Forskerspirer 2013 - NAT Alexander T. Kristensson - Roskilde Gymnasium Genmanipulering af Arabidopsis til produktion af langkædede alkoholer Abstract This paper outlines a proposed pathway to produce fuel ready fatty alcohols from triacylglycerols in vivo. This will be accomplished by gene manipulating the model plant Arabidopsis thaliana to express the enzymes lipase, carboxyl acid reductase and aldehyde reductase on the surface of oil storing lipid droplets. The in vivo transformation to fatty alcohols will reduce the viscosity of plant oils and thus make the oil producing plants more promising as a source of biofuels.
Indhold Indledning... 2 Formål... 2 Baggrund... 3 Fra lysenergi til triacylglyceroler... 3 Lagring i fedtdråber... 4 Sænkning af viskositet... 4 Metoder og fremgangsmåde... 5 Gensplejsning af plasmider... 5 Transformering af Arabidopsis... 7 Test af placering... 8 Test af virkningsgrad... 8 Udførelse... 9 Diskussion... 9 Yderligere overvejelser... 9 Sikkerhedsforanstaltninger... 9 Perspektiver... 9 Forskerkontakt... 10 Referencer... 10 Gener... 11 Billeder... 11 Bilag 1: Fastankring af pathway... 12 Bilag 2: Plasmider... 13 Bilag 3: Tidsramme... 14 Bilag 4: Budget... 15 1/15
Indledning Planter og alger har som primærproducenter en enorm kapacitet for at syntetisere biostoffer. De fotosyntetiserende organismer kan som bekendt opfange lysfotoner i chloroplasterne og bruge energien til at opbygge molekyler som kulhydrater, aminosyrer, lipider og en række andre stoffer. Nogle planter og alger har et naturligt højt indhold af lipider, der kan udvindes til biobrændsel. Biodiesel indeholder kilomæssigt dobbelt så meget energi som glukose, og der er derfor store perspektiver i optimering af biodiesel-produktionen. Biobrændsler som biodiesel har en række fordele over andre energikilder på markedet [1]: a) I modsætning til fossile brændstoffer er de CO 2 -frie. b) Bæredygtig produktion, da planterne syntetiserer biostoffer ud fra fornybare ressourcer som sollys, CO 2, vand og nogle uorganiske næringssalte. c) De fleste biobrændsler kan bruges direkte i nuværende motorer og kræver derfor ikke den store udvikling og produktion af nye teknologier som brændselsceller og effektive batterier. Dog er der også ulemper ved biobrændsel [1]: a) Produktionen af biomateriale tager ofte pladsen fra madproducerende afgrøder. b) Biodiesel fra planteolier har ofte en for høj viskositet, hvilket kan give problemer i dieselmotorer. c) Produktionsraten per hektar er endnu ikke høj nok til økonomisk at kunne betale sig i stor skala. Grundet disse ulemper vil en optimering af biodiesel-produktionen på den ene eller anden måde være påkrævet, før biodiesel kan begynde at være konkurrencedygtig i forhold til andre brændstoffer på markedet. Formål Dette forskerspire-projekt vil fokusere på en genmanipulering af modelplanten Arabidopsis, så den omdanner triacylglyceroler i frøene til langkædede alkoholer, der er bedre egnet som biobrændsel pga. den nedsatte viskositet. Omdannelsen af triacylglyceroler til fedtalkoholer vil foregå gennem en række enzymatiske trin, katalyseret af hhv. lipase, carboxylsyre reduktase og aldehyd reduktase. 2/15
