Fungicid fra rejer Projekt nr. P99088 Nordisk Industrifond Slutrapport September 2001 Et nordic wood projekt. Teknologisk Institut Bioteknik Ole Frederiksen 2001.11.27 1
Forord: Nordic Wood er den nordiske træindustris forsknings- og udviklings program, med en målsætning om, at anvendelsen af træ skal øges. Programmet finansieres af den nordiske industri, Nordisk Industrifond, Skov- og Naturstyrelsen, Danmark, Norges Forskningsråd og Vinnov (Verket för innovationssystem) i Sverige. Det er kendt, at et stof der kan udvindes af rejeskaller, chitosan, har fungicid virkning. Det er i dette projekt undersøgt, om dette forhold kan udnyttes til træbeskyttelse. Der er i projektet lagt særlig vægt på, at undersøge mulighederne for at fiksere stoffet i træ, så dette ikke udvaskes. Parterne i projektet er på udviklingssiden Norsk Treteknisk Institutt, ved Fred Evans, Sveriges Provnings- och Forskningsinstitut ved Jöran Jermer og Dansk Teknologisk Institut, Bioteknik ved Anne Pia Kock og Ole Frederiksen. På industrisiden deltog Primex Ingredients A/S, Norge, ved Thorbjørn Toppe senere afløst af Bjarte Langhelle; Royal Greenland, Danmark ved Charles Kastberg Christiansen, og PLUS A/S ved Gert Knudsen Styregruppen har bestået af Thorbjørn Toppe senere afløst af Bjarte Langhelle, Primex A/S og Gert Knudsen, PLUS A/S Projektet er finansieret af Nordisk Industrifond, Nordic Wood 2 programmet, Skov- og Naturstyrelsen, Danmark og Norges Forskningsråd i Norge samt Vinnov i Sverige. 2
Indhold Indhold... 3 Indledning... 4 Baggrund... 6 Status... 8 Screening...10 Chitosans fixering på cellulose...12 Måling af chitosan...15 Undersøgelse af fixering i træ...17 Yderligere forsøg...17 Pinus sylvestris...18 Modificeret EN 113...20 Chitosans effekt overfor skimmelsvampe og blåsplint...22 Chitosans effekt overfor alger...25 Litteratur...29 3
Formål Det er projektets formål at gennemføre undersøgelser, der skal optimere og dokumentere chitosans muligheder som træbeskyttelsesmiddel, med speciel vægt på chitosans fixering i træ, så dette sikres mod udvaskning. 4
Indledning Det er kendt, at et stof der kan udvindes af rejeskaller, chitosan, har fungicid virkning.(ghaouth, 1992, Ghaouth, 1994, Hadwiger, 1995) Vi vil i det følgende gennemgå de undersøgelser, der er gennemført for at undersøge mulighederne for at udnytte dette forhold til træbeskyttelse. Undersøgelserne blev i første omgang gennemført som en screeningsundersøgelse af, om der var forskel på de forskellige chitosantypers fungicide effekt. Disse undersøgelser blev gennemført som hæmningstests på maltagar. Der blev herefter udviklet en metode til kvantificering af chitosan i opløsning, hvorefter mulighederne for at binde chitosan til cellulose og træ blev undersøgt og optimeret. Endelig kunne chitosans effekt som træbeskyttelsesmiddel over for trænedbrydende svampe undersøges. Slutteligt blev det undersøgt om chitosan har effekt på vækst af skimmelsvamp og blåsplint samt alger. Det har undervejs i projektet vist sig, at chitosan har god effekt på trænedbrydende svampe, når disse vokser på næringsmedier, men at stoffet ikke er i stand til at beskytte træ tilstrækkeligt, når stoffet er imprægneret ind i træet. Der er i projektet lagt vægt på at undersøge mulighederne for at fiksere stoffet i træ. I denne rapport er baggrund og samtlige undersøgelser med valg af metode, gennemgang af resultater og konklusioner. 5
