HER2 IQFISH pharmdx Kode K udgave

HER2 IQFISH pharmdx Kode K5731 3. udgave HER2 IQFISH pharmdx er en direkte in situ fluorescenshybridiseringsanalyse (FISH) til kvantitativ bestemmelse af HER2 genamplifikation i formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) præparater af brystcancervæv og FFPE-præparater fra patienter med gastrisk adenokarcinom herunder gastroesofagealt overgangsadenokarcinom. Analysen er indiceret sammen med HercepTest til vurdering af patienter, for hvilke behandling med Herceptin overvejes. Sættet indeholder reagenser til 20 analyser. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 1/60

Indhold Side Tilsigtet anvendelse... 4 Resumé og forklaring Bryst... 5 Procedureprincip Bryst... 5 Reagenser Bryst... 5 Medfølgende materialer... 5 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 7 Forholdsregler Bryst... 7 Opbevaring Bryst... 10 Klargøring af prøver Bryst... 10 Paraffinindstøbte snit... 10 BRUGSVEJLEDNING Bryst... 11 A. Klargøring af reagens Bryst... 11 A.1 Forbehandlingsopløsning... 11 A.2 Stringent vaskebuffer... 11 A.3 Vaskebuffer... 11 A.4 Ethanolserie... 11 A.5 Pepsinopløsning... 11 B. Farvningsprocedure Bryst... 12 B.1 Procedurebemærkninger... 12 B.2 Behandling af væv inden farvning... 12 B.3 Farvningsprotokol... 13 Kvalitetskontrol Bryst... 17 Fortolkning af farvning Bryst... 17 Begrænsninger Bryst... 19 Præstationskarakteristika Bryst... 19 Analytisk sensitivitet... 19 Analytisk specificitet... 19 Robusthedsundersøgelser... 19 Reproducerbarhed... 21 Reproducerbarhed... 21 Klinisk anvendelighed... 21 Fejlfinding Bryst... 24 Appendiks 1 Bryst... 26 Appendiks 2 Bryst... 27 Appendiks 3 Bryst... 28 Resumé og forklaring Gastrisk... 29 Procedureprincip Gastrisk... 29 (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 2/60

Reagenser Gastrisk... 29 Medfølgende materialer... 29 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 31 Mikroskopudstyr og -tilbehør... 31 Forholdsregler Gastrisk... 31 Opbevaring Gastrisk... 35 Klargøring af prøver Gastrisk... 35 Paraffinindstøbte snit... 35 BRUGSVEJLEDNING Gastrisk... 36 A. Klargøring af reagens Gastrisk... 36 A.1 Forbehandlingsopløsning... 36 A.2 Stringent vaskebuffer... 36 A.3 Vaskebuffer... 36 A.4 Ethanolserie... 36 A.5 Pepsinopløsning... 36 B. Farvningsprocedure Gastrisk... 37 B.1 Procedurebemærkninger... 37 B.2 Behandling af væv inden farvning... 37 B.3 Farvningsprotokol... 38 Kvalitetskontrol Gastrisk... 41 Fortolkning af farvning Gastrisk... 41 Begrænsninger Gastrisk... 44 Præstationskarakteristika Gastrisk... 44 Analytisk sensitivitet... 46 Analytisk specificitet... 46 Robusthedsundersøgelser... 46 Reproducerbarhed... 48 Reproducerbarhed... 48 Klinisk anvendelighed... 49 Fejlfinding Gastrisk... 50 Appendiks 4 Gastrisk... 52 Appendiks 5 Gastrisk... 54 Appendiks 6 Gastrisk... 56 Appendiks 7 Gastrisk... 57 Referencer... 58 Symbolforklaring... 60 (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 3/60

Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. HER2 IQFISH pharmdx er en direkte in situ fluorescenshybridiseringsanalyse (FISH) beregnet til kvantitativ bestemmelse af HER2-genamplifikation i formalinfikserede, paraffinindstøbte (FFPE) brystcancervævspræparater og FFPE præparater fra patienter med gastrisk adenocarcinom, herunder gastro esofageal overgang. HER2 IQFISH pharmdx er indiceret sammen med HercepTest til vurdering af patienter, for hvilke behandling med Herceptin (trastuzumab) overvejes (se indlægssedlen til Herceptin ). For brystcancerpatienter, er resultaterne fra HER2 IQFISH pharmdx beregnet til brug som et supplement til den klinisk patologiske information, der for tiden anvendes til estimering af prognosen for stadie II, knudepositive brystcancerpatienter. Gastrisk eller gastroesofagealt overgangsadenokarcinom kaldes også gastrisk cancer i dette dokument. For anvendelse til brystcancer henvises der til side 5-28. For anvendelse til gastrisk cancer henvises der til side 29-57. Vigtigt: Bemærk forskellene på væv fra brystcancer og gastrisk cancer, især i afsnittene Fortolkning af farvning (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 4/60

