BIZYME ØVELE 1 EZYMKIETIK FAGLIG BAGGUD Det forudsættes, at teorien bag enzymer og enzymkinetik er bekendt. ertil kan bl.a. henvises til kapitlet om antibiotika og resistens i Bioteknologiske orisonter, samt indlægget om enzymkinetik skrevet af ans Christian Jensen, Ulla Christensen og Jakob chiødt (tilgængeligt på www.emu.dk)
FMÅL G BAGGUD Formålet med øvelsen er at bestemme de enzymkinetiske parametre, der knytter sig til enzymet β-lactamases omdannelse af substratet CETA, dvs. den maksimale hastighed Vmax, Michaelis konstanten Km, ligevægtskonstanten for omdannelsen kcat, og hæmmerkonstanten Ki for hæmning med penicillinen gentamycin. Da omdannelse af substratet CETA fører til en forøgelse af absorbansen ved 436 nm indledes øvelsen med en række absorbansmålinger ved forskellige koncentrationer af CETA og til forskellige tider; herefter gentages forsøget med hæmmer tilsat. Ud fra disse målinger er det muligt at beregne de ovennævnte parametre. Figur 1: Grundstrukturen af penicilliner. er den del af penicillinen, der kan variere. β-lactam-ringen er fremævet med rød. Antibiotika bruges til at bekæmpe bakterielle infektioner. β-lactam antibiotika virker ved at hæmme de enzymer, der er ansvarlige for dannelse af bakteriens cellevæg. Disse enzymer hedder transpeptidaser. Ved at hæmme disse enzymer, stoppes celledeling og bakterien dør. FAKTABK 1 YDLYE G YDLAE år et molekyle hydrolyseres, spaltes det i to under tilstedeværelse af et vandmolekyle (af latin, hydro = vand og lysere = spalte/kløve). Et enzym, der katalyserer en hydrolyse, hedder en hydrolase. Den spontane hydrolyse (uden enzym) af β-lactamer er meget langsom. For at have bedre chancer for at overleve antibiotika har visse bakterieceller derfor udviklet enzymer, der kan hydrolysere β-lactam-stofferne, før de når at gøre skade. Disse enzymer hedder β-lactamaser. β-lactamaser er altså en underklasse af hydrolaserne. FAKTABK 2 β-lactamae β-lactam-ringe er firledede ringe, der udgør kernen i størstedelen af antibiotika, der bliver brugt i dag, inklusiv penicilliner, figur 1. om et forsvar mod β-lactam antibiotika har bakterier videreudviklet den klasse af enzymer, der hedder β-lactamaser. En β-lactamase katalyserer hydrolysen af β-lactam-ringe ved et nukleofilt angreb på carbonyl carbon, figur 2. Derved åbnes den firledede ring. år β-lactam-ringen først er hydrolyseret, har antibiotikaen mistet dens virkning, og kan derfor ikke længere hæmme transpeptidaserne, faktaboks 1. Beta-lactamase 2 Figur 2: ydrolyseringen af β-lactam ringen. Katalyseret af β-lactamase. 2
FMÅL G BAGGUD Det er ikke alle bakterier med β-lactamaser, der udgør en sygdomstrussel, også kaldet patogene. Vi ved dog, at alle patogene bakterier har β-lactamaser. For at bekæmpe patogene bakterier forsøger man konstant at udvikle nye typer af antibiotika. Patogene bakterier er desværre i stand til at forsvare sig mod sådanne tiltag ved at tilpasse de gener, der koder for β-lactamaser og tilpasser dermed de proteiner, der bliver udtrykt til at kunne nedbryde disse nye antibiotika. Denne tilpasning sker enten ved hjælp af mutationer i den β-lactamase, bakterien allerede har eller ved gen-overførsel fra en anden bakterie (horisontal gen-transfer). De nye β-lactamaser har som bemærket ændrede substratprofiler, og derved tilpasses bakterien hurtigt nye miljøer. Bakteriernes primære forsvar mod antibiotika er derfor dannelsen af nye β-lactamaser. Evnen til hurtigt at danne nye β-lactamaser skyldes det evolutionære pres, der påhviler bakterierne for at overleve survival of the fittest bacterium! Det er smart for bakterien, men