Baggrund Teknologisk Institut i Danmark har tidligere beskrevet et aktivstof til træbeskyttelse, der kan fremstilles ud fra rejeskaller. Dette stof har vist sig at have forebyggende effekt mod trænedbrydende svampe (Miljøprojekt nr. 424, 1998: 2-deoxy-D-glucose i bekæmpelsesmidler til byggematerialer). Stoffet i vandig opløsning er blevet testet og opfylder effektivitetskravene i den europæiske normtest for træbeskyttelsesmidler: EN 113 (Determination of toxic values of wood preservatives against wood destroying basidiomycetes cultured on agar medium) også efter en kunstig ældningstest EN 73 efterfulgt af EN 113. Kravene efter en udvasknings-test - EN 84 efterfulgt af EN 113 blev dog ikke opfyldt. Der var derfor behov for udvikling af fixeringsmetoder, før dette kunne opnås. Arbejdet med dette aktivstof og undersøgelse af litteratur om chitosans fungicide virkninger sandsynliggjorde et potentiale som aktivstof i imprægneringsmidler mod trænedbrydende svampe for svampemidler. Det primære problem, der skulle løses, før stoffet kunne bringes i anvendelse, syntes at være fixeringen i træet snarere end effekten. Derfor fokuseredes der i dette projekt på fixeringen af svampemidlet. Fokus i projektet blev flyttet over på udnyttelsen af chitosan som aktivstof, på bekostning af 2-deoxy-D-glucose, idet litteraturen viser, at chitosan kan adsorbere til cellulose. Rejeskaller, der er et affaldsprodukt fra rejeindustrien, er i et vist omfang stadig et problem, bl.a. må det i Norge ikke mere dumpes i havet. Der er nu opført fabrikker, der kan forarbejde rejeskaller dels til rejeskalmel, dels til forædling. Produktet af forædlingen er her primært chitosan. Det stof i rejeskaller, der kan omdannes til aktivstof, er chitin. Dette stof er en polymer af acetyleret glucosamin. Chitin bliver ved syrebehandling deacetyleret, og bliver herved til chitosan. Det har vist sig, at chitosan har en hæmmende effekt over for mikroorganismer ikke mindst svampe. Det er i dette projekt undersøgt, om denne effekt kunne udnyttes til træbeskyttelsesformål. Desuden har chitosan den egenskab, at det er en positivt ladet polymer. Det er bl.a. dette forhold, der medfører, at chitosan kan adsorbere på cellulose. Cellulose, der jo er en væsentlig del af træet, har en negativt ladet overflade. Den elektrostatiske interaktion imellem cellulose og chitosan spiller hermed en vigtig rolle i chitosans adsorption til cellulose (Roberts, 1992). Dette fænomen udnyttes i papirindustrien, hvor chitosan ved denne mekanisme anvendes til at gøre papir elektrisk neutralt ved at adsorbere til alle de anioniske steder på fiberoverfladen (Roberts, 1992). 6
Hvis mængden af chitosan, der kan bindes til cellulose, primært er afhængig af den elektrostatiske interaktion, vil mængden af chitosan, der kan bindes til cellulose, kunne øges, hvis ladningstætheden i chitosanen sænkes, idet hver chitosankæde vil neutralisere færre aniongrupper på cellulosen. Denne reduktion i ladningstætheden kan opnås ved at øge ph eller ved at øge graden af acetylering. Der nævnes i samme reference (Roberts, 1992), at ph-optimum for adsorption til cellulose er 8,2. En anden faktor, der har betydning for mængden af chitosan, der kan adsorberes til cellulosen, er størrelsen på chitosanen. Det må forventes, at chitosan med en lav molekylevægt kan trænge længere ind i træet, hvorimod højmolekylært chitosan ikke kan forventes at kunne trænge ind i substratet. (Roberts, 1992). Der er da også fundet en omvendt proportionalitet mellem chitosanens molekylevægt og den mængde, der kan adsorbere til cellulose (Roberts, 1992). Chitosans virkemåde som svampemiddel er tilsyneladende, at polymerer på syv monomerer og derover er i stand til at hæmme RNA syntesen hos i hvert tilfælde nogle svampe (Hadwiger, 1985). Der er også rapporter om antibakteriel effekt af chitosan. Her er teorien, at det er cationer på chitosans overflade, der binder til anioner på bakteriens overflade, og herved ændrer cellemembranens permeabilitet (Anonym, 1999). Det har ikke været muligt at finde referencer direkte på chitosan alene anvendt som træbeskyttelsesmiddel. En undersøgelse af chitosan som indkapslingsmedum til de trænedbrydende (hvidmuldsdannende) svampe Coriolus versicolor og Irpex lacteus har vist, at disse to svampe slet ikke kan vokse på en hydrogel dannet af chitosan gelatineret med 5% Na-polyphosphat. Der findes en mængde undersøgelser af chitosans fungicide effekt på plantepatogene svampe. Eksempelvis er chitosan i en koncentration på 6 gram pr. liter i stand til at hæmme spiringen af sporer af skimmelsvampen Botrytis cinerea med 98,7% og hæmning af radial vækst med over 95%(Ghaouth, 1992). Chitosan er i stand til fuldstændig at stoppe væksten af den plantepatogene svamp Pythium aphanidermatum i en koncentration på 400 µg pr. ml. (Ghaouth, 1994). 7