Brystcancer Resumé og forklaring Bryst Det humane HER2-gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) er lokaliseret på kromosom 17 og koder for HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet er til stede i 2 kopier i alle normale diploide celler. Hos visse patienter med brystcancer er HER2-genet amplificeret som en del af den maligne transformationsproces og tumorprogressionen (3-8). HER2-genamplifikation fører almindeligvis til overekspression af HER2-proteinet på overfladen af brystcancerceller (9). Amplifikation af HER2-genet og/eller overekspression af dettes protein er blevet påvist i 25 30% af brystcancere. Denne opregulering er associeret med dårlig prognose, øget risiko for tilbagefald og forkortet overlevelsestid. Adskillige studier har vist, at HER2-status korrelerer med sensitivitet eller resistens over for visse kemoterapeutiske behandlingsregimer (10). Påvisning af kraftig overekspression af HER2-protein eller HER2-genamplifikation er essentiel for indledning af behandling med Herceptin, et monoklonalt antistof mod HER2-protein. Kliniske undersøgelser har vist, at patienter, hvis tumorer har en kraftig overekspression af HER2- proteinet og/eller amplifikation af HER2-genet, har mest glæde af Herceptin (11). Procedureprincip Bryst HER2 IQFISH pharmdx indeholder alle nødvendige reagenser til udførelse af en FISHprocedure på præparater af formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i forbehandlingsopløsning efterfulgt af proteolytisk fordøjelse med pepsin. Efter opvarmningen og det proteolytiske forbehandlingstrin, benytter kittet en ikke-giftig, brugsklar IQISH-probeblanding baseret på en kombination af PNA- (peptidnukleinsyre) (12) og DNA-teknologi. Denne probeblanding består af en blanding af Texas Red-mærkede DNA-prober, der dækker en 218 kb stor region, der omfatter HER2-genet på kromosom 17, og en blanding af fluoresceinmærkede PNA-prober, der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17 (CEN-17). Den specifikke hybridisering til de to målområder resulterer i dannelse af et distinkt rødt fluorescenssignal på hvert HER2-genlocus og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver kromosom 17-centromer. Efter en stringent vask monteres prøverne med fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI, hvorefter de dækkes med dækglas. Ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med passende filtre (se appendiks 3) lokaliseres tumorcellerne, og der udføres tælling af de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signaler. Derefter beregnes forholdet HER2/CEN-17. Normale celler i det analyserede vævssnit tjener som intern positiv kontrol af forbehandlingens og hybridiseringens effektivitet. Se afsnittet Fortolkning af farvning for yderligere oplysninger. Der henvises til det interaktive e-learning-program HER2 IQFISH pharmdx, der er udviklet med det formål at give bioanalytikere, patologer og forskere nem adgang til akkurat og hurtig information om, hvordan der opnås optimale resultater med HER2 IQFISH pharmdx : www.dako.com Reagenser Bryst Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet af tests er baseret på anvendelse af 250 µl pr. objektglas af Flaske 2A (5 8 dråber), 10 µl pr. objektglas af Flaske 3 og 15 µl pr. objektglas af Flaske 5. Opløsningerne i flaske 3 og flaske 5 er viskøse og skal muligvis centrifugeres kortvarigt i en mikrocentrifuge for at kunne opsamle al det leverede reagens. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 5/60

Brystcancer Sættet indeholder materialer til 10 individuelle farvningskørsler (fire separate kørsler, når pepsinnedsænkningsmetoden anvendes). HER2 IQFISH pharmdx forsendes på tøris. Som en kontrol af at sættets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af kittets komponenter kan være ufrosne. Dette vil ikke påvirke ydelsen af HER2 IQFISH pharmdx. Flaske 1 Flaske 2A Flaske 2B Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Flaske 6 Forbehandlingsopløsning (20x) 150 ml, koncentreret 20x MES (2-[N-morpholino]ethansulfonsyre)-buffer. Pepsin 4 x 6,0 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0; indeholder stabilisator og et antimikrobielt stof. Pepsindiluent (10x) 24 ml, koncentreret 10x Fortyndingsbuffer, ph 2,0, med et antimikrobielt stof. HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding 0,2 ml, brugsklar Blanding af Texas Red-mærkede HER2 DNA-prober og fluorescein-mærkede CEN-17 PNA-prober; leveret i IQISH-hybridiseringsbuffer. Stringent vaskebuffer (20x) 150 ml, koncentreret 20x SSC-buffer (natriumcitrat-saltvandsopløsning) med detergent (Tween-20). Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml, brugsklar Fluorescensmonteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-phenylindol). Vaskebuffer (20x) 500 ml, koncentreret 20x Tris/HCl-buffer. Dækglasforseglingsmiddel 1 tube, brugsklar Opløsning til aftagelig forsegling af dækglas. BEMÆRK: Følgende kitreagenser: Forbehandlingsopløsning (20x), pepsin, pepsindiluent (10x), stringent vaskebuffer (20x), fluorescensmonteringsmedium, vaskebuffer (20x) og dækglasforseglingsmiddel kan frit ombyttes med de tilsvarende reagenser i Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 6/60

Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96% Xylen eller xylenerstatninger Brystcancer Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område: 37 100 C) Kalibreret overfladetermometer (område: 37 100 C) Dækglas (22 mm x 22 mm) Pincet Stinkskab Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* Varmeblok eller hybridiseringsovn* Fugtkammer til hybridisering* Mikrocentrifuge Objektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas (se Klargøring af prøve) Farveskåle eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2 15 minutter) Hvirvelmixer Vandbad med låg (der kan holde en temperatur på 37(±2) C, 63 (±2) C og fra 95 C til 99 C) Mikrobølgeovn med mulighed for registrering, hvis der udføres forbehandling ved hjælp af en mikrobølgeovn (se B.3. Farvningsprotokol. Trin 1: Forbehandling, Metode B) * Der kan anvendes varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (66 (±1) C) og hybridisering (4 5 (±2) C) sammen med et fugtkammer til hybridisering som alternativ til Dako Hybridizer. Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbeltfilter eller FITC og Texas Red monofiltre se appendiks 3 for detaljer. Der skal anvendes et fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære som lyskilde. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtre. Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende). Forholdsregler Bryst 1. Til in vitro diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), kræver ingen faremærkning. Sikkerhedsdatablad (SDS) kan rekvireres af uddannet personale. 4. Flaske 2A, Pepsin, indeholder 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A og 0.011-<0.1% 5-chlor-2-methyl-4-isothiazol-3-one og 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Flaske 2A er mærket: Farlig (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 7/60

H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Brystcancer Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. Kan forårsage allergisk hudreaktion. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes. Ring omgående til en GIFTINFORMATIONS-CENTRAL eller en læge. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Ring omgående til en GIFT-INFORMATIONSCENTRAL eller en læge VED KONTAKT MED ØJNENE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Opbevares under lås. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 5. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x), indeholder indeholder 50-<75% propan-2-ol og 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 2B er mærket: Farlig H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Forårsager alvorlig øjenirritation. Kan forårsage sløvhed eller svimmelhed. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes. KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 6. Flaske 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, indeholder 10-<25% ethylencarbonat og 3- <5% natriumchlorid. Flaske 3 er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 7. Flaske 4, Stringent Wash Buffer (20x), indeholder indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 4 er mærket: (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 8/60