Baggrund Fra lysenergi til triacylglyceroler Planter og alger opfanger lysfotoner i fotosystem I og II, der begge er placeret i chloroplasternes inderste membran - thylakoidmembranen. Den indfangede energi fra fotonerne bruges i begge systemer til at excitere et par af elektroner, som bliver sendt igennem en elektrontransportkæde for at tappe den tilførte energi små bidder ad gangen. Dette resulterer i opbygning af de energirige molekyler ATP og NADPH. Disse molekyler bruges i chloroplastet til en række forskellige processer, f.eks. den glukose-producerende Calvincyklus [2]. I dette projekt er det dog fedtsyre-produktionen, som er i fokus. Fedtsyrer er et vigtigt molekyle i opbygningen af lipider, hvor de som regel udgør hele den upolære del. Strukturmæssigt er de nemlig opbygget af en lang upolær carbonkæde med en carboxylsyre for enden. Produktionen af fedtsyrer finder sted i chloroplasterne af komplekset fedtsyre syntase, som opbygger fedtsyrerne 2 carbon-led ad gangen ved at påsætte acetyl-enheder på carbonkæden én efter én. Langt de fleste fedtsyrer har 18 carbonatomer, men 16-carbon fedtsyrer forekommer også i mindre mængder. Efter syntesen kan nogle andre enzymer omdanne fedtsyren til en mono- eller polyumættet fedtsyre ved at danne en eller flere dobbeltbindinger i carbonkæden [3]. De fleste fedtsyrer vil blive transporteret til det endoplasmatiske reticulum (ER), hvor de fungerer som byggesten til en række forskellige lipider som f.eks. triacylglyceroler (triglycerider). 1 Transporten af fedtsyrer foregår gennem kontaktområder mellem chloroplaster og ER og er formentlig protein-medieret [4]. Triglycerid består af 3 fedtsyrer bundet sammen med glycerol af esterbindinger ( Figur 1). Syntesen af triacylglyceroler foregår gennem en række enzymatiske trin, som esterificerer glycerol med tre fedtsyrer [3]. Figur 1: Et triglyceridmolekyle med en mættet, en monoumættet og en polyumættet fedtsyre (fra toppen og ned). 1 Chloroplasterne kan også selv danne lipider ud fra dens prokaryot-lignende enzymer, da de engang var en selvstændig fotosyntetiserende bakterie. Langt størstedelen af lipid-produktionen foregår dog i ER. 3/15
Lagring i fedtdråber Efter syntesen i chloroplasterne og ER vil triacylglycerol blive transporteret til organel-lignende strukturer i cytosolet, kaldet fedtdråber (lipid droplets). Denne transportmekanisme er endnu ikke blevet kortlagt, men man ved, at fedtdråber med stor sandsynlighed opstår i ER og ofte ophobes heromkring. Fedtdråber har et hydrofobt indre og bruges derfor til lagring af hydrofobe lipider og proteiner. Triacylglyceroler udgør dog langt størstedelen af fedtdråbernes indre. Fedtdråber er omgivet af et enkelt lag af phospholipider, der fungerer som en membran ligesom de dobbeltlagede membraner, man ser andre steder i cellen [5]. Som i alle andre membraner er der fastgjort overfladeproteiner til phospholipid-laget, som styrer forskellige processer som bl.a. fedtdråbernes skæbne og regulering af indholdet i fedtdråberne. En kendt klasse af proteiner på overfladen af fedtdråber i planter er oleosinerne [6]. Sænkning af viskositet En væskes viskositet betyder overordnet hvor tyktflydende den er. De fleste planteolier har en væsentlig højere viskositet end almindelig diesel. Dette kan give problemer i dieselmotoren, som vil have svært ved at koldstarte, fordi planteolierne klumper sammen. Derfor bliver man nødt til at nedsætte viskositeten i planteolierne for at kunne bruge dem som biobrændsel. Den mest udbredte måde at gøre dette på, er ved at esterificere lipiderne med en alkohol (typisk methanol eller ethanol) og danne en fedtsyre ester (En fedtsyre og en alkohol bundet sammen af en esterbinding) [3]. Nylige forskningsresultater har dog banet vejen for en alternativ måde at nedsætte viskositeten på; en enzymatisk vej til reduktion af triacylglyceroler til fedtalkoholer [7]. Ved at genmanipulere en bestemt E. coli-kultur (med forhøjet akkumulering af frie fedtsyrer) var man i stand til at omdanne fedtsyrer til fedtaldehyder