(19) DANMARK d2) (12) PATENTSKRIFT

Transkript

1 (19) DANMARK d2) (12) PATENTSKRIFT (11) DK B1 Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.CI 7.: A 61 K 39/02 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (83) Deponering af mikroorganismer. (30) Prioritet: NL (73) Patenthaver: Akzo N.V., Velperweg 76, 6824 BM Arnhem, Holland (72) Opfinder: Paul Karel Storm, De Raetsingel 14, 5831 KC BOXMEER, Holland (74) Fuldmægtig: Chas. Hude A/S, H.C. Andersens Boulevard 33, 1780 København V, Danmark (54) Benævnelse: Mycoplasmavaccine (56) Fremdragne publikationer: US A GB A Chemical Abstracts, 88, 1978, abstract nr (57) Sammendrag: Mycoplasma-vaccine, som er avirulent over for høns og ikke er patogen for kalkuner. Især en sådan vac-cine, som indeholder Mycoplasma-stammen Intervet 6/8 (deponeringsnr ved CNCM, Pasteur Institute, Paris, Frankrig). 0 o. I. a. FIGUR I

2 1 Den foreliggende opfindelse angår en mycoplasmavaccine og en fremgangsmåde til beskyttelse af fjerkræ mod mycoplasmainfektioner ved indgivelse af en sådan vaccine. 5 Mycoplasma og nærmere bestemt M. gallisepticum er en bakterie, som er infektiøs, især for fjerkræ. Infektionen hos kommerci ett vigtige fugle med nævnte bakterie forårsager betragtelige økonomiske tab. 10 Syndromet, som M. gallisepticum forårsager, benævnes når der er tale om høns, sædvanligvis "kronisk åndedrætssygdom" og når der er tale om kalkuner "infektiøs sinusitis". M. gallisepticum-infektion ledsages også ofte af infektion på grund af åndedrætsviruser og på grund af Escherichia coli. 15 M. gallisepticum-infektioner kan bekæmpes med visse antibiotika, såsom erythromycin, streptomycin, chlorotetracyclin, tylosin og magnamycin, som sædvanligvis blandes med foderet, men bakterierne udvikler modstand over for nævnte stoffer i en 20 stigende grad, som et resultat af hvilket bekæmpelse bliver mere og mere vanskelig. Der er blevet udviklet vacciner for immunologisk beskyttelse af fjerkræ over for M. gallisepticum-infektioner. 25 Inaktiveret M. gallisepticum-bakterier har været anvendt med forskellige resultater. Selvom disse resulterede i en god serologisk reaktion, især når indgivet i kombination med et olieemulsionhjælpemiddel, så det ikke ud til, at sådanne vac- 30 ciner beskyttede mod infektioner. ' I et begrænset antal stater i U.S.A., især i de såkaldte "farme med æglæggende i flere aldre" blev der udført vaccination med svækket levende M. gallisepticum af F-stammen. Stammen 35 indgives ved hjælp af sprøjtemetoden og giver en rimelig beskyttelse over for lungesækinflammationer og reducerer faldet i ægproduktion til et acceptabelt niveau.

3 2 5 Ulemperne ved de kendte inaktiverede vacciner er utallige. Hvert dyr skal injiceres individuelt. Vaccinen er meget dyr. Dyrene er ikke beskyttet mod infektion, dvs. efter infektion kan de forblive bærere af en (virulent) mycoplasma. Selv de eksisterende levende vacciner er ikke uden problemer. Selvom F-stammen er rimelig avirulent over for høns, er den 1 0 meget patogen over for kalkuner. Endvidere forbliver hønsene efter vaccination bærere af vaccinestammen, som således også kan fortsætte med at spredes i en længere periode. Der er nu blevet fundet en M. gallisepticum-vaccine, som ikke har de ovenfor nævnte ulemper. 15 Mycoplasmavaccinen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den hidrører fra en Intervet 6/85 M. gallisepticum-stamme. Intervet 6/85-stammen er en hidtil ukendt M. gallisepticum-stamme en mutant, som er blevet opnået ved hjælp af en række "in vitro"-passager af den kendte S6-stamme 20 (ATCC nr ). 25 Denne hidtil ukendte stamme, som blev deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ved Pasteur instituttet i Paris den 7. jul 1987 under nummeret I- 673, hører derfor til opfindelsen. Intervet 6/85-stammen har en række vigtige fordele sammenlignet med de kendte M. gallisepticum-stammer, hvilket gør den ekstremt egnet til vaccineanvendelser, og som også adskiller den fra de kendte M. gallisepticum-stammer: 30 a. ikke-virulent over for høns: ingen kliniske symptomer overhovedet; luftsækbetændelser forekommer praktisk talt