Brystcancer H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 8. Flaske 6, Wash Buffer (20x), indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% trometamol. Flaske 6 er mærket: H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 9. Coverslip Sealant, indeholder 100% naphtha (råolie), hydrogenbehandlet let, og er mærket: Farlig H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Kan være livsfarligt, hvis det indtages og kommer i luftvejene. Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet. Undgå udledning til miljøet. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 10. Præparaterne og alle materialer, der komme i berøring med disse, skal både før og efter fiksering håndteres som værende i stand til at overføre smitte og skal bortskaffes under overholdelse af de korrekte forholdsregler (16). Pipetter aldrig med munden, og undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenser kommer i kontakt med følsomme områder, skylles disse med rigelige mængder vand. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 9/60

Brystcancer 11. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlagtige resultater. 12. Andre inkubationstider og -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 13. Andre vævsfikseringsmetoder og prøvetykkelser end de specificerede kan påvirke vævets morfologi og/eller signalets intensitet. 14. Undgå fordampning af HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding under hybridiseringen ved at sikre tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 15. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan føre til tab af ydeevne. 16. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 17. Der må kun anvendes rene farvningsskåle til pepsinnedsænkningsmetoden (trin 2, metode C). Opbevaring Bryst HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding (flaske 3) skal opbevares mørkt ved -18 C. Alle øvrige reagenser kan opbevares mørkt ved 2 8 C. Alle reag enser tåler opbevaring i fryser. Frysning og optøning af reagenserne op til 10 gange påvirker ikke ydelsen. Pepsin, HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding og fluorescensmonteringsmedium (flaske 2, 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse reagenser ved stuetemperatur. HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding og fluorescensmonteringsmedium (flaske 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er stemplet på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er specificeret i indlægssedlen, skal brugeren validere reagensernes ydeevne (14). Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt Dakos tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HER2 IQFISH pharmdx. Klargøring af prøver Bryst Prøver fra biopsier, excisioner eller resektioner skal behandles med henblik på at konservere vævet til FISH-analyse. Der skal anvendes standardmetoder til behandling af væv til immuncytokemisk farvning for alle præparater (15). Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutral, bufferjusteret formalin og indstøbt i paraffin, er egnet til brug. Præparaterne kan f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i 18 24 timer i neutral, bufferjusteret formalin. Derefter dehydreres vævene i en gradueret serie af ethanol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvis temperatur holdes på maks. 60 C. Korrekt fikserede og indstøbte vævssnit kan holde sig uendeligt inden opskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares køligt (15 25 C) (15-16). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævsprøverne skal skæres i snit med en tykkelse på 4 6 µm. Objektglassene, der er nødvendige til analyse af HER2-genamplifikation og bekræftelse af tilstedeværelse af tumor, skal klargøres samtidigt. Det anbefales at anvende mindst 2 serielle snit, 1 snit til bekræftelse af tilstedeværelse af tumor farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E stain) og 1 snit til analyse for HER2-genamplifikation. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas. Præparaterne skal analyseres inden for 4 6 måneder efter opskæring, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 10/60

Brystcancer BRUGSVEJLEDNING Bryst A. Klargøring af reagens Bryst Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Forbehandlingsopløsning Der kan forekomme krystaller i Flaske 1, men de vil gå i opløsning ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 1 (forbehandlingsopløsning 20x) ved at fortynde koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet opløsning, hvis den er uklar. A.2 Stringent vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 4 (stringent vaskebuffer 20x) ved at fortynde koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis de n er uklar. A.3 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra flaske 6 (vaskebuffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Ethanolserie Klargør 3 kar med henholdsvis 70%, 85% og 96% ethanol ud fra en 96% ethanolopløsning. Opbevar de tildækkede kar ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kasser opløsningerne, hvis de er uklare. A.5 Pepsinopløsning Der er kun brug for en pepsinopløsning ved anvendelse af pepsinneddypningsmetoden (metode C). Klargør pepsinopløsningen som følger: Klargør 60 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til seks objektglas. Tilsæt 48 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsindiluent (10x) (flas ke 2B) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) til be holderen. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Klargør 240 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til 24 objektglas. Tilsæt 192 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) pepsindiluent (10x) (fla ske 2B) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) til b eholderen. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Når pepsinopløsningen har nået den fastsatte temperatur, skal den bruges inden for 5 timer. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 11/60

B. Farvningsprocedure Bryst Brystcancer B.1 Procedurebemærkninger Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal ækvilibreres til den rette temperatur inden brug som følger: Flaske 1: Den fortyndede forbehandlingsopløsning skal ækvilibreres til 95 99 C, hvis der anvendes vandbad til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode A) Hvis der anvendes en mikrobølgeovn med mulighed for registrering til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode B), skal den fortyndede forbehandlingsopløsning ækvilibreres til stuetemperatur 20 25 C. Flaske 2A: Pepsin skal anvendes ved 2 8 C (B.3 Farvningsprotokol, Trin 2: Metode A og B) og holdes koldt konstant. Flaske 2B: Pepsindiluent (10x) skal anvendes ved 2 8 C (B.3 Farvningsprotokol, Trin 2: Metode C). Flaske 3: HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding separerer i to faser, mens den opbevares ved -18 C. Før anvendelsen af flaske 3 skal det sikres, at der kun er én fase, ved at lade probeblandingen opnå stuetemperatur (20 25 C ) efterfulgt af blanding. Optø flaske 3 ved stuetemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken grundigt i 15 sekunder ved 2500 rpm med en hvirvelmikser. Opbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brug. Flaske 4: Fortyndet stringent vaskebuffer: Én beholder skal ækvilibreres til stuetemperatur, en anden beholder skal ækvilibreres til 63 (±2) C forud for brugen. Flaske 5: Fluorescensmonteringsmedium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 6: Den fortyndede vaskebuffer skal ækvilibreres til stuetemperatur 20 25 C. Dækglasforseglingsmidlet kan anvendes ved enhver temperatur fra 2 25 C. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren omfatter et antal dehydreringer efterfulgt af tørring af vævssnittene. Sørg for, at vævssnittene er helt tørre, inden der fortsættes til næste trin. Vævssnittene må ikke tørre under de andre proceduretrin. Hvis det er nødvendigt at afbryde farvningsproceduren, kan objektglassene opbevares i vaskebuffer efter afparaffineringstrinnet i op til 1 time ved stuetemperatur (20 25 C) uden at dette påvirker resultaterne. B.2 Behandling af væv inden farvning Afparaffinering og rehydrering: Forud for analysens udførelse skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad, og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 96% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 70% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit B.3, Trin 1, Forbehandling. Xylen- og alkoholopløsningerne skal udskiftes efter 200 objektglas eller færre. Der kan anvendes xylenerstatninger. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 12/60