og derfra videre til fedtalkoholer. Omdannelsen af fedtsyrer til fedtaldehyder blev katalyseret af enzymet carboxylsyre reduktase (CAR) med energi doneret fra NADPH og ATP, mens vejen fra fedtaldehyder til fedtalkoholer blev katalyseret af aldehyd reduktase (AHR) med energi fra NADPH ( Figur 2). Carboxylsyre reduktase Aldehyd reduktase Figur 2: Den enzymatiske vej fra fedtsyre til fedtalkohol. "R" er en carbon-kæde af variabel længde. For at få adgang til flere frie fedtsyrer kan disse enzymer kombineres med en lipase, der nedbryder triacylglycerol til glycerol og 3 frie fedtsyrer. Hvis man introducerer denne reaktionsvej til en olieproducerende plante eller alge og sørger for, at enzymerne kommer i kontakt med de triglyceridfyldte 4/15
fedtdråber, vil man altså stå med en plante/alge, der er i stand til at producere store mængder langkædede alkoholer. Dette er netop, hvad jeg vil prøve at opnå. Metoder og fremgangsmåde Indførelsen af enzymer, der kan katalysere omdannelsen af triacylglyceroler til fedtalkoholer, vil blive udført og testet i planten Arabidopsis thaliana, som er en velegnet og ofte benyttet modelplante til formålet. Gennem gensplejsning vil hvert af generne kodende for enzymerne lipase, carboxylsyre reduktase (CAR) og aldehyd reduktase (AHR) blive sammenkoblet med en kopi af et gen for oleosin 1. 2 De forskellige oleosin 1 gen-koblinger med hhv. lipase, carboxylsyre reduktase (CAR) og aldehyd reduktase (AHR) vil blive indsat i et Ti (tumor inducing) plasmid, som introduceres til Arabidopsis via jordbakterien Agrobacterium tumefaciens. Hvis indsat rigtigt, vil planten afkode de sammensatte gensekvenser som ét gen og danne et kompleks sammensat af oleosin 1 og enten lipase, CAR eller AHR. Pga. oleosin 1-proteinet vil disse komplekser forhåbentlig alle blive transporteret til fedtdråberne, hvor de påhæftede enzymer kan omdanne triacylglyceroler til fedtalkoholer (Se Bilag 1: Fastankring af pathway). Gensplejsning af plasmider Jeg vil lave otte plasmider med otte forskellige gensamlinger (En oversigt over plasmiderne kan ses senere i teksten). Alle otte plasmider vil indeholde et selektionsgen for neomycin-phosphor-transferase (NPTII), der giver resistens mod antibiotikummet kanamycin [8]. Derved kan man sikre sig, at transformeringen er succesfuld ved kun at bruge de frø, der spirer i et medie tilsat kanamycin. Udover resistensgenet vil der også være en eller flere genkoblinger, der starter med en kopi af genet for proteinet oleosin 1 efterfulgt af genet for enten lipase, CAR eller AHR. De fleste plasmider vil kun indeholde en enkelt af disse genkoblinger, men to plasmider vil indeholde både oleosin-lipase og oleosin-car genkoblingerne, hvor det ene plasmid også indeholder oleosin-ahr genkoblingen og dermed koder for alle tre enzymer - koblet til oleosin 1. På denne måde kan jeg indføre flere enzymer med en enkelt transformation. Det er desuden også fordelagtigt, da jeg så kun behøver at anvende et enkelt antibiotikaresistens-gen til at teste transformationen. 2 Oleosiner er en gruppe af proteiner, der sidder i fedtdråbe-membranen hos planter. 5/15