ikke smart for behandlingen af bakterielle infektioner. Ved at danne nye β-lactamaser bliver bakterierne resistente overfor flere typer af antibiotika, der før kunne afhjælpe en infektion. vis bakterien bliver resistent overfor et bredt spektrum af antibiotika, siges den at være multiresistent. Multiresistente bakterier er et stort problem på bl.a. hospitaler. For en mere dybdegående gennemgang af β-lactamaser og deres rolle i antibiotika-restistens henvises til kapitlet, der omhandler dette i Bioteknologiske orisonter (bogen udkommer i første halvdel af 2013) I denne øvelse skal de enzymkinetiske parametre for β-lactamases omdannelse af substratet CETA bestemmes, figur 3. Figur 3: mdannelsen af CE- TA katalyseret af β-lactamase. β-lactam-ringen i CETA bliver hydrolyseret af β-lactamasen. Derved fraspaltes et kromofort molekyle, der absorberer ved 405 nm. Beta-lactamase 2 2 2 CETA 2 + 2 Arbsorberer ved 405 nm 3
FMÅL G BAGGUD Først katalyserer β-lactamase hydrolysen af β-lactam-ringen. Derefter sker endnu en hydrolyse, hvor et molekyle med optiske egenskaber (kromofort molekyle), spaltes fra. Dette kromofore molekyle absorberer lys ved 405 nm. De to reaktioner sker så hurtigt efter hinanden, at selvom det ikke direkte er åbningen af β-lactam-ringen, er det plausibelt at gøre det på denne måde. Man kan let måle absorbans, og vi kan dermed måle på hastigheden, hvormed enzymet nedbryder dets substrat. om angivet i figur 3 vil omdannelsen af CETA resultere i åbningen af β-lactam-ringen. Dette trin giver ingen anledning til en forøgelse i absorbans. Det gør derimod det næste hydrolysetrin, hvor det kromofore molekyle frigives. Det kromofore molekyle absorberer ved 405 nm. elvom det ikke direkte er åbningen af β-lactam-ringen, der måles på, så sker reaktionerne så hurtigt efter hinanden, at det på den tidsskala, I skal arbejde, ingen betydning har. Dette repræsenterer således en let måde at følge hydrolysen af CETA; jo højere absorption ved 405 nm, des mere CETA er der omdannet, og des mere aktivitet og dermed enzym er der i blandingen. Øvelsen indledes med en række absorbansmålinger ved forskellige koncentrationer af CETA og efter bestemte tidsintervaller. Ud fra disse målinger beregnes initialhastighederne. erefter plottes data i et Lineweaver- Burk plot, hvorfra det er muligt at ekstrahere de enzymkinetiske parametre. 4
FEMGAGMÅDE FEMGAGMÅDE Måling af initialhastigheder for hydrolysen af CETA katalyseret af β-lactamase FBEEDELE I måle reaktionshastigheden for β-lactamase ved syv forskellige koncentrationer af substrat, der ligger omkring Km (70 μm). Inden I går i gang med det efterfølgende, skal I have læst dette afsnit godt igennem. For at lette arbejdsgangen foreslås det at I deles ind på syv hold, der hver arbejder med en bestemt CETA-koncentration. I skal således ikke alle lave alle enzymkinetiske målinger. I denne øvelse skal der bruges følgende CETA koncentrationer 25 μm CETA 40 μm CETA 50 μm CETA 75 μm CETA 100 μm CETA 200 μm CETA 300 μm CETA I dette forsøg startes reaktionen ved tilsættelse af β-lactamase. lutkoncentrationen af β-lactamase skal være 11,5 nm. Beregn hvor stort volumen i skal bruge af den opløsning i har fået udleveret, samt hvor stort volumen 1 mm CETA opløsning i skal bruge. Derefter kan i beregne hvor meget Phosphat buffer i skal bruge for at få et samlet volumen på 1 ml EAKTIE Inden I foretager en serie af målinger på en given CETA-koncentration, skal I nulstille spektrofotometret på en blank prøve. En blank prøve består af det samme som den prøve I skal måle på med undtagelse af enzym. Det vil sige, hvis I skal måle omdannelsen af 50 μm CETA af β-lactamase, skal jeres blanke prøve bestå af 1 ml 50 μm CETA i api buffer ved p 7. For at nulstille spektrofotometret trykkes på den knap, der hedder Blank. år I er klar, tilsættes de 11,5 nm β-lactamase til kuvetten med den CETAopløsning, som I skal arbejde med. erefter proppes røret til og vendes et par gange for at opnå en homogen blanding. topuret startes så snart I har vendt kuvetten et par gange. erefter sætter I kuvetten i spektrofotometret og noterer absorbansen efter 30 sek, 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min og 10 min. DET KAL I BUGE: BUFE G PLØIGE 1 mm CETA-opløsning (50 mm api buffer p 7) (CETA kan købes hos EMD Chemicals, typisk 2011 pris er 199 U dollars for 25 mg β-lactamase* 100 ml 50 mm fosfatbuffer p 7 MATEIALE G APPAATU Til at foretage øvelsen skal følgende apparatur og materialer være til stede. Øvelsen er beregnet til ca. 24 elever. 10 μl pipette med tilhørende spidser hvis muligt, én pipette pr. hold 1000 μl pipette med tilhørende spidser hvis muligt, én pipette pr. hold topur 1 ml kuvette med låg ellers kan parafilm benyttes til at proppe kuvetten til. vis muligt mere end én kuvette, men ikke et krav pektrofotometer, der kan måle absorbans ved 405 nm vis I ikke bruger engangskuvetter til absorbansmålingerne, så skal I skylle kuvetten grundigt mellem hver måling med Milli-Q- eller ionbyttet vand *1. vis I selv har oprenset det fra det udleverede præcipitat, så skal I måle proteinkoncentrationen i opløsningen vha. absorbansen ved 280 nm og benytte Lambert-Beers lov til at omregne til koncentrationen i M (se nedenfor). 2. vis I har fået β-lactamasen tilsendt som frysetørret pulver, så opløses pulveret til en koncentration på 2,2 mg/ml i 50 mm fos- fatbuffer p 7. Frysetørret β-lactamase kan også købes hos forskellige firmaer, der forhandler kemikalier. 5
FEMGAGMÅDE DATABEADLIG For hver CETA koncentration afbildes A405 som funktion af tiden i minutter. erefter bestemmes initialhastighederne for reaktionen i første omgang som hældningen. Initialhastighederne omregnes nu fra A405/min til μm/min vha. ekstinktionskoefficienten ε for CETA ved 405 nm (6.400 M-1 cm-1). Til dette benyttes Lambert-Beers lov, A = ɛlc,hvor A er absorbansen ved 405 nm, l er længden af lysvejen målt i cm og c er koncentrationen i mol/l. Afbild resultaterne i et Lineweaver-Burk plot (figur 4) og bestem Vmax og Km. FIgur 4: Et Lineweaver-Burk plot. I et Lineweaver-Burk plot bliver de reciprokke initialhastigheder (1/v) plottet som en funktion af de reciprokke substratkoncentrationer (1/ []). tjernene repræsenterer målepunkter, og den røde linje viser pasningen af en lineær funktion til disse punkter. Med de oplysninger, der er givet i introduktionen, beregn kcat. 6
PØGMÅL TIL ØVELE PØGMÅL TIL ØVELE 1. vorfor er det kun det ene molekyle i reaktionen, figur 3, der giver anledning til absorption? 2. Forsøg at give en forklaring på, hvorfor de to molekyler, der udgør produktet fra betalactamase reaktionen, ikke kan hæmme transpeptidaserne, når modermolekylet kan? 3. Prøv at diskutere hvad der ville ske, hvis I brugte den dobbelte mængde af enzym? 4. g hvad der ville ske, hvis I brugte den dobbelte mængde substrat? 5. vilken type hæmmer er klavulansyre gør herunder rede for de tre forskellige typer af hæmmere, og hvordan man kan kende dem fra hinanden. 6. vilke fejlkilder vil der være forbundet med forsøget? 7. vad kunne forklaringen være på, at enzymkinetikken ikke fulgte en ret linie i Lineweaver-Burk plottet? 8. pstil et spørgsmål de øvrige deltagere (klassekammeraterne) kan besvare. 7
TE 8