Brystcancer BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturen kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. B.3 Farvningsprotokol Trin 1: Forbehandling Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A) eller alternativt ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B). Metode A: Forbehandling med vandbad Fyld farvningskar (f.eks. Coplin-kar) med den fortyndede forbehandlingsopløsning (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.1). Anbring farvningskarrene med den fortyndede forbehandlingsopløsningen i et vandbad. Opvarm vandbadet og forbehandlingsopløsningen til 95 99 C. Mål tempera turen i karret med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Sæt låg på karrene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede forbehandlingsopløsning i farvningskarrene. Kontroller igen temperaturen og inkuber i 10 (±1) minutter, ved 95 99 C. Tag hele karret med objektglassene op af vandbadet. Tag låget af, og lad objektglassene køle af i forbehandlingsopløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Metode B: Forbehandling ved hjælp af mikrobølgeovn med mulighed for registrering Fyld et plastkar med fortyndet forbehandlingsopløsning ved stuetemperatur (20 25 C). Nedsænk de afparaffinerede snit i forbehandlingsopløsning, dæk karret med et låg med ventilationshuller, og placer det i mikrobølgeovnen. Aktiver kogepunktssensoren, og vælg et program, der kører i 10 minutter efter at temperaturen er nået op på kogepunktet*. Efter de 10 minutters inkubation tages karret med objektglas ud af ovnen, låget fjernes, og skålen lades henstå til afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Flyt objektglassene over i en skål med fortyndet vaskebuffer, og lad dem ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. * Kravet om brug af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering betyder, at ovnen skal have en sensor og programmer, som indledningsvis opvarmer forbehandlingsopløsningen til kogepunktet og derefter opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC), mens den forudindstillede tid tæller ned (10 (±1) minutter). På visse mikrobølgeovne med mulighed for registrering er det muligvis ikke muligt at indstille en valgfri nedtællingstid. Hvis ovnen kun har forudindstillede programmer, skal der vælges et program, som opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC) i mindst 10 (±1) minutter, hvorefter man skal stoppe programmet manuelt efter 10 (±1) minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Trin 2: Pepsin, brugsklar (RTU) eller pepsinopløsning Pepsininkubering kan udføres ved direkte anvendelse af RTU-pepsindråber på objektglassene enten ved stuetemperatur (20 25 C) (metode A) elle r ved 37 C (metode B). Alternativt kan objektglassene neddyppes i en pepsinopløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (metode C). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 13/60

Brystcancer Metode A og metode B: Bank overskydende buffer af. Brug en fnugfri klud (f.eks. en absorberende serviet eller gaze), og tør forsigtigt rundt om prøven for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Tilsæt 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) pepsin (fl aske 2A) for at dække prøven. Opbevar altid pepsin ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, brugsklar - inkubering ved 20 25 C Inkuber i 5 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 5 15 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede vaskebuffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Metode B: Pepsin, brugsklar - inkubering ved 37 C Placer prøven med pepsin på en varmeblok ved 37 C - f.eks. en Dako Hybridizer - og inkuber i 3 5 minutter. En inkubationstid på 3 5 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Metode C: Pepsinopløsning - nedsænkning af objektglas i pepsinopløsning ved 37 C Sættet indeholder reagenser til fire separate kørsler (60 ml pepsinopløsning, lille beholder til seks objektglas) eller en enkelt kørsel (240 ml pepsinopløsning, stor beholder til 24 objektglas). Klargør pepsinopløsningen som beskrevet i afsnit A.5. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Sørg for, at temperaturen får tid til at stabilisere sig. Mål temperaturen i beholderen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Bank overskydende vaskebuffer af. Neddyp objektglassene i pepsinopløsningen ved 37 (±2) C. og inkuber i 20 30 minutter. En inkubationstid på 20 30 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsinopløsning af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 14/60

Trin 3: HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding Brystcancer HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding separerer i to faser, mens den opbevares ved -18 C. Før anvendelsen af flaske 3 skal det sikres, at der kun er én fase, ved at lade probeblandingen opnå stuetemperatur (20 25 C ) efterfulgt af blanding. Optø flaske 3 ved stuetemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken grundigt i 15 sekunder ved 2500 rpm med en hvirvelmikser. Opbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brug. Tilsæt 10 µl HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding (flaske 3) over midten af vævssnittet. Anbring straks et 22 mm x 22 mm dækglas over probeblandingen, og lad det sprede sig jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, fjernes de ved at slå forsigtigt på dækglasset med en pincet. Husk at opbevare flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brugen. Forsegl dækglasset med dækglasforseglingsmidlet ved at presse dette ud i en fuge langs kanten af dækglasset. Lad dækglasforseglingsmidlet overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at dækglasforseglingsmidlet dækker hele dækglassets kant. Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er mættede og optimale for brug. Start Hybridizer'en, og vælg et program, der: Denaturerer ved 66 C i 10 minutter efterfulgt af h ybridisering ved 45 C i 60 120 minutter. Placer objektglassene i Hybridizer en, sørg for, at låget er korrekt lukket, og start programmet. Der henvises til brugervejledningen til Dako Hybridizer for detaljerede oplysninger. * Instrumenter, der gør det muligt at opnå betingelser, der er identiske med de ovenfor beskrevne, kan anvendes til denaturering og hybridisering: Placer objektglassene på en jævn overflade af metal eller sten (varmeblok eller på en blok i en hybridiseringsovn), der er forvarmet til 66 (±1) C. Denaturer i nøjagtigt 10 minutter. Anbring objektglassene i et forvarmet, hybridiseringsfugtkammer. Læg låg over kammeret, og inkuber ved 45 (±2) C i 60 120 minutter. Bemærk, at en hybridi seringstemperatur på 37 C ikke er egnet til brug med proberne, der er indeholdt i dette sæt. Trin 4: Stringent vask Fyld to farvningskar (f.eks. Coplin-kar) med den fortyndede stringente vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Det anbefales at bruge mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hvert kar. Anbring det ene af farvningskarrene med fortyndet stringent vaskebuffer ved stuetemperatur i et stinkskab og det andet i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede stringente vaskebuffer til 63 (±2) C. Sørg for, at temperatur en har stabiliseret sig. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Den stringente vaskebuffer indeholder detergent og kan blive turbid ved 63 C. Dette påvirker ikke ydelsen. Tag objektglassene ud af hybridiseringskammeret ved hjælp af en pincet eller handsker, fjern forsigtigt dækglasforseglingsmidlet og dækglassene, og placer objektglassene i forvaskekarret, der har stuetemperatur, et ad gangen. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskekarret, der har stuetemperatur, til karret i det 63 (±2) C varme v andbad. Umiddelbart efter at have overført objektglassene til den 63 (±2) C varme fortyndede stringente vaskebuffer i vandbadet, skal timeren startes. Udfør stringent vask i nøjagtig 10 minutter. Fjern objektglassene fra den fortyndende stringente vaskebuffer, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 15/60