CAR-enzymet kræver yderligere modifikation i ER af en phosphopantetheinyl transferase (PPTase) for at fungere optimalt [9]. Derfor vil plasmiderne med genet for CAR også indeholde et selvstændigt gen for PPTasen SFP. 3 (Se Tabel 1 for en oversigt over de nævnte proteiner) De tre første plasmider vil indeholde genet for grønt fluorescerende protein (GFP), koplet til genet for hhv. lipase, CAR og AHR. Disse plasmider bruges til at observere, hvor i cellen enzymerne bliver udtrykt. De otte plasmider er opstillet nedenfor med tildelte navne samt indholdet af gener. (Se Bilag 2: Plasmider for et mere visuelt overblik) - plip-gfp: apha, OLEO1 + Lipg + gfp - pcar-gfp: apha, OLEO1 + car + gfp - pahr-gfp: apha, OLEO1 + YjgB + gfp - plip: apha, OLEO1 + Lipg - pcar: apha, OLEO1 + car, sfp - pahr: apha, OLEO1 + YjgB - plipcar: apha, OLEO1 + Lipg, OLEO1 + car, sfp - plipcarahr: apha, OLEO1 + Lipg, OLEO1 + car, OLEO1 + YjgB, sfp Tabel 1: En oversigt over enzymerne, deres funktioner og de tilhørende gener. Links til generne kan findes under Gener. Protein Funktion Gen Oleosin 1 Fastankret i fedtråbe-membranen OLEO1, A. thaliana Lipase Nedbryder triacylglycerol til glycerol og fedtsyrer Lipg, M. musculus CAR Omdanner fedtsyrer til fedtaldehyder car, M. marinum SFP Aktiverer CAR-enzymet i ER sfp, B. subtilis AHR Omdanner fedtaldehyder til fedtalkoholer YjgB, E. coli GFP Lyser grønt under ultraviolet belysning gfp, N. gonorrhoeae NPT Giver resistens mod bl.a. kanamycin apha, E.coli 3 SFP-genet vil ikke være koblet til OLEO1 og Car, men vil have sin egen promotor og startcodon. I plasmidet kodende for både CAR og GFP (pcar-gfp), behøver CAR-enzymet ikke fungere optimalt, og dette plasmid vil derfor ikke indeholde SFP-genet. 6/15
For at de sammenkoblede gener for oleosin, lipase/car/ahr og (GFP) bliver afkodet til ét sammenhængende protein, bliver jeg nødt til at fjerne terminator-delen samt stopcodon i OLEO1 og promotor og startcodon i lipase/car/ahr-genet. I de plasmider, der indeholder GFP-genet, skal jeg desuden også fjerne terminator og stopcodon i lipase/car/ahr-genet samt promotor og startcodon i gfp. Promotorerne og terminatorerne er DNA-sekvenser, der hhv. starter og slutter afkodningen til mrna. Det er derfor kun promotoren i det første gen, OLEO1, og terminatoren i det sidste gen, lipg/car/yjgb eller gfp, jeg er interesseret i. Start- og stopcodon er tre nukleotider lange DNA-sekvenser, der afgrænser genet 4 [2]. Jeg vil anskaffe generne i Tabel 1 fra andre forskere, der har arbejdet med de samme gener. Hvis dette ikke kan lade sig gøre, vil jeg bestille dem fra firmaet Genscript 5. På samme måde vil jeg anskaffe genmanipulerede Ti (tumor-inducerende) plasmider fra Agrobacterium tumefaciens, som står for DNAindførslen i planteceller [10]. Fjernelse af promotorer, terminatorer, start- og stopcodon vil jeg udføre vha. restriktionsenzymer, og samlingen af generne vil jeg gennemføre ud fra Gibson Assembly [11]. Denne forbehandling kræver en stor indsigt i gensplejsning samt adgang til relaterede computerprogrammer. Til denne del vil jeg derfor kontakte KU, som forhåbentlig vil kunne hjælpe mig med detaljerne. Transformering af Arabidopsis Overførslen af plasmider vil foregå via jordbakterien Agrobacterium tumefaciens. Bakterien inficerer normalt planteceller og indsender en bestemt DNA-sekvens, T-DNA, fra Ti plasmidet, som forårsager crown gall disease. Af denne grund bruger man en genmanipuleret variant af Ti plasmidet, hvor det meste af T-DNA et er fjernet. Kun små DNA-sekvenser på 25 basepar i begge ender af T-DNA er nødvendig for overførslen. Inden for disse grænser kan jeg derfor indsætte de gener, jeg ønsker introduceret i plantecellerne [10]. De otte plasmider overføres først til hver sin E. coli-kultur for at opformere plasmiderne. Når dette er gjort, oprenser jeg plasmiderne og transformerer dem ind i en A. tumefaciens-kultur. Derefter inficeres otte forskellige frøanlæg fra A. thaliana med hver af de otte forskellige Agrobacterium-kulturer ved at dyppe frøanlæggene i en opløst kultur af Agrobacterium. Dette skulle gerne få jordbakterierne til at inficere nogle få af frøene og overføre de ønskede DNA-sekvenser til cellerne, som inkorporeres et tilfældigt sted i genomet [12]. For at sikre mig at de planter, jeg undersøger, er blevet succesfuldt gensplejset, vil jeg dyrke 4 Startcodon ligger lige efter promotoren, og slutcodon lige før terminatoren. Deres roller er at hhv. starte og afslutte proteinsyntesen i ribosomerne. 5 http://www.genscript.com/ 7/15