Opsummering Vi har i dette projekt undersøgt mulighederne for at anvende chitosans fungicide virkning til træbeskyttelse. Litteraturen beskriver chitosan som særdeles effektivt over for svampe. Undersøgelser i litteraturen viste også, at det var muligt at binde chitosan til cellulose ved elektrostatisk interaktion idet chitosan er negativt ladet, og cellulose er positivt ladet. Vore undersøgelser har vist, at chitosan blandet i maltagar er relativt effektivt over for trænedbrydende svampe. Ægte Hussvamp stoppes fuldstændig af chitosan i en koncentration på 1 g pr. liter maltagar, Gul Tømmersvamp opnår en vækst på 25 % af en kontrol uden chitosan ved en chitosankoncentration på 1 g pr. liter maltagar, mens Broget Læderporesvamp opnår en vækst på 40 % ved samme koncentration. Et biologisk assay viste, at chitosan kan bindes til cellulose (filterpapir) og bevarer vedhæftningen hertil under udvaskning. Et assay til måling af chitosan i opløsning blev udviklet. Dette assay viste sig dog at være meget følsomt over for komponenter, der blev vasket ud af træ og måtte derfor opgives. Et biologisk assay af chitosans fixering i træ blev anvendt, og det viste sig her, at der var for stor nedbrydning af de imprægnerede og udvaskede træklodser. I en tillempet EN 113 test uden udvaskning, viste det sig, at chitosan, når det er imprægneret i træ ikke kan hæmme svampes nedbrydning af dette sandsynligvis fordi svampene, når de vokser på træ, udskiller stoffer, der er i stand til at nedbryde eller detoxificere chitosan. En undersøgelse af chitosans potentiale som overfladebehandlingsmiddel til at stoppe vækst af skimmelog blåsplintsvampe blev herpå gennemført. Der var en vis, om end utilstrækkelig effekt af chitosan. En undersøgelse af chitosans potentiale som middel mod algevækst viste også, at effekten ikke er tilstrækkelig. Projektgruppen besluttede herefter at afslutte projektet ca. 15 måneder før planlagt, idet det blev vurderet, at resultaterne ikke har en karakter, der sandsynliggør, at der kan opnås anvendelige resultater ved yderligere forsøg i projektperioden. 8
Summary In this project we have investigated the possibilities of using the fungicide effect of Chitosan for wood protection. The literature describes Chitosan as being especially effective on fungi. Research work in the literature also showed that it was possible to bind Chitosan to cellulose by electrostatic interaction as Chitosan is negatively charged, and cellulose is positively charged. Our research has shown that Chitosan mixed with malt agar is relatively effective to wood decaying fungi. Serpula lacrymans is stopped totally by Chitosan in a concentration of 1 g/l malt agar, Coniophora puteana have a growth of 25% of a control without Chitosan with a Chitosan concentration of 1 g/l malt agar, whereas Coriolus versicolor has a growth of 40% at the same concentration. A biological assay showed that Chitosan can be bound to cellulose (filter paper) and keeps the attachment under washing. An assay for measurement of Chitosan in a solution was developed. However, this assay turned out to be very sensitive to components washed out of wood and consequently it had to be abandoned. A biological assay of the fixation of Chitosan in wood was used, and here it turned out that the decay of the preserved and washed wood blocks was too high. In an adapted EN 113 test without washing it turned out that Chitosan, when preserved in wood, cannot obstruct the fungal decay of the wood probably because the fungi, when they grow on wood, liberates compounds that are able to break down or detoxify Chitosan. A research of the potential of Chitosan as a surface preservation agent to stop growth of mould and blue stain was then made. It showed a certain, yet unsatisfactory effect of Chitosan. A research of the potential of Chitosan as an agent against growth of algae also showed that the effect was not satisfactory. The project group then decided to end the project approx. 15 months before scheduled as it was estimated that the results do not have a character that makes it probable that any u- sable results can be achieved by further experiments in the project period. 9