Lad vævssnittene tørre fuldstændigt. Trin 5: Montering Brystcancer Tilsæt 15 µl fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI (flaske 5) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglassene opbevares mørkt ved -18 8 C. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 16/60

Kvalitetskontrol Bryst 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Brystcancer Normale celler bør indeholde 1 2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN-17- PNA-proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler skal ligeledes have 1-2 tydeligt synlige røde signaler, der indikerer, at HER2-DNA-proben har hybridiseret godt til HER2-amplikonet. På grund af vævssektionering vil nogle af de normale celler indeholde færre end de forventede 2 signaler af hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en analysefejl, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI-filter. Talrige spøgelseslignende celler og en generelt dårlig kernemorfologi indikerer overfordøjelse af prøven, hvilket resulterer i tab af eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning Bryst Evaluerbart væv Kun prøver fra patienter med invasivt carcinom bør testes. I tilfælde med carcinoma in situ og invasivt carcinom i samme præparat, skal kun det invasive område bedømmes. Undgå områder med nekrose og områder, hvor kernernes afgrænsning er tvivlsom. Medtag ikke kerner, der kræver en subjektiv vurdering. Spring kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund over. Signaltælling: Lokaliser tumoren på det H&E-farvede objektglas, og evaluer det samme område på det FISH farvede objektglas. Scan adskillige områder af tumorceller for at tage højde for mulig heterogenesitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område idet der scannes fra venstre mod højre. Tæl antallet af signaler inden for kerneafgrænsningen af hver evaluerede kerne ifølge retningslinjerne nedenfor (se også appendiks 3). - Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. - Tæl to signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, som kun ét signal. - I kerner med høje niveauer af HER2 genamplifikation, kan HER2-signalerne være placeret meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I disse tilfælde kan antallet af HER2- signaler ikke tælles, men må i stedet estimeres. Vær særlig opmærksom på de grønne signaler, da klynger af HER2-signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved anvendelse af et specifikt FITC-filter. Kerner uden signaler, eller med signaler af kun en farve, skal ikke tælles med. Tæl kun de kerner med, der indeholder et eller flere signaler af hver farve. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 17/60

Brystcancer Tællevejledning 1 Skal ikke tælles. Kerner overlapper, ikke alle kerneområder er synlige. 2 To grønne signaler. Tæl ikke kerner med kun en signalfarve med 3 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 4 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 5 Tælles ikke med (under- eller overfordøjede kerner). eller Manglende signaler i centrum af kernerne (donut-formede kerner). 6 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 7 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler 8 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 9 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC-filter, eller tæl ikke kernen med Optegn tallene i en tabel som vist i appendiks 2. Tæl 20 kerner pr. vævsprøve, hvor det er muligt fra forskellige tumorområder (17). Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved at dividere det samlede antal røde HER2-signaler med det samlede antal grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold, der er større end eller lig med 2, skal betragtes som HER2-genamplificerede (5, 17-19). Resultater ved eller tæt på cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsigtighed. Hvis forholdet er borderline (1,8 2,2), tælles yderligere 20 kerner, og forholdet beregnes igen ud fra de 40 kerner. I tvivlstilfælde skal prøven tælles igen. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskelig. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 18/60