frøene i et kanamycin-medie, som dræber alle de frø, der ikke er blevet gensplejset. De gensplejsede frø vil derimod have fået genet kodende for kanamycin-resistens og vil derfor spire. Test af placering For at teste om de tre enzym-komplekser opbygget af oleosin og enten lipase, CAR eller AHR bliver transporteret til fedtdråbernes overflade, vil jeg transformere tre Arabidopsis-kulturer med de tre plasmider kodende for GFP: plip-gfp, pcar-gfp og pahr-gfp. Proteinet GFP vil lyse grønt under ultraviolet belysning [13] og kan derfor observeres i et lysmikroskop. Dette kan bruges til at observere, hvor i cellerne oleosin-enzym-gfp komplekserne bliver udtrykt. Hvis oleosin-proteinet har bevaret evnen til at blive transporteret og fastankret på fedtdråberne, vil dette kunne observeres som små grønne klumper i cellerne (ofte grupperet omkring ER). Test af virkningsgrad Hvis enzym-komplekserne alle bliver transporteret til fedtdråbemembranerne, er det næste trin at teste, om enzymerne fungerer efter hensigten. Fremover vil jeg kun anvende plasmiderne uden GFP-genet, da GFP-proteinet kan forhindre enzymaktiviteten. For at kunne se virkningen af både enkelte enzymer og flere enzymer udtrykt samtidig vil jeg lave følgende transformeringer af Arabidopsis (Se Gensplejsning af plasmider for en liste over plasmiderne og deres indhold af gener): a) En kontrolgruppe uden behandling af Agrobacterium b) En kontrolgruppe transformeret med et tomt plasmid c) En gruppe med plip d) En gruppe med pcar e) En gruppe med pahr f) En gruppe med plipcar g) En gruppe med plipcarahr De transgene planter skal vokse i ca. 6 uger, indtil de sætter frø. Her vil ndholdet af hhv. triacylglyceroler, fedtsyrer, fedtaldehyder og fedtalkoholer i frøene blive målt i alle syv Arabidopsis-grupper. Dette gøres vha. gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS), som er en metode til at adskille forskellige stoffer efter deres kemiske egenskaber og efterfølgende måle koncentrationen af stofferne [14]. Resultaterne af disse in vivo -forsøg vil give et indblik i hvilke enzym-komplekser, der begrænser eller helt stopper reaktionen og derfor kræver opmærksomhed i en fremtidig optimering af reaktionsvejen. 8/15
Udførelse Min forskerkontakt har meldt ud, at jeg formentlig kan komme ind og udføre mine forsøg på KU. Deres faciliteter vil muliggøre realiseringen af projektet og spare mig for anskaffelse af dyre værktøjer som bl.a. et kraftigt lysmikroskop. (Se Bilag 3: Tidsramme og Bilag 4: Budget) Diskussion Yderligere overvejelser - At oleosin-enzym komplekserne kan fastankres på fedtdråbernes overflade, er en forudsætning for at forsøget kan fuldendes. Hvis der skulle vise sig nogle problemer i fastankringen af et af enzymerne, bliver jeg nødt til at udskifte oleosin 1-genet i de pågældende plasmider med genet for et andet overfladeprotein (f.eks. oleosin 2) og prøve igen efter samme fremgangsmåde. - De to sidste plasmider, plipcar og plipcarahr, er meget store, hvilket kan vise sig at give problemer. Hvis dette skulle være tilfældet, bliver jeg nødt til at transformere Arabidopsis flere gange med nogle mindre plasmider i stedet. Dette vil dog kræve