Screeningsundersøgelse Screening De første undersøgelser, der blev gennemført var en screening af, hvilke typer af chitosan, der havde den største toxiditet over for trænedbrydende svampe. To brunmuldsdannere, nemlig Ægte Hussvamp (Serpula lacrymans) og Gul Tømmersvamp (Coniophora puteana) samt en hvidmuldsdanner, nemlig Broget Læderporesvamp (Coriolus versicolor) blev udvalgt til testen. Kriteriet for udvælgelse af koncentrationer af chitosan var, hvad der ville væ re økonomisk konkurrencedygtigt i forhold til de eksisterende aktivstoffer. Metode Microbial Inhibitory Test hæmning af svampevækst på vækstmedium blandet med chitosan blev gennemført. Chitosan i forskellige koncentrationer blev iblandet en maltagaropløsning og hældt på petriskåle, der efter størkning blev podet med svamp, hvorefter vækstdiameteren dagligt blev målt. Der blev anvendt 6 forskellige slags chitosan, mærket TD 018, TMD 029, TM 296, TM 615, TM 727, TM 772. Forskellen bestod dels i forskelle i deacetyleringsgrad, dels i størrelse af molekylerne. Chitosanen blev opløst i 0,1 M eddikesyre under opvarmning og omrøring. Efter opløsning blev der justeret med 4 M og 1 M NaOH til ph 7. De færdige chitosanopløsninger blev strømmet (opvarmet til 100 C uden tryk) i 30 minutter, og derefter blandet med en autoklaveret maltagarblanding. Det var ikke muligt at blande chitosanopløsning og maltagarblanding inden autoklavering, da chitosanen herved bundfældedes. De færdige koncentrationer af chitosan var 1 g/l, 0,5 g/l og 0,1 g/l. Petripladerne blev podet med frisk mycelium fra hver af de tre forskellige trænedbrydende svampe. Der blev lavet 3 replika af hver svamp, for hver chitosankoncentration og derudover også en kontrol uden chitosan. Inkuberingen foregik ved RH 70 % og 20 C. Efter en lagfase blev vækstdiameteren målt dagligt i to retninger, vinkelret på hinanden. Resultat Resultaterne for undersøgelsen af koncentrationen på 1 g chitosan pr. l. er gengivet i det følgende. Bemærk at nogle linier kan være sammenfaldende, og derfor ikke til at skelne fra hinanden. Dette gælder f. eks. Ægte Hussvamp, hvor der ikke var vækst ved nogen type af chitosan. 10
Ægte Hussvamp, 1 g/l. 12 10 VÆKST(mm) 8 6 4 TD 018 TMD 029 TM296 TM 615 TM727 TM 772 KONTROL 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 DAG Gul Tømmersvamp, 1 g/l. 30 25 VÆKST(mm) 20 15 10 td 018 tmd 029 tm 296 tm 615 tm 727 tm 772 kontrol 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 DAG 11
Broget læderporesvamp, 1 g/l. 45 40 35 VÆKST(mm) 30 25 20 15 TD 018 TMD 029 TM296 TM615 TM 727 TM 772 KONTROL 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 DAG Diskussion og konklusion Ægte Hussvamp hæmmes fuldstændigt ved en chitosankoncentration på 1 g/l. Ved tilsætning af 1 g chitosan pr. l. vækstmedium hæmmes Gul Tømmersvamp med ca. 75% i forhold til kontrollen uden chitosan. Der er ikke væsentlig forskel på effekten af de forskellige chitosantyper. Ved tilsætning af 1 g chitosan pr. l. vækstmedium hæmmes Broget Læderporesvamp med ca. 60% i forhold til kontrollen uden chitosan. Der er ikke væsentlig forskel på effekten af de forskellige chitosantyper. Ved chitosankoncentrationer på 0,5 g/l kunne der kun hos Ægte Hussvamp ses væsentlig reduktion, nemlig en hæmning på ca. 90% af kontrollen, mens Gul Tømmersvamp og Broget læderporesvamp havde en hæmning på 10-40 % af kontrollen uden chitosan. Ved chitosankoncentrationer på 0,1 g/l kunne der ikke ses betydende reduktion af væksten i forhold til kontrollen uden chitosan. 12