Brystcancer Begrænsninger Bryst 1. FISH er en flertrins diagnostisk proces, der kræver specialiseret uddannelse vedrørende valg af passende reagenser såvel som vævsselektion, -fiksering, -behandling og klargøring af FISH-objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. 2. FISH-resultaterne er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For optimale og reproducerbare resultater skal objektglassene med vævsprøverne afparaffineres fuldstændigt. Fjernelsen af paraffin skal være fuldført ved begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSVEJLEDNING, afsnit B.2). 4. Der må kun anvendes temperaturkalibrerede vandbade, varmeblokke og hybridiseringsovne. Brug af andre typer udstyr kan resultere i fordampning af HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding under hybridiseringen, og skal valideres af brugeren. Præstationskarakteristika Bryst Analytisk sensitivitet Sensitiviteten af HER2/CEN-17 IQISH-probeblandingen blev undersøgt ved hjælp af 18 prøver af normalt, humant brystepitel. Forholdet mellem antallet af HER2-signaler og CEN-17-signaler blev beregnet baseret på en tælling af 20 kerner pr. prøve. HER2/CEN-17-forholdet for de 18 prøver af normalt, humant brystepitel var mellem 0,97 1,08. Analytisk specificitet HER2 DNA-proberne i HER2/CEN-17 IQISH-probeblandingen er blevet endesekvenseret og kortlagt for at bekræfte en samlet dækning på 218 kb inklusive HER2- genet. CEN-17 PNA-proberne i HER2/CEN-17 IQISH-probeblandingen er blevet testet individuelt og i kombination for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. For at måle analysens evne til kun at identificere målsubstanserne HER2 og CEN-17 uden interferens fra andre stoffer, blev der udført undersøgelser på vævsprøver af normalt, humant brystepitel ved hjælp af flaske 3 indeholdende hybridiseringsbufferen men uden probeblandingen. I alt 18 prøver blev evalueret for tilstedeværelse af signaler, der ikke var relateret til probeblandingen. Der blev ikke observeret detektion af andre kromosommål eller interferens med nært beslægtede stoffer i nogen af de 18 prøver. Robusthedsundersøgelser HER2 IQFISH pharmdx analysens robusthed blev testet ved at ændre forbehandlingstiden, temperaturen og metoderne til opvarmning af forbehandlingsbufferen (mikrobølgeovn eller vandbad), pepsininkuberingstiden og - metoden (RTU-pepsin eller nedsænkning), denatureringstemperaturen og -tiden, hybridiseringstiden og tid og temperatur for den stringente vask. Der observeredes ingen betydende forskelle i resultater ved følgende eksperimentbetingelser: Forbehandling, metode A) Vandbad i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 95 C, 95 99 C og 99 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 95 99 C (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 19/60

Forbehandling, metode B) Mikrobølgeovn i 9, 10 og 11 minutter ved >95 C. Pepsinfordøjelse, metode A) med inkuberingstider på 5, 10 og 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Brystcancer Pepsinfordøjelse, metode B) med inkuberingstider på 3, 4 og 5 minutter ved 37 C). Pepsinfordøjelse, metode C) med inkuberingstider på 20, 25 og 30 minutter kombineret med hver af temperaturerne 35, 37 og 39 C. Denaturering i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 65, 66 og 67 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 66 C. Hybridis eringstid på 60, 90 og 120 minutter ved 45 C. Stringent vask i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 61, 63 og 65 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 63 C. Bemærk: I forbindelse med robusthedstestene blev kun et enkelt af farvningsprocedurens parametre ændret ad gangen, mens alle øvrige parametre blev holdt konstante. Det anbefales, at man overholder de tider og temperaturer, der er angivet i farvningsproceduren. Hybridisering i 60 minutter gav en høj signalintensitet omend den var en smule lavere sammenlignet med hybridisering i 90 og 120 minutter. Der observeredes ikke nogen signifikant forskel i resultater ved de øvrige kombinationer af tid og temperatur. Farvningsproceduren til HER2 IQFISH pharmdx byder på protokolvariabler for så vidt angår varme-forbehandling, pepsinfordøjelse og hybridiseringstid. Hver af de unikke kombinationer er blevet valideret med hensyn til HER2-genstatus. Valideringen blev udført på 10 FFPE-prøver af humant brystkarcinom for hver af de 12 mulige kombinationer. HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) blev brugt som reference. HER2/CEN-17-forholdet for hver enkelt af prøverne ses i figur 1. Krydstabuleringer mellem de 12 test og referencefarvningen viste en generel overensstemmelse for så vidt angår HER2-genstatus på 100% (10/10) med nedre og øvre tohalede 95% konfidensgrænser på henholdsvis 78,3% og 100%. Kappa-værdien var 1,00, og McNemars test viste fravær af bias (tohalet t-værdi på 1,00). Figur 1. Individuelle HER2/CEN-17-forhold for 10 humane brystkarcinomprøver farvet med de 12 mulige kombinationer af protokolvarianter med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) (test 1-12) og HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331) reference (R). Den vandrette linje viser cut-off-værdien på 2,0. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 20/60

Brystcancer Reproducerbarhed Reproducerbarheden for HER2/CEN-17-forholdet blev undersøgt med HER2 IQFISH pharmdx analysen ved hjælp af på hinanden følgende snit af ni humane brystkarcinomprøver enten med ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Der blev testet tre snit af hver prøve i samme kørsel. Den gennemsnitlige variationskoefficient var 5,2% for ikke-amplificerede prøver (område fra 1% til 8%) og 14% for amplificerede prøver (område fra 7% til 20%). Der blev i alt testet fem på hinanden følgende snit af fire humane brystkarcinomprøver af forskellig tykkelse (3, 4, 5, 6 og 7 µm) med HER2 IQFISH pharmdx. Den gennemsnitlige variationskoefficient for HER2/CEN-17-forholdet var 7% (område fra 6% til 9%). Reproducerbarhed HER2 IQFISH pharmdx analysen blev testet for lot-til-lot- og observatør-til-observatørreproducerbarhed ved hjælp af tre lot af HER2 IQFISH pharmdx og tre observatører. Reproducerbarheden blev testet på ni forskellige humane brystkarcinomprøver enten med ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Den gennemsnitlige variationskoefficient for lot-til-lot-reproducerbarhed var 5% for ikkeamplificerede prøver (område fra 2% til 8%) og 7,8% for amplificerede prøver (område fra 5% til 11%). Den gennemsnitlige variationskoefficient for observatør-til-observatør-reproducerbarhed var 3,2% for ikke-amplificerede prøver (område fra 0,2% til 6%) og 2,8% for amplificerede prøver (område fra 2% til 4%). Klinisk anvendelighed Den kliniske anvendelighed af Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331) blev undersøgt i en komparativ undersøgelse med Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Studiet inkluderede 150 arkiverede prøver fra patienter, der havde enten noduspositiv eller nodusnegativ, grad II III brystcancer. Det primære formål med studiet var at undersøge graden af konkordans mellem HER2/kromosom-17-centromerforholdene for de 150 prøver som testet med Dako- og Vysis-kittene både med hensyn til den generelle overensstemmelse mellem forholdene og overensstemmelsen med de dikotomiserede FISH-resultater (+/- grupper). I alt 145 prøver blev vellykket hybridiseret og scoret og var dermed egnede til statistisk analyse. En 2 x 2 krydstabulering af resultaterne vises i tabel 1. Tabel 1. Dikotomiserede resultater fra 145 brystcancerprøver testet med Dako HER2 FISH pharmdx Kit og Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. 60 kerner i hver prøve blev scoret med hvert af de to kit. Vysis-kit ( ) amplificeret Vysis-kit (+) amplificeret Dako-kit ( ) amplificeret Dako-kit (+) amplificeret Sum 95 2 97 5 43 48 Sum 100 45 145 Sammenfaldet mellem Dako- og Vysis-testene var 95% med et konfidensinterval på 92 99%. Kappaværdien var 0,89. McNemars test for systematisk bias mellem de to tests var ikke signifikant (p=0,22). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 21/60

