Enzymkinetik Introduktion I disse forsøg skal I arbejde med enzymet alkalisk fosfatase. Fosfataser er meget almindelige i levende organismer og er enzymer med relativt bred substrat specificitet. De katalyserer reaktioner af typen: RO PO 3 2 + H 2 O ROH + HOPO 3 2 Som substrat i forsøgene anvender vi para nitrophenylfosfat, der vha. enzymet omdannes til paranitrofenol og fosfat: Para nitrofenol er et gult stof med absorptionsmaximum ved 410 nm. Når der indgår et stof i reaktionen, der absorberer lys, er det muligt at følge reaktionsforløbet med et spektrofotometer. I dette tilfælde vil vi kunne måle på dannelsen af et af produkterne i reaktionen. Lambert Beers lov fortæller os, at der er ligefrem proportionalitet mellem absorbansen A og koncentrationen c af stoffet, der måles på: A = c d. er ekstinktionskoefficienten og for para nitrofenol er = 16,0 10 3 M 1 cm 1 ved 410 nm. I forsøgene skal vi undersøge følgende: 1. Reaktionens tidsforløb a) med enzym og b) uden enzym 2. Reaktionshastighedens afhængighed af enzymets koncentration 3. Reaktionshastighedens afhængighed af substratets koncentration 4. Påvirkning af enzymaktiviteten med EDTA 5. Enzymaktivitetens afhængighed af ph Undersøgelser af hastigheden hvormed enzymer udfører deres funktion kaldes enzymkinetik.
Arbejdsregler Overtøj og tasker er ikke tilladt i laboratoriet dette efterlades i garderoben. Der anvendes kittel i laboratoriet. Indtagelse af mad og drikke i laboratoriet er strengt forbudt. Brug engangshandsker som beskyttelse mod farlige materialer, såsom para nitrofenolfosfat. Affald sorteres som følger: Sorte affaldssække bruges til almindeligt affald, små affaldsbeholdere på bordene anvendes til spidse ting såsom pipettespidser og plastic kuvetter, glasaffald bortskaffes separat. Mikropipetter Der anvendes tre forskellige typer: P20 (2 20 µl), P200 (20 200 µl) og P1000 (100 1000 µl) Spektrofotometer Består grundlæggende af en lyskilde (med styring af bølgelængden af det indgående lys), en kuvetteholder og en detektor. Lyskilden sender lys gennem en kuvette, indeholdende den opløsning absorbansen ønskes målt på, og detektoren måler hvor stor en del af det indgående lys der absorberes i prøven. Spektrofotometeret indstilles til måling ved 410 nm og nulstilles (Set ref) med en referenceopløsning (buffer). Lysvejen i kuvetten er 1 cm (d). Materialer og udstyr Buffer (Tris ph 8,3), alkalisk fosfatase (0,025 mg/ml), para nitrophenylfosfat (5 mm), 0,1 M EDTA, Bufre med varierende ph (6.0; 7.1; 9.3; 10.2) Plast kuvetter, Spektrofotometer, parafilm, pipetman (P20, P200, P1000). Fremgangsmåde I alle forsøgene bruges forkortelserne ALP (alkalisk fosfatase) og NPP (para nitrophenylfosfat) Start med at klippe parafilm i ca. 2 2 cm stykker. Der skal bruges mange af disse stykker, så bare klip løs. Forsøg 1a. Tidsforløb af reaktionen med enzym
Pipetter 880 µl Tris buffer ned i en plast kuvette og dernæst 100 µl NPP. Dæk mundingen af kuvetten med et stykke parafilm, sæt tommelfingeren på så parafilmen slutter tæt til kuvetten og vend den 4 5 gange for at blande indholdet. Sæt kuvetten i spektrofotometeret uden parafilm, luk låget og mål absorbansen ved 410 nm (A410). Den ene person på holdet pipetterer nu 20 µl ALP ned i kuvetten, sætter parafilm på, blander som før, sætter kuvetten i spektrofotometeret og lukker låget. Med lidt øvelse kan dette gøres på under 15 sekunder. I det øjeblik ALP pipetteres ned i kuvetten starter den anden person på holdet stopuret. Nu er enzymreaktionen i gang, og efter 30 s tages den første aflæsning af A410. Målingerne fortsættes med målinger hvert 15. s de første 2 min, derpå hvert minut frem til 10 min. Forsøg 1b. Tidsforløb af reaktionen uden enzym Forsøget laves som forsøg 1a, men med Tris buffer i stedet for ALP. Der tages kun målinger over 120 s. Forsøg 1a. Forsøg 1b. Tris buffer 880 µl Tris buffer 880 µl NPP 100 µl NPP 100 µl ALP 20 µl Tris buffer 20 µl Tid A410 Tid A410 Før NPP Før Tris 30 s 30 s 45 s 45 s 60 s 60 s 75 s 75 s 90 s 90 s 105 s 105 s 120 s 120 s 3 min 4 min Ingen målinger efter 120 s. 5 min 6 min 7 min 8 min 9 min 10 min Forsøg 2. Reaktionshastighedens afhængighed af enzymets koncentration