forskellige selektionsgener til hver transformering. - En tredje ting, jeg skal lægge mærke til, er virkningsgraden af CAR-enzymet, da det er uvist om SFPenzymet er i stand til at udføre sin forbedrende ændring af CAR. Sikkerhedsforanstaltninger Da transgene planter udgør potentielle risici for verdenens økosystemer, skal jeg være omhyggelig med ikke at tabe eller miste nogle af de transgene Arabidopsis-frø. Desuden vil jeg omhyggeligt autoklavere alt materiale relateret til plasmiderne og bakteriekulturerne. Perspektiver Forskningsresultater har vist, at et øget udtryk i tobaksplanter af de frøstimulerende stoffer, DGAT og LEC2, medfører en op til 20 gange større akkumulation af triacylglyceroler og samtidig danner frølignende strukturer i det grønne væv [15]. Dette er interessant, fordi triacylglyceroler normalt kun bliver akkumuleret i store mængder i frøene og ikke i bladene. Et fremtidigt perspektiv for mit projekt er derfor at transformere tobaksplanten til fremstilling af fedtalkoholer og - når dette er opnået - at koble fedtalkoholproduktionen med et øget udtryk af DGAT og LEC2. Hvis dette lykkes, vil helt nye muligheder åbne sig inden 9/15
for fremstilling af biobrændsel, som både er effektive, økonomisk fordelagtige og vigtigst af alt, bæredygtige. Forskerkontakt Poul Erik Jensen, Professor på KU, Institut for Plante- og Miljøvidenskab, Molekylær Plantebiologi. - Jeg vil gerne sige tusind tak for samarbejdet. Uden din hjælp havde det ikke været muligt. Referencer 1. Chapman, K. (2011). The seeds of green energy. Retrieved from http://www.biochemist.org/bio/03302/0034/033020034.pdf 2. Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., & Jackson, R. B. (2011). Campbell Biology (Ninth Edition, Global). Pearson. 3. Durrett, T. P., Benning, C., & Ohlrogge, J. (2008). Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels. The Plant journal: for cell and molecular biology, 54(4), 593 607. doi:10.1111/j.1365-313x.2008.03442.x 4. Wang, Z., & Benning, C. (2012). Chloroplast lipid synthesis and lipid trafficking through ER-plastid membrane contact sites. Biochemical Society transactions, 40(2), 457 463. doi:10.1042/bst20110752 5. Walther, T. C., & Farese, R. V. (2012). Lipid Droplets and Cellular Lipid Metabolism. Annual Review of Biochemistry, 81(1), 687 714. doi:10.1146/annurev-biochem-061009-102430 6. Shimada, T. L., Shimada, T., Takahashi, H., Fukao, Y., & Hara-Nishimura, I. (2008). A novel role for oleosins in freezing tolerance of oilseeds in Arabidopsis thaliana. The Plant journal: for cell and molecular biology, 55(5), 798 809. doi:10.1111/j.1365-313x.2008.03553.x 7. Akhtar, M. K., Turner, N. J., & Jones, P. R. (2012). Carboxylic acid reductase is a versatile enzyme for the conversion of fatty acids into fuels and chemical commodities. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(1), 87 92. doi:10.1073/pnas.1216516110 8. http://www.patentlens.net/daisy/antibiotic/g3/1127.html (Besøgt den 22. oktober 2013) 9. Venkitasubramanian, P., Daniels, L., & Rosazza, J. P. N. (2007). Reduction of carboxylic acids by Nocardia aldehyde oxidoreductase requires a phosphopantetheinylated enzyme. The Journal of biological chemistry, 282(1), 478 485. doi:10.1074/jbc.m607980200 10. Bak, Søren et al. (2004). Tjek på Biotek. PlaCe. 10/15
11. http://openwetware.org/wiki/gibson_assembly (Besøgt den 23. oktober 2013) 12. Gelvin, S. B. (2012). Traversing the cell: Agrobacterium T-DNA s journey to the host genome. Frontiers in Plant-Microbe Interaction, 3, 52. doi:10.3389/fpls.2012.00052 13. Goodsell, D. S. (2003). Green Fluorescent Protein (GFP). RCSB Protein Data Bank. doi:10.2210/rcsb_pdb/mom_2003_6 14. Gas Chromatography - Mass Spectrometry. (n.d.). Retrieved October 26, 2013, from http://www.smithsdetection.com/gc-ms.html?format=html 15. Andrianov, V., Borisjuk, N., Pogrebnyak, N., Brinker, A., Dixon, J., Spitsin, S., Koprowski, H. (2010). Tobacco as a production platform for biofuel: overexpression of Arabidopsis DGAT and LEC2 genes increases accumulation and shifts the composition of lipids in green biomass. Plant Biotechnology Journal, 8(3), 277 287. doi:10.1111/j.1467-7652.2009.00458.x Gener - Neomycin-fosfor-transferase (apha, E. coli): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3829330 - Oleosin 1 (OLEO1): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/828617 - Triglycerid lipase (Lipg, M. musculus): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/16891 - Carboxylsyre reduktase (Car, M. marinum): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=b2hn69 - Phosphopantetheinyl transferase (Sfp, B. subtilis): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/14767907 - Aldehyd reduktase (YjgB, E. coli): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8182107 - Grønt fluorescerende protein (gfp, N. gonorrhoeae): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7011691 Billeder Forsidebillede: http://biodieselkitsguide.com/biodiesel-myths.php (Besøgt den 19. oktober 2013) Figur 1: http://commons.wikimedia.org/wiki/file:fat_triglyceride_shorthand_formula.png (Besøgt den 18. oktober 2013) Figur 2: http://germancavegirl.blogspot.dk/2011/09/omega-6-vs-omega-3-fatty-acids.html (Besøgt den 14. oktober 2013) 6 Bilag 1 og 2: Hjemmelavede 6 Figur 1 og 2 er blevet manipuleret ud fra kilden. 11/15
Alexander T. Kristensson Bilag 1: Fastankring af pathway Triacylglycerol Lipase Glycerol + 3 fedtsyrer Fedtsyre + NADPH + ATP Carboxylsyre reduktase Langkædet aldehyd + NADP+ + AMP + PPi Membranbundne oleosin 1-proteiner Langkædet aldehyd + NADPH Aldehyd reduktase Langkædet alkohol + NADP+ Cytosol Fedtdråbe 12/15
Alexander T. Kristensson Bilag 2: Plasmider 13/15
Bilag 3: Tidsramme 1. Undersøgelse af, hvilke restriktionsenzymer, primere og andre materialer, jeg skal bruge ( 3 dage) 2. Anskaffelse af materialer (Gener, plasmider, enzymer, Arabidopsis-frø, A. tumefaciens- og E. coli-kultur) ( 10 dage) 3. Gensplejsning og opformering af plasmider ( 1 uge) 4. Transformering af Arabidopsis med alle otte plasmider ( 6 uger) 5. Undersøgelse af GFP-Arabidopsis kultur (Med lysmikroskop) ( 1 dag) 6. Målinger af fedtindholdet (Triacylglyceroler, fedtsyrer, fedtaldehyder og fedtalkoholer) ( 3 dage) 7. Analyse af resultater ( 2 dage) 8. Skrivning af artikel ( 5 dage) Til dette skal lægges en ekstra uge til uforudsete hændelser. Alt i alt vil projektet komme til at vare omkring 3 måneder plus/minus en uge. 14/15
Bilag 4: Budget Tabel 2: Budgettet for mit projekt. Mange af tallene er upræcise vurderinger, da jeg ikke ved, hvilke enzymer jeg skal bruge, og hvor mange gener jeg kan skaffe fra andre forskere. Materialer Uddybende bemærkninger Forventede priser (DKK) Gener og Ti plasmider Fra Genscript og diverse forskere 12.500.- Materialer til DNA-tilpasning Restriktionsenzymer, ligaser, PCRmaterialer, primere osv. 5.000.- A. tumefaciens og E. coli kultur Manipuleret til transformerings-brug 400.- Arabidopsis thaliana-frø 100.- Transport til KU Fri rejse i hovedstadsområdet pga. Uddannelseskort 0.- Uforudsete udgifter 2.000.- 20.000.- Da gener er rimelig dyre, kan jeg forhåbentlig spare en del penge ved at kontakte forskere, der har arbejdet med de gener, jeg skal bruge. 15/15