Brystcancer Figur 2 viser et scatterplot af de parrede observationer for de 145 prøver. 12,00 Scatter Scatterplot af of de paired parrede observations observationer 10,00 DakoCytomation HER2 FISH pharmdx Kit Dako HER2 FISH pharmdx Kit 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Vysis PathVysion HER-2 DNA DNA Probe Probe Kit Kit Figur 2. 145 brystcancerprøver testet for HER2-genamplifikation med Dako HER2 FISH pharmdx Kit og Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit. Resultaterne er udtrykt som HER2/kromosom-17-centromerforhold. 60 kerner i hver prøve blev scoret med hvert af de to kit. Den generelle overensstemmelse mellem testene med Dako HER2 FISH pharmdx og Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe blev undersøgt ved analyse af forskellen mellem parrede observationer af logaritmen (forholdet) og en lineær regressionsanalyse af logaritmen (forholdet) for de to test. Det blev konkluderet, at forskellen mellem parrede observationer af logaritmen (forholdet) systematisk øges med summen af HER2/kromosom-17-centromerforholdene, og at det målte forhold for højere forhold er højere i Dako-testen end i Vysis-testen. Det højere HER2/kromosom-17-centromerforhold, der observeredes med Dako HER2 FISH pharmdx Kit, kan relateres til en virkelig forskel mellem de to test, f.eks. at den højere opløsning for Dako HER2 FISH pharmdx Kit resulterer i højere forhold i tilfælde med kraftig HER2-genamplifikation. Imidlertid blev testningen af kittene udført 2 forskellige steder, og variation mellem laboratorier er forventeligt. Ydermere er der i litteraturen rapporteret om en højere variation for kraftigt amplificerede tilfælde, men dette betragtes ikke at være klinisk relevant (18). Nærværende studie tillader ikke undersøgelse for en systematisk forskel mellem de to tests udført på mange laboratorier. Det bør tilføjes, at den observerede variation mellem de to tests er af samme størrelse som variationen mellem teststederne i portabilitetsstudiet. Dako HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) er blevet sammenlignet med Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331) i en sammenlignende undersøgelse af 78 (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 22/60

Brystcancer brystvævsprøver af humant brystkarcinom. Krydstabulering af HER2-status opnået med de to analyser gav en generel overensstemmelse på 98,7% med nedre og øvre grænser for 95% konfidensintervallet på 94,2% og 99,9%. Kappaværdien var 0,96 med nedre og øvre grænser for 95% konfidensintervallet på 0,89 og 1,00. p-værdien for McNemars test var 1,00, hvilket peger på fravær af bias mellem de to analyser. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 23/60

Brystcancer Fejlfinding Bryst Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler. 1a. Sættet har været udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring. 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Kontroller, om der stadig var tøris i pakken ved modtagelsen. Kontroller, at flaske 3 har været opbevaret mørkt ved -18 C. Kontroller, at flaske 2A og 5 har været opbevaret mørkt og ved højst 2 8 C. 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til anvendelse sammen med kittets fluorokromer og at kviksølvlampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt ud over den forventede levetid. (Se appendiks 3). I tilfælde af tvivl kontaktes leverandøren af mikroskopet. 1c. Falmede signaler 1c. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 1d. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 1e. Fordampning af probeblanding under hybridisering. 1d. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 1e. Sørg for tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 2. Ingen grønne signaler 3. Ingen røde signaler. 2a. Ukorrekte betingelser for stringent vask. 3a. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 2a. Sørg for at anvende den anbefalede temperatur og tid for stringent vask og at fjerne dækglas inden udførelse af stringent vask. 3a. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 24/60

Brystcancer 4. Områder uden signal 4a. Probevolumen er for lille. 4a. Sørg for, at probevolumen er stor nok til at dække området under dækglasset. 4b. Der er opstået luftbobler under tilsætning af probeblanding eller montering. 4b. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. 5. Overdreven baggrundsfarvning 6. Dårlig vævsmorfologi 7. Kraftig grøn autofluorescens på objektglasset herunder i områder uden FFPE-væv 5a. Ukorrekt vævsfiksering. 5a. Sørg for kun at anvende formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 5b. Paraffinen er ikke helt fjernet. 5c. For lav temperatur for stringent vask. 5d. Langvarig eksponering af det hybridiserede snit for kraftigt lys 5b. Følg proceduren for afparaffinering og rehydrering beskrevet i afsnit B.2. 5c. Sørg for, at temperaturen for stringent vask er 63 (±2) C. 5d. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet, og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 6a. Ukorrekt pepsinbehandling. 6a. Overhold de anbefalede pepsininkubationstider. Se afsnit B.3, trin 2. Sørg for at håndtere Pepsin ved den korrekte temperatur. Se afsnit B.1. 6b. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser kan medføre et uklart eller tåget udseende. 6c. For langvarig pepsinbehandling eller en meget tynd snittykkelse kan føre til forekomst af spøgelsesceller eller "donut"-celler. 7. Brug af udløbne eller ikkeanbefalede glasobjektglas 6b. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 6c. Forkort Pepsininkubationstiden. Se afsnit B.3, Trin 2. Sørg for, at snittykkelsen er 4 6 µm. 7. Kontroller, at det belagte glasobjektglas (Dako Silanized Slides, kode S3003 eller poly-l-lysinbelagte objektglas) ikke har overskredet udløbsdatoen. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 25/60