Fremgangsmåden er som ved forsøg 1. Der måles i 120 s på tre separate blandinger. Se mængder i tabellen nedenfor. 1 2 3 Tris buffer 880 µl Tris buffer 890 µl Tris buffer 895 µl NPP 100 µl NPP 100 µl NPP 100 µl ALP 20 µl ALP 10 µl ALP 5 µl Tid A410 Tid A410 Tid A410 30 s 30 s 30 s 45 s 45 s 45 s 60 s 60 s 60 s 75 s 75 s 75 s 90 s 90 s 90 s 105 s 105 s 105 s 120 s 120 s 120 s [ALP] (µ g/ml) V( A410/min) Forsøg 3. Reaktionshastighedens afhængighed af substratets koncentration Fremgangsmåden er igen som ved forsøg 1. Der måles også her i 120 s, men på 8 forskellige blandinger. Mængderne ses i tabellen. 1 2 3 4 5 6 7 8 Tris buffer 880 µl 930 µl 955 µl 968 µl 971 µl 975 µl 977 µl 978 µl NPP 100 µl 50 µl 25 µl 12 µl 9 µl 5 µl 3 µl 2 µl ALP 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl Tid A410 A410 A410 A410 A410 A410 A410 A410 30 s 45 s 60 s 75 s 90 s 105 s 120 s [NPP] (µm) V ( A410/min) Forsøg 4. Påvirkning af enzymaktiviteten med EDTA
EDTA er en forbindelse, der kan binde divalente metalioner, såsom Zn 2+ meget kraftigt. Det vil sige at EDTA kan fjerne Zn 2+ fra enzymer der har en sådan cofaktor bundet. Forsøget udføres ved først at blande Tris buffer og EDTA i en kuvette. ALP tilsættes og blandingen tillades at reagere i mindst 10 min, hvorefter A410 måles. Så tilsættes NPP, kuvetten vendes med parafilm og A410 aflæses som i de andre forsøg. Følg skemaet nedenfor. Tris buffer 780 µl EDTA 100 µl NPP 100 µl ALP 20 µl Tid 30 s 45 s 60 s 75 s 90 s 105 s 120 s V ( A410/min) A410 Forsøg 5. Enzymaktivitetens afhængighed af ph I enzymers reaktive center er der ofte være aminosyresidekæder med syre baseegenskaber, dvs. at de kan afgive eller optage hydroner (H + ). Det kan påvirke enzymets binding af substratet og/eller dets katalytiske egenskaber. Her udføres forsøgene som i forsøg 1, men med bufre med forskellige ph værdier. Se skemaet. Buffer ph 6.0 ph 7.1 ph 8.3 ph 9.3 ph 10.2 880 µl 880 µl 880 µl 880 µl 880 µl NPP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl ALP 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl Tid A410 A410 A410 A410 A410 30 s 45 s 60 s 75 s 90 s 105 s 120 s V ( A410/min) Efterbehandling til de enkelte forsøg
Forsøg 1. Tidsforløb af reaktionen Afbild A410 som funktion af tiden. Lav begge kurver fra forsøget i det samme koordinatsystem. Forsøg 2. Reaktionshastighedens afhængighed af enzymkoncentrationen Afbild de tre måleserier i det samme koordinatsystem med A410 som funktion af tiden. Beregn desuden reaktionshastigheden, V, som forskellen mellem A410 værdierne ved 90 s og 30 s. Dette kan udtrykkes som A410/min. Beregn dernæst enzymkoncentrationerne i de tre prøver. Her beregnes først mængden af enzym der er tilsat kuvetten (c(stam) v(stam)) og dernæst koncentrationen i kuvettens totale volumen (enzym mængde/v(total). Reaktionshastigheden afbildes som funktion af enzymkoncentrationen. Forsøg 3. Reaktionshastighedens afhængighed af substratkoncentrationen Beregn reaktionshastigheden V, for alle prøver som ved forsøg 2. Beregn dernæst substratkoncentrationen i hver prøve. Her beregnes først stofmængden af tilsat substrat (n= c(stam) v(stam)) og dernæst koncentrationen i kuvettens totale volumen (c=n/v(total)). Reaktionshastigheden afbildes som funktion af substratkoncentrationen. Denne afbildning kaldes en Michaelis Menten kurve. Fra kurven kan de to konstanter, K M og V max bestemmes. V max bestemmes som den maksimale værdi hastigheden går mod. K M bestemmes som den substratkoncentration, der giver en hastighed der er det halve af V max. Det kan være svært at aflæse på en Michaelis Menten kurve. Derfor kan det være en fordel at lave et såkaldt Lineweaver Burk plot, hvor man opnår en ret linie ud fra resultaterne. Forsøg 4. Påvirkning af enzymaktiviteten med EDTA Afbild A410 som funktion af tiden for dette forsøg. I samme koordinatsystem indtegnes A410 for de første 120 s fra forsøg 1a. Beregn reaktionshastigheden V for både forsøg 4 og forsøg 1b. Forsøg 5. Enzymaktivitetens afhængighed af ph Beregn reaktionshastigheden V for alle ph værdier som ved forsøg 2. Afbild reaktionshastigheden som funktion af ph.