Chitosans fixering i cellulose På basis af ovenstående undersøgelser blev chitosans fixering til cellulose undersøgt ved et biologisk assay. Metode 50µl opløsning af chitosan (2g/l) i 01 M eddikesyre bufret ved ph 5, blev pipetteret ud på cellulose filterpapir (Whatman nr. 1) med en diameter på 1,1 cm. På halvdelen af disse filterpapirer blev der herefter pipetteret 50 µl 0,1 M Tris/HCl buffer, ph 8,2. (Dette er ph-optimum for den elektroniske interaktion mellem chitosan og cellulose) (Roberts, 1992). Halvdelen af filterpapirerne blev vasket ud ved at ligge 12 timer i ledningsvand. Filterpapirerne placeredes herefter på petriskåle med maltagar (40 g malt/l, 25 g agar/l) Der er tre replica med kontroller uden chitosan. Efter placering af filterpapirerne på maltagaren sprayedes en sporesuspension af skimmelsvampen Aspergillus niger ud over petriskålene. Skålene blev herefter placeret i klimakammer med RH 70 % og 20 C. I denne undersøgelse blev den mest langkædede type af chitosan - TD018 - og den mest kortkædede type TM615 - brugt. Efter en måned blev væksten på skålene evalueret efter følgende skala: 0 svarer til ingen vækst på filterpapiret 1 betyder vækst, men mindre end halvdelen af papiret er dækket af svamp 2 betyder at mere end halvdelen, men ikke hele filterpapiret er dækket af svamp 3 betyder, at hele filterpapiret er dækket af svamp. 13
Control of chitosan fixation to cellulose 3,5 3,0 Degree of growth of A. niger 2,5 2,0 1,5 1,0 TD018 TM615 Control 0,5 0,0 -fix/-leaching -fix/+leaching +fix/-leaching +fix/+leaching +/- fixation and leaching Resultat: Resultaterne (gennemsnit af de tre replica) viser, at A. niger hæmmes af chitosan hvad enten dette er den kortkædede eller den langkædede form. Et biologisk assay som dette vil altså kunne vise indhold af chitosan. Uden et fixeringstrin er der stadig en smule chitosan tilbage på cellulosen, efter udvaskningsproceduren, da væksten stadig er noget hæmmet i forhold til kontrol uden chitosan. Fixeringstrinnet, hvor ph hæves til 8,2, sænker chitosans toxiditet, specielt for TM615, den korte kæde af chitosan. Efter udvaskningen er der stadig hæmning en smule bedre hæmning end efter udvaskning uden fixering. Effekten på toxiditeten af den højere ph værdi på TM615 er også forsvundet efter udvaskningen. Diskussion og konklusion Konklusionen er, at vækst af Aspergillus niger på cellulose på maltagar hæmmes næsten totalt af chitosan, og at der er en positiv effekt på fixering af at hæve ph til 8,2 i cellulosen inden denne udvaskes. 14
Måling af chitosan efter fixering i træ Ved undersøgelse af chitosans binding til træ og andre materialer vil det være en stor fordel, hvis mængden af chitosan i f. eks. udvaskningsvand kan måles. Dette vil betyde, at det ikke vil være nødvendigt at benytte den langsomme og relativt dyre (arbejdskrævende) metode som et biologisk assay er. I dette tilfælde skal træ imprægneres med chitosan, og herefter eventuelt fixeres og udvaskes. Hvis der kan findes en metode til måling af koncentration af chitosan i opløsning vil vi kunne måle koncentrationen i udvaskningsvandet. Alternativet til disse målinger er, at træklodserne udsættes for vækst af trænedbrydende svampe, så effekten af imprægnering kan ses direkte på svampenes nedbrydning af træet. Denne sidste metode til undersøgelse af fixering er selvsagt langsommelig, idet der må regnes med en inkubering på svamp i 16 uger før vi kender effekten af imprægnering, fixering og udvaskning. Der findes imidlertid ingen metoder til analyse af chitosan koncentration i opløsning, hvorfor en sådan metode måtte udvikles. Det vides, at nogle farvestoffer, eksempelvis Erytrosin B, kan farve chitin, den fuldt acetylerede type af chitosan. Chitin er imidlertid uopløselig i vand. Den primære ide i udviklingen at dette assay var, at tilsætte farve (Erytrosin B) til opløsninger