4 3 ikke: b. ikke-virulent over for kalkuner; c. findes stadig efter 4 uger efter administration kun hos et ubetydeligt antal dyr, mens F-stammen fortsætter med at blive udskilt i et langt tidsrum af næsten 100% af dyrene; d. et endonukleaserestriktionsmønster, som vist i fig. 1. Vaccinen ifølge opfindelsen indgives fortrinsvis til fjerkræ i form af en levende vaccine, selvom den imidlertid også kan an- 10 vendes som en inaktiveret vaccine. Mycoplasmavaccinen kan indgives på den sædvanlige måde for lignende vacciner, men den foreliggende vaccine er især egnet til indgivelse som en aerosol. Meget findelte aerosoler af 15 vaccinen kan f.eks. fremstilles ved hjælp af et "Vineland"-aerosolapparat. Mycoplasmavaccinen ifølge opfindelsen kan f.eks. markedsføres i frysetørret form. Ud fra dette kan der fremstilles en sus- 20 pension ved at tilsætte en vandig væske, f.eks. ledningsvand. Vaccinen kan selvsagt også markedsføres som en suspension. Om ønsket kan der udover mycoplasmamaterialet være en eller flere stabilisatorer (såsom skummetmælk eller caseinhydrolysat) og/eller en eller flere antibiotika (såsom ampicillin eller 25 polymyxin) til stede i vaccinen. Den omhandlede vaccine er egnet til bekæmpelse af mycoplasmainfektioner hos fjerkræ. Den er især egnet til bekæmpelse af mycoplasmainfektioner hos høns og kalkuner. Vaccinen kan bedst 30 indgives i opdrætningsperioden, fortrinsvis ved en alder på 8-15 uger, som en beskyttelse overfor et produktionsfald under æglægningsperioden. Vaccinationen bør fortrinsvis udføres i opdrætperioden på grund af: 35 a. en lettere vaccinationsreaktion, som muligvis er et resultat af, at vaccinen ikke har nogen indvirkning på ægproduktionen på dette trin; b. beskyttelsen skal være passende på det tidspunkt, når dy-

5 4 5 rene begynder at lægge æg; c. dyrene bør beskyttes, når de overføres fra opdrætningsfarmen til æglægningsfarmen, hvor infektionen sædvanligvis finder sted. Et af de fremragende træk ved vaccinen ifølge opfindelsen er dens meget ringe virulens over for høns. Dette blev vist hos opdrættere af hvide italienere, hvor virk- 10 vingerne af Inter'vet 6/85-stammen, R-stammen og F-stammen blev sammenlignet. R-stammen anses for at være en meget virulent M. gallisepticum-stamme. F-stammen anvendes i USA som en vaccinestamme. Begge stammer blev gjort tilgængelige af S. Kleven fra the University of Georgia. R- og F-stammerne blev dyrket i me- 15 lierne beskrevet af Frey et al. (M.C. Frey, R.P. Hanson og D.P. Anderson (1968) Amer. J. Vet. Res. 29, ), mens Intervet 6/85-stammen blev dyrket i et modificeret Adler-medium (H.E. Adler, R. Yamamoto og S. Bankowski (1954) Amer. J. Vet. Res. 15, 463-5). Modifikationerne af Adler-mediet bestod i, at 20 Bacto PPLO-suppe blev erstattet med proteasepepton og hesteserum med svineserum. De i disse sammenligningsforsøg anvendte høns havde tidligere vist sig seronegative over for både M. gallisepticum og over 25 for M. synoviae. Ca. en uge før eksperimenterne blev 10 høns anbragt i en isolator med reduceret tryk. Mycoplasma blev indgivet til disse høns ved hjælp af aerosolmetoden. 100 ml af den respektive 30 mycoplasmakultur blev forstøvet i 10 minutter i isolatoren, fra hvilken luftudstrømningen var blevet lukket af. Intervet 6/85-suspensionen, som blev indgivet, indeholdt levende organismer per ml, mens både F- og R-stammesuspensionen kun indeholdt 10 8 levende organismer per ml. 35 En post mortem undersøgelse blev udført 10 og 24 dage efter indgivelse af mycoplasma. I begge tilfælde af 5 høns. Hønsene blev undersøgt med hensyn til luftsækbeskadigelse, æggestokde-

6 5 generering og antal dyr, hvorfra M. gallisepticum kan isoleres. Resultaterne blev reproduceret som beskrevet i eksempel 2 under henholdsvis a, b og c. 5 Resultaterne er gengivet i tabellerne nedenfor. Infektion af 27 uger gamle høns 10 Ingivet Antal dage efter indgivelse Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Genisolering (%) 15 R-stamme 10 3,0 3,0 100 Intervet 10 0,6 0,2 40 6/85-0,0 0, R-stamme 24 1,0 0,6 100 Intervet 24 0,0 0,2 40 6/85-0,0 0,0 0 Infektion af 32 uger gamle høns 25 Ingivet Antal dage efter indgivelse Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Genisolering (%) 30 R-stamme Intervet 6/ ,2* 0,3 0,0 2,5 0,8 0, *gennemsnit for 6 høns 35

7 6 Infektion af 35 uger gamle høns 5 Ingivet Antal dage efter indgivelse Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Genisolering (%) 1 0 R-stamme 10 2,8 2,6 100 Intervet 10 0,2 1,4 20 6/85 F-stamme 10 2,0 1, ,0 0, R-stamme 24 0,6 0,8 100 Intervet 24 0,0 0,0 0 6/86 F-stamme 24 0,6 0,4 80 0,0 0,0 0 Infektion af 39 uger gamle høns 20 Ingivet Antal dage efter indgivelse Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Genisolering (%) 25 R-stamme 10 2,2 2,4 100 Intervet 10 0,0 0,8 0 6/85 F-stamme 10 2,0 1, (40 uger gamle) 0,0 0, Det fremgår af de ovenfor viste resultater, at Intervet 6/85- stammen forårsager væsentlig mindre luftsæk- og æggestokbeskadigelse end både R- og F-stammen. 35 Det fremgår endvidere, at Intervet 6/85-stammen ikke længere er påviseligt til stede hos de inficerede høns efter ca. 4 uger, mens både R- og F-stammerne faktisk stadig ofte kunne påvises på dette tidspunkt.

8 7 Lignende forsøg er blevet udført med 4 uger gamle hvide kalkuner. Resultaterne er vist i tabellen nedenfor. 5 Indgivet Antal dage efter indgivelse Luftsæk-. beskadigelse Genisolering (%) 10 R-stamme 10 3,2 100 Intervet 6/ ,2 100 F-stamme 10 2, (5i uger gamle) 0, R-stamme 28 3, Intervet 6/ ,5 0 F-stamme 28 2,6 100 (8 uger gamle) 0, Kalkuner er kendt for at være særlig modtagelige over for M. gallisepticum, selv når der er tale om relativt lav-virulente stammer, såsom F-stammen, hvilket anvendes som en vaccinestamme i tilfældet med høns. 25 De ovenfor viste resultater viser imidlertid, at den hidtil ukendte Intervet 6/85-stamme også har meget lav virulens over for kalkuner og i alt væsentlig ikke frembringer nogen beskadigelse. Intervet 6/85-stammen blev også undersøgt for tilbagevenden 30 til virulens. Til dette formål blev stammen ført 5 gange gennem høns, idet mycoplasmaet, som var genisoleret ved hjælp af en "tracheal vatpind", indgives hver gang til de nye høns. Resultaterne er vist i tabellen nedenfor. Der blev ikke fundet nogen stigning med hensyn til virulens, selv efter 5 passager. 35

9 8,. 5 Indgivet Passage nr. Antal dage efter administration Alder (uger) Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Genisolering (%) Intervet 6/ ,75 1, ,25 0, Intervet 6/ ,0 1,0 20 Intervet 6/ ,2 1,4 20 R-stamme ,8 2, ,0 0, Intervet 6/ ,4 20 Intervet 6/ ,8 0 R-stamme , , Intervet 6/ ,4 1,4 20 R-stamme ,2 2, ,0 0, Eksempel 1 25 Fremstilling af en levende vaccine En mængde på ca. 1 ml podemateriale af Intervet 6/85-stammen af Mycoplasma gallisepticum rekonstitueres i 10 ml modificeret Adler-medium og inkuberes ved 37 C. 30 Når tilstrækkelig med vækst havde fundet sted, hvilket blev 35 bedømt på basis af farveændringen af en indikator, som var blevet tilsat (phenolrødt), podes suspensionen i et frisk modificeret Adler-medium i et volumenforhold på 1:20 og inkuberes igen på den ovenfor beskrevne måde. Denne opskalering gentages, indtil der opnås et podestof, som er stort nok til at pode den fermenteringsbeholder, som skal anvendes (det er nødvendigt med ca. 5 liter podestof til en 100 liters fermenteringsbeholder).