Brystcancer Appendiks 1 Bryst HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Protokolcheckliste Dato for kørslen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Lot: Prøve-ID: Udstyrs-ID: Farvningskørslens log-id: Dato for fortynding/udløb af 1 x vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20): / Vævet fikseret i neutral, bufferjusteret formalin Ja Nej Trin 1: Forbehandling Dato for fortynding/udløb af forbehandlingsopløsning (flaske 1 fortyndet 1:20) Målt temperatur af forbehandlingsopløsning (95 99 C) hvis der anvendes et vandbad til opvarmning. Forbehandling (10 minutter) og afkøling (15 minutter) Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Trin 2: Pepsin Varighed af pepsinbehandling (flaske 2) ved 37 ºC eller Varighed af pepsinbehandling (flaske 2) ved stuetemperatur (20 25 C) eller Varighed af pepsinneddypning ved 37 (±2) C Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i graduerede serier af ethanol og lufttør Trin 3: HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding Tilsæt probeblanding (flaske 3), læg dækglas på og forsegl med dækglasforseglingsmiddel / C minutter minutter minutter Målt denatureringstemperatur (66 (±1) C) C Denaturering i 10 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 (±2) C) C Hybridiseringstid (60 120 minutter) minutter Trin 4: Stringent vask Dato for fortynding/udløb af stringent vaskebuffer (flaske 4 fortyndet 1:20) Målt temperatur af stringent vaskebuffer (63 (±2) C) C Stringent vask (10 minutter) efter fjernelse af dækglas Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) C Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i graduerede serier af ethanol og lufttør Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl fluorescensmonteringsmedium (flaske 5) og læg dækglas på Kommentarer: / minutter Dato og underskrift, tekniker: (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 26/60

Brystcancer Appendiks 2 Bryst HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Scoringsskema Farvekørsels-log-ID: Dato for kørslen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Lot: Prøve ID: Kerne nr. HER2- score (rød) Tæl signaler i 20 kerner CEN-17 score (grøn) Kerne nr. 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 I alt (1-10) I alt (11-20) HER2- score (rød) CEN-17 score (grøn) Til bestemmelse af HER2/CEN-17-forholdet tælles antallet af HER2-signaler og antallet af CEN-17-signaler i de samme 20 kerner, og det samlede antal HER2-signaler divideres med det samlede antal CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet er på grænsen (1,8 2,2) tælles yderligere 20 kerner, og forholdet beregnes igen. Resultater ved eller tæt på cut-off (1,8 2,2) skal fortolkes med forsigtighed (se tællevejledningen). Samlet score (1-20) HER2 CEN-17 HER2/CEN 17 forhold Forhold < 2: Der blev ikke observeret HER2-genamplifikation Forhold 2: Der blev observeret HER2-genamplifikation Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 27/60

Brystcancer Appendiks 3 Bryst HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til anvendelse sammen med HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden). 3. Objektiver Til screening af vævene kan der anvendes fluorescens tør 10x eller fluorescens olieimmersion 16x objektiver. Til højeffektsforstørrelse og bedømmelse af signaler kan der kun anbefales fluorescens olieimmersion objektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtrene udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler anvendelse af et specifikt DAPI-filter i kombination med et højkvalitets Texas Red/FITC dobbeltfilter. DAPI-filter, f.eks. Chroma filter # 31000. Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma filter # 51006. Texas Red og FITC enkelte filtre kan anvendes til bekræftelse. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt mikroskopleverandøren eller den lokale Dako-repræsentant for yderligere detaljerede oplysninger. 5. Olie Ikke fluorescerende olie. Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke. Rhodaminfiltre kan ikke anvendes. Tripelfiltre anbefales ikke. Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt rettet ind og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Man skal bestræbe sig på at udsætte prøven for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Vi anbefaler, at De diskuterer opsætningen af Deres mikroskop med producenten, eller læser litteraturen, inden De påbegynder in situ fluorescenshybridiseringen. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 28/60

Gastrisk cancer Resumé og forklaring Gastrisk Det humane HER2-gen (også kendt som ERBB2 eller NEU) er lokaliseret på kromosom 17 og koder for HER2-proteinet eller p185 HER2. HER2-proteinet er en membranreceptortyrosinkinase med homologi til epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR eller HER1) (1-2). HER2-genet er til stede i 2 kopier i alle normale diploide celler. Overekspression af HER2-proteinet og amplifikation af HER2-genet i gastrisk cancer er påvist i et stort antal undersøgelser (gennemgås i (20)). HER2-positivitet kan detekteres hos ca. 20% af patienterne ved enten IHC eller FISH (20). Prækliniske in vitro- og in vivo-undersøgelser har vist, at trastuzumab (Herceptin ) er effektivt i forskellige gastriske cancermodeller, hvilket har ført til initiering af adskillige kliniske undersøgelser (20-24). I en fase III-undersøgelse BO18255, ToGA-forsøget, blev HER2-positive patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk eller gastroesofagealt overgangsadenokarcinom randomiseret til at modtage 5-FU eller capecitabin og cisplatin enten alene eller i kombination med trastuzumab. Der blev konstateret en statistisk signifikant stigning i den generelle overlevelse (OS) hos patienter, der modtog den kombinerede behandling med trastuzumab og kemoterapi (25). Trastuzumab er et humaniseret, monoklonalt antistof, der binder med høj affinitet til HER2-proteinet, og som har vist sig at hæmme profilerationen af humane tumorceller med overekspression af HER2-protein in vitro og in vivo (21-24). Procedureprincip Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx indeholder alle nødvendige reagenser til udførelse af en FISHprocedure på præparater af formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i forbehandlingsopløsning efterfulgt af proteolytisk fordøjelse med pepsin. Efter opvarmningen og det proteolytiske forbehandlingstrin, benytter sættet en ikke-giftig, brugsklar IQISH-probeblanding baseret på en kombination af PNA- (peptidnukleinsyre) (12) og DNA-teknologi. Denne probeblanding består af en blanding af Texas Red-mærkede DNA-prober, der dækker en 218 kb stor region, der omfatter HER2-genet på kromosom 17, og en blanding af fluoresceinmærkede PNA-prober, der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17 (CEN-17). Den specifikke hybridisering til de to målområder resