IOTOX LUMINESCENCE INTRODUKTION IOTOX LUMINESCENSETEST SERET PÅ MÅLING F LYSUDSENDELSE FR DEN MRINE KTERIE VIRIO FISCHERI f K. Ole Kusk IOTOX-LUMINESCENCE testen er identisk med den såkaldte Microtoxtest - det eneste, der adskiller de to, er det anvendte udstyr. egge er baseret på lysudsendelse/lysproduktion (luminescence) fra den marine bakterie Vibrio fischeri (tidligere kaldt Photobacterium phosphoreum) Testen er en korttidstest, hvor resultatet klar få timer efter start af testen, og testen er i det hele taget mindre tidskrævende end de fleste andre økotoksikologiske tests. Testens følsomhed overfor en lang række stoffer er sammenlignelig med (men nok knap så stor som) en 96 timers akuttest med fisk. NVENDELSESOMRÅDE IOTOX metoden kan anvendes til undersøgelse af kemiske stoffer og forbindelser, forurenede vandprøver, vandige ekstrakter og perkolat, prøver af overfladevand (fersk, brak og marint) og porevand. PRINCIP Ved IOTOXtesten måles lys emissionen (luminescencen) fra bakterien, Vibrio fischeri, fotometrisk på en photomultiplier. Lysudsendelsen er et resultat af forskellige livsprocesser (metaboliske reaktioner) inde i bakteriecellerne. Hvis en eller flere af disse processer hæmmes af toksiske stoffer reduceres lysudsendelsen. Ved testen måles lysudsendelsen fra en bakteriesuspension før eksponeringens start og igen 5, 15 and 30 min efter starten af eksponering til en fortyndingsrække af testmaterialet. De koncentrationer, der reducerer (hæmmer) lysudsendelsen med 20 and 50 % i forhold til kontrollerne, beregnes og rapporteres som testresultatet.. Praktiske forberedelser: Frysetørrede bakterier suspenderes i 12.5 ml af en 20 o/oo NaCl-opløsning. Henstår ca. 30 min før brug. Det kemiske stof, som skal testes, opløses i 20 o/oo NaCl-opløsningen. Ved test af vandige prøver justeres prøven til 20 o/oo med NaCl. Ved test af prøver med højere salinitet fortyndes disse med (en kendt mængde) destilleret vand til 20 o/oo salinitet. Som fortyndingsvand (kontrolmedium) anvendes en 20 o/oo NaCl-opløsning.
IOTOX LUMINESCENCE lle testopløsninger termostateres til en konstant temperatur før start af testen. Temperature skal være konstant i hele testperioden. Den optimale testtemperatur er 15 C. ph skal være i intervallet 6.0-8.5, optimum er omkring 7. Under en test skal variationen mellem kontrol-ph og testopløsningernes ph være lille, ± 0.2. Fremstilling af testopløsninger: Fremstil 5 forskellige koncentrationer af testmaterialet og en kontrol. Eksponeringen startes ved at blande bakteriesuspension og testopløsning i forholdet 1:1 (500 µl af bakteriesuspensionen og 500 µl testopløsningen). På grund heraf skal de fremstillede koncentrationer være dobbelt så høje som de der ønskes testet. Testopløsningerne skal termostateres til testtemperaturen. 2 replikater af hver koncentration testes. Før tilsætning af testopløsning til bakteriekultur: Husk at måle på alle prøverør før blanding (initiel lysudsendelse t=0). Testprocedure 1. Opløs de frysetørrede bakterier i 12.5 ml fortyndingsvand. Skal termostateres ca. 30 min. 2. Fremstil testkoncentraionerne (dobbelt koncentration i forhold til de aktuelle testkoncentrationer). Temperer til testtemperaturen. Mærk testrør med et nummer eller koncentration. 3. Tilsæt 100 µl eller 500 µl afhængig af hvilket instrument der benyttes af bakteriesuspension til testrørene. 4. Mål luminescensen (t=0) på alle rør - inden tilsætning af testopløsning. 5. Tilsæt samme mængde testopløsning til testrørene, som der er tilsat af bakteriesuspensionen. Start tidsmålingen og mål luminescensen igen efter 5, 15 og 30 minutters eksponering.
IOTOX LUMINESCENCE
IOTOX LUMINESCENCE EHNDLING F IOTOX RESULTTER Rådata sæt fra IOTOXtesten kan se sådan ud: KONC T = 0 T = 5 T = 15 T = 30 0 20.8 21.78 21.08 18.5 0 19.19 20.46 19.9 17.73 1 26.34 14.58 14 11.59 1 25.85 14.05 14.5 12.42 2.5 23.78 9.77 10.2 8.126 2.5 23.02 9.614 10.07 8.424 5 21.77 6.367 6.684 5.833 5 22.97 6.572 6.961 5.973 12.5 23.24 3.402 3.642 3.156 12.5 21.67 3.368 3.484 3.034 25 20.28 2.256 2.444 2.029 25 20.2 2.2 2.321 2.143 eregn først korrektionsfaktoren for hvert måletidspunkt: KF 5, KF 15 and KF 30 IC 5 e.g. KF 5 = ------- IC 0 hvor IC 5 = Gennemsnits-luminescence af kontrolprøverne efter 5 min kontakt(eksponerings)tid IC 0 = Gennemsnits-luminescence af kontrolprøverne ved start Dernæst, beregn det relative respons (REL%): IT 5 Rel% = ------------- x 100 KF 5 x IT 0 for hvert prøverør incl. begge kontroller, der behandles på samme måde, relativt i forhold til kontrolgennemsnittet hvor IT 5 = Luminescenc-intensiteten af testprøven efter kontakttid (5 min i dette eksempel) IT 0 = Luminescenc i testprøve til tiden 0. rug statistikprogrammer til viderebehandling af de tre datasæt (5, 15 og 30 minutter) eller (mere simpelt) optegn koncentrations-respons-kurven og aflæs EC10 og EC50.
IOTOX LUMINESCENCE Materiale liste: - Luminometer. - Prøveglas - Pincet - akterier: Vibrio fischeri - opbevares i fryser. - NaCl-opløsning fra køleskab. (rekonstitutionsvæske) - Div. målekolber - Div. pipetter - NaCl til at fremstille 2.0% opl. ( 20 gram i 1 liter dest. Vand) - Stopur. - Reference stof: 2,5-Dichlorphenol. - Skema til notering af målingerne. RÅDT-SKEM Starttidspunkt:. KONC T = 0 T = 5 T = 15 T = 30 0 0 KF5 KF15 KF30