10 9 Efter podning af fermenteringsbeholderen udføres inkubering i 24 til 30 timer ved en ph-værdi på 7,5, en temperatur på 37 C og med en konstant omrøringshastighed og ved luftning. 5 Derefter opsamles cellerne ved hjælp af centrifugering og op- tages i skummetmælk (10%), hvortil der er blevet tilsat ampicillin. Efter at være blevet fyldt på egnede hætteglas, frysetørres 10 vaccinen og hætteglassene lukkes derefter. Eksempel 2 Vaccinationsforsøg med høns 15 To grupper på 10 høns blev vaccineret ved hjælp af aerosolmetoden med henholdsvis F-stammen og Intervet 6/85-stammen og anbragt i isolatorer med reduceret tryk. 20 To uger senere inficeres de to grupper og også en ikke-vaccineret kontrolgruppe med den virulente R-stamme og slagtes 10 dage efter. Luftsækbeskadigelse, æggestokdegeneration og den relative mængde M. gallisepticum, som er til stede i de slagtede dyr, blev bestemt på den nedenfor beskrevne måde: 25 a) Grader af luftsækbeskadigelse blev klassificeret på følgende måde: 0 = klare luftsække uden lymfofollikulær beskadigelse; 30 1 = mindre uklarhed i en af de to luftsække eller lymfofollikulær beskadigelse af en af de to luftsække; 2 = som 1, men i dette tilfælde i begge luftsække, eller kraftig uklarhed i en eller to luftsække eller ostelignende udskillelse i en eller to luftsække, eller en eller to 35 luftsække, som er blevet tykke og kødfulde; 3 = begge luftsække kraftigt uklare eller en ostelignende udskillelse eller fortykkede og kødfulde; 4 = en kombination af symptomerne under 3.

11

12

13 10 b) Graden af æggestokdegenerering blev klassificeret på følgende måde: 0 = aktive æggestoffer uden degeneration; 5 1 = få af folliklerne i æggestokken var degenereret; 2 = alle folliklerne degenereret og nogen med blødninger; 3 = alle folliklerne degenereret med blødninger. c) Der blev foretaget en bestemmelse af antallet af høns, 10 hvorfra Mycoplasma gallisepticum kunne genisoleres. Dette blev udtrykt som en procentangivelse af det samlede antal høns i de respektive grupper. Resultaterne fra forsøgene beskrevet ovenfor efter vaccination 15 af høns med forskellige aldre er beskrevet nedenfor

14 11 Vaccination af 27 uger gamle høns 5 Gruppe Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Geniso-* lering (%) Intervet 6/85-vaccination samt R-stammeinfektion 1,0 0, Ingen vaccination, men R-stammeinfektion 3,0 2, Intervet 6/85-vaccination, ingen infektion med R-stamme 0,0 0,2 40 Ingen vaccination, ingen infektion med R-stamme 0,0 0, *Der blev ikke skelnet mellem R-stamme og Intervet 6/85-stamme

15 12 II. Vaccination af 35 uger gamle høns 5 Gruppe Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Geniso-* lering (%) Intervet 6/85-vaccination samt R-stammeinfektion 1,2 2, F-stamme-vaccination samt R-stammeinfektion 1,0 1, Ingen vaccination, men R-stammeinfektion 2,4 2,6 100 Intervet 6/85-vaccination, ingen infektion 0,0 0, F-stamme-vaccination, ingen infektion 0,6 0,4 80 Ingen vaccination, ingen infektion 0,0 0, *Der blev ikke skelnet mellem R-stamme, F-stamme og Intervet 6/85-stamme

16 13 III. Vaccination af 39 uger gamle høns 5 Gruppe Luftsækbeskadigelse Æggestokdegeneration Geniso-* lering (%) Intervet 6/85-vaccination samt R-stammeinfektion 0,0 1, F-stamme-vaccination samt R-stammeinfektion 1,4 1, Ingen vaccination, men R-stammeinfektion 2,2 2,2 100 Ingen vaccination, ingen infektion 0,0 0, men. *Der blev ikke skelnet mellem R-stamme, F-stamme og Intervet 6/85-stamme. Ud fra disse forsøg kan det konkluderes, at Intervet 6/85- stammen giver en beskyttelse mod luftsækbeskadigelse og æggestokdegeneration som et resultat af en alvorlig infektion, som er sammenlignelig med den beskyttelse, som opnås med F-stam

17 14 PATENTKRAV 1. Vaccine til bekæmpelse af mycoplasmainfektion hos fjerkræ, kendetegnet ved, 5 at vaccinen hidrører fra en Intervet 6/85 Mycoplasma gallisepticum-stamme deponeret under nummer i Collection Nationale de Culture de Microorganismes ved Pasteurinstituttet i Paris. 2. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den indeholder en levende My- 10 coplasma gallisepticum-stamme. 3. Vaccine ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den er frysetørret. 4. Intervet 6/85 Mycoplasma gallisepticum-stamsne deponeret under nummer i 15 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ved Pasteurinstituttet i Paris Anvendelse af Intervet 6/85 Mycoplasma gallisepticum-stammen deponeret under nummer i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes ved Pasteurinstituttet i Paris til fremstilling af en vaccine til bekæmpelse af mycoplasmainfektion.

18 O ti SG (ATCC 15302) Intorvet 6/85 1:# 5A (ATCC 15302) In ervet G/85 56 (ATCC 02) Intervet A/85 I ; ii 56 (ATCC 15302) Int rvel A/85 Le 9909L L. Na