 111-1V ffi Før voksen 2 Voksen hun `"._; Voksen han. I T5 (02_02) Bure/tidspunkter 49 L869 L4 )U3

: Total antal af lakselus pr fisk 0,./1 0 ui vi b b 0 b b 0 N.; N2 w Kontrol Gruppe " Gruppe Kontrol Gruppe c)) Gruppe Kontrol < b 4 Gruppe Gruppe.... co fd " Kontrol CfQ 9 b Gruppe c oc) Gruppe u <.-"11 r 0 o 3 c d Kontrol H E. nfii 3M b H Gruppe F-1 Gruppe -0 00 : C 3 Kontrol Gruppe fd cx) m Gruppe... Kontrol Gruppe w Gruppe 61L, 1-9 L869L4

. : DK 176987 Bi 8/9 -- No 'x'a 0. g w, odv»xah irj ej : krn alo 'xah V 'XUH 2. MIIIH3% ::.:: -: j4)..quo) c." i ---... ) "XaH P-n y.,:,2xw,,zmi:.=: lo...31u0,, MI1 c-4' C..? 4-8 : a ; = CL 1 kn aw ''xah C..., :-E' Q,3 u_ iiiifilmffitiv::::;-::::::::::::h;:::::::,..,...i...x.ovt, L4-, :W I E 131W il a., s. 4. 0, 11: ':-U0. XE 314 '";;:' c. kj, od v -xal4 `..--), ro. > '3E'31 XO:,N.. agt-) 'xah -adv -"<at,.1 g ' t-c3 m Voks en ha n 4,x0v,i -4u0-A 10-1 r.; \I T C Cr: C,3N i^ «) N 0 Ki snpslel lewe OJ

0 Antal lakselus pro fisk Hexa I b Hexa 2 Hexa 3 Kontrol < 0 4Tr.3 < 0 ="- C) n 3 n C < f 724. fd 2 i723 ø w -as Hexa Hexa 2 W.: Hexa 3 Kontrol ',&-\\..N.\\,\ffir"" Hexa Hexa 2 cm.o Hexa 3 74- fr Kontrol Hexa 1 Hexa 2 00 Hexa 3 Kontrol 6/6 49 L869 L4