af chitosan (ved ph-værdier under 5, hvor chitosan er fuldt opløseligt) i en række kendte koncentrationer, bundfælde chitosanen ved at hæve ph til 9, hvor chitosan er uopløseligt. Ved tilstedeværelse af farve i denne proces er forventningen, at der bindes farve til chitosan, når denne bringes på uopløselig form. Herved kan der fjernes en farvemængde, der er proportional med den mængde chitosan der udfældes. Hermed kan chitosankoncentrationen i en opløsning kvantificeres ved at måle ændring i farveintensitet efter at ph er hævet og chitosan/farvekomplex er bundfældet ved nedspinning. Vi kan altså måle absorbansen på supernatanten, og derudfra fremstille en standardkurve ud fra en række kendte koncentrationer af chitosan. Jo mere farve supernatanten indeholder, jo mindre farve vil være bundet til chitosan, dvs. jo mindre chitosan vil den givne væske have indeholdt. Når man så har en væske med en ukendt koncentration af chitosan, kan man måle absorbansen af denne, og derefter aflæse koncentrationen af chitosan på standardkurven. Metode Chitosantype TD 018, TMD 029 og TM 615 i koncentrationerne 10 g/l; 1 g/l; 0,5 g/l; 0,1 g/l; 0,05 g/l; 0,02 g/l; O,1 M eddikesyre, ph 5 Erytrosin B, 90 mg/l. Trisbuffer 0,1 M ved ph 7, ph 8 og ph 9 15
Fremstilling af standardkurve Til hver prøve (opløsning af chitosan) blev der tilsat 2 ml Trisbuffer, 2 ml erytrosin B 90 mg/l og 2 ml chitosanopløsning i en kendt koncentration. Til reference blev der tilsat 2 ml eddikesyre i stedet for chitosanopløsning. Hver prøve blev whirlymixet, derpå sat på rystebord ved 70-80 rpm. i 1 time og derefter whirlymixet igen. Herefter forventes det, at al den farve, der kan bindes til chitosanen, er bundet. Herefter bundfældes chitosan med farve ved nedspinning: 15000 rpm. i 15 min. Til sidst blev der målt absorbans på supernatanten. Ved måling af absorbans på udvaskningsvæskerne, blev den samme fremgangsmåde anvendt som ved absorbansmålingerne til standardkurven. Resultat: Ved fremstillingen af standardkurverne kunne der opnås korrelationskoefficienter på over 0,99 ved ph 9 for alle undersøgte typer af chitosan og korrelationskoefficienter på over 0,95 ved ph 8 for alle undersøgte typer af chitosan. Ved ph 7 var korrelationskoefficienterne på under 0,95. Diskussion og konklusion Metoden virker altså glimrende ved opløsning af chitosan i 0,1 M eddikesyre i vand, hvis ph hæves til over 8. Vi kunne herefter konkludere, at metoden måtte være brugbar til undersøgelse af chitosanindholdet i det vand, der benyttes til at udvaske chitosanimprægnerede træklodser, til undersøgelse og optimering af chitosanets fixering i træ. ph 9 blev anvendt ved undersøgelse af udvaskningsvandet fra imprægnerede og udvaskede træklodser. 16
Undersøgelse af fixering i træ Metode En modificeret EN 84 test blev anvendt til undersøgelse af chitosans fixering i træ. EN 113 klodser af fyrresplint (Pinus sylvestris) og bøg(fagus sylvatica) blev imprægneret med chitosan 10 g/l. ved ph 5. Konditioneringen af klodserne fulgte anvisningerne givet i EN 113. Efter konditionering blev halvdelen af klodserne udsat for et fixeringstrin, hvor klodserne blev imprægneret i en 0,1 M Trisbuffer, ph 9. Konditionering efter fixering fulgte anvisninger givet i EN 113. Herefter blev alle klodser udvasket iht. anvisninger givet i EN 84, og udvaskningsvandet blev bevaret, så chitosanindholdet kunne måles i dette. Resultat I den her beskrevne udvaskningsprocedure er det sandsynligt, at der er vasket stoffer ud af træet, som indfluerer på det assay, der tidligere er omtalt. Der kunne ikke opnås tilstrækkelig sikkerhed for, at de koncentrationer, der kunne måles, var de rigtige. Yderligere undersøgelse af fixering Udvikling af det ovenfor beskrevne assay blev undersøgt ved imprægnering af træklodser med chitosan og direkte herefter målinger af vægtforøgelse samt tørring til konstant vægt og registrering af tørvægtforøgelse. Vi havde hermed et mål for, hvor meget chitosan der var optaget i klodserne. Klodserne blev herefter slebet halvt igennem. Slibestøvet blev placeret i 0,1 M eddikesyre i rystebord i en time, hvorefter slibestøvet blev spunnet ned, og chitosanindholdet i supernatanten blev undersøgt. Op til 27 % af den forventede mængde chitosan i dette assay kunne genfindes. En yderligere procedure, hvor chitosanet blev fældet ud og spunnet ned, hvorefter supernatanten med eventuelle opløste stoffer fra træet kunne fjernes, blev gennemført. Denne ekstra procedure forbedrede dog ikke genfindingen af chitosan. Diskussion og konklusion Denne metode blev herefter opgivet til dette formål, i det de lave koncentrationer af chitosan og den lave genfindingsprocent gør, at disse metoder til hurtig undersøgelse af fixering måtte opgives. Det blev herefter besluttet undersøge fixeringen i et biologisk assay. 17
Biologisk assay af fixering af chitosan De træklodser, der var imprægneret med chitosan og herpå udvasket (oprindeligt med henblik på at undersøge chitosankoncentrationen i udvaskningsvandet), blev herefter undersøgt i et biologisk assay, hvor det blev undersøgt, om der var forskel i nedbrydningen af træklodserne, afhængigt af om chitosanet var fixeret (ved at øge ph til 8,2 i træet) eller ej. Klodserne blev eksponeret for trænedbrydende svampe og inkuberet i 16 uger iht. EN113, men kun med to svampe, nemlig Gul Tømmersvamp (Coniophora puteana) og Broget Læderporesvamp (Coriolus versicolor). Vægttab kontrol viser vægttabet i de uimprægnerede klodser, der ligger ved siden af de imprægnerede klodser. Resultat: Chitoclear TD018 (lang polymer af chitosan): Træart Svamp Udvaskning Fixering Vægttab (%) Vægttab, kontrol (%) Pinus sylvestris Coniophora + - 6 8 puteana Fagus sylvatica Coriolus Versicolor + - 21 25 Coniophora + + 8 8 puteana Pinus sylvestris Fagus sylvatica Coriolus Versicolor + + 24 25 Chitoclear TM615 (kort polymer af chitosan): Træart Svamp Udvaskning Fixering Vægttab (%) Vægttab, kontrol (%) Pinus sylvestris Coniophora + - 10 13 puteana Fagus sylvatica Coriolus + - 23 28 versicolor Pinus sylvestris Coniophora + + 9 7 puteana Fagus sylvatica Coriolus versicolor + + 27 27 18 Diskussion og konklusion Vægttabet i de imprægnerede klodser er meget højt og meget langt fra acceptabelt iht. EN 113. I EN 113 defineres et godt resultat som værende, når gennemsnitlige vægttab er under 3% og ingen emner overstiger 5% vægttab. Sammenlignet med den hæmning der kunne ses i vor microbial inhibitory test og fixeringsundersøgelsen på ren
cellulose, er vægttabet meget højt og ikke umiddelbart forklarligt. Det ses endvidere at brunmuldsdanneren Gul Tømmersvamp, Coniophora puteana, i kontrollen ikke kan nedbryde fyrreklodserne til det sædvanlige niveau. Dette kan skyldes, at dette individ af svampen har nået et stadium, hvor den ikke længere er så aktiv som den plejer alene af denne grund må denne undersøgelse forkastes. Den ringe nedbrydning i kontrollen kan også skyldes, at der fra den imprægnerede klods er en afdunstning, som Gul Tømmersvamp ikke kan tåle. Denne forklaring er dog ikke sandsynlig, da der ikke umiddelbart er flygtige stoffer i imprægneringsvæsken. Forklaringen på det store vægttab i de imprægnerede klodser kunne skyldes ringe toxiditet af chitosan i træ, eller det kunne skyldes, at chitosanet mod forventning blev vasket ud, og altså ikke kunne bindes til cellulose i træ. 19
Modificeret EN 113 Det blev herefter undersøgt, om ovenstående forhold skyldes manglende fixering eller manglende toxiditet af chitosan i træet. Dette blev gjort ved imprægnering af træklodser med chitosan og uden udvaskning. Klodserne blev herefter udsat for vækst af svampe (Gul Tømmersvamp, Coniphora puteana eller Broget Læderporesvamp, Coriolus versicolor) i 10 uger. Denne test ville afsløre eventuel manglende toxiditet af chitosan i træ. Metode Halve EN 113 klodser imprægneres med chitosan. Klodserne har dimensionerne 50 mm x 25 mm x 7,5 mm. Der er i alle tilfælde benyttet klodser af fyrresplint, Pinus sylvestris. Efter imprægnering og iht. EN 113 med koncentrationer på 0; 1; 2; 3; eller 4 gram chitosan pr. liter imprægneringsvæske (0,1 M eddikesyre) og efterfølgende konditionering blev klodserne udsat for vækst af enten Gul Tømmersvamp, Coniphora puteana eller Broget læderporesvamp, Coriolus versicolor i 10 uger. Der undersøgtes to typer af chitosan en langkædet (TD018) og en kortkædet, TM615. Denne modificerede form af EN 113 er valgt, fordi den er hurtigere end en fuld EN 113, og alligevel giver brugbare indikationer af toxiditeten i en screeningssituation. Resultat Modificeret EN 113/EN 84 50 Vægttab % 40 30 20 10 0 EN 113 C. versicolor EN 113 + EN 84 C. Versicolor En 113 C. puteana 0 1 2 3 4 Kontrol Koncentration af chitosan (TM615) (g/l) EN 113 + EN 84 C. puteana 20
Modificeret EN 113 /EN 84 Vægttab % 40 30 20 10 0 0 1 2 3 4 Control Koncentration af chitosan TD018 (g/l) EN 113 C. versicolor EN 113 + EN 84 C. Versicolor En 113 C. puteana EN 113 + EN 84 C. puteana Diskussion og konklusion Resultaterne viser, at ingen af de undersøgte typer af chitosan har nogen betydende virkning på nedbrydning af træet. Disse resultater er højest overraskende, idet toxiditeten end ikke er i nærheden af den toxiditet, der er vist i tidligere gennemført Microbial Inhibitory Test. Årsagen til dette er ikke umiddelbart til at gennemskue, men den kan skyldes, at svampene, når de vokser i træ, udskiller en række stoffer, der er i stand til at nedbryde eller detoxificere chitosan. Når svampene vokser på et rigt medium som maltagar, er de ikke induceret til at udskille disse stoffer, hvorfor chitosans toxiske virkning er voldsom. (Kurt Messner, pers. kom.) 21
Chitosans effekt over for skimmelsvampe/blåsplint Skimmelsvampe og blåsplintsvampe udgør en risiko for træværk, så snart det er fældet og efterfølgende ved sekundær opfugtning. Disse svampe skæmmer træets udseende og kan indendøre medføre indeklimaproblemer. Angreb af skimmel og blåsplintsvampe kan forebygges ved overfladebehandling med et effektivt middel, der hæmmer spiring og vækst af disse svampe. Det er undersøgt om chitosan har effekt overfor skimmel- og blåsplintsvampe. Skimmeltest Emner af fyrresplint med en dimension på 5 cm x 2,5 cm x 0,75 m endefladeforsegles med paraffin. Herefter behandles de med chitosanopløsninger på henholdsvis 5 og 10 g/l. Der anvendes 2 typer chitosan, TD018 og TM615. Emnerne behandles på de 4 sider med chitosan med et forbrug svarende til 6m 2 /l. Dette forbrug er valgt, dels ud fra hvad emnerne har kunnet suge, dels ud fra de mængder der normalt bruges ved en overfladebehandling. Til testen er anvendt 4 skimmelsvampe: Alternaria sp, Aspergillus versicolor, Cladosporium sphaerospermum og Trichoderma viride/harzianum. Disse svampe er hyppigt forekommende i ude- og indemiljøet på opfugtede konstruktioner. Svampene er rendyrket fra prøver modtaget i forbindelse med konstaterede angreb af skimmelsvampe i bygninger. Svampene er rendyrket på V8-agar tilsat antibiotika. De rene kulturer er herefter dyrket på V8-agar uden tilsætning af antibiotika. Sporerne er høstet ved til hver plade at tilsætte 10 ml sporesuspensionsopløsning (0,5 g Tween 80 og 0,5 g agar i 1000 ml ionbyttet vand) og herefter frigøre sporerne med en drigalskispatel. Suspensionen filtreres gennem vat, hvorefter antallet af sporer tælles i tællekammer for hver svamp. Suspensionerne, som alle 4 indeholder ca 10 5 sporer pr. ml blandes herefter. De behandlede emner, som er strålesteriliseret med 2 x 5 kgy, dyppes herefter i sporesuspensionen, hvorefter de placeres på autoklaverede hårrør på 14 cm petriskåle med V8-agar. Graden af vækst aflæses efter 1 uge og herefter 1 gang ugentligt. Graden af vækst inddeles i en 5-delt skala, hvor: ingen vækst + vækst kun på siderne ++ vækst på sider og på under 25% af overfladen +++ vækst på sider og på mellem 25 og 75 % af overfladen ++++ vækst på over 75 % af emnet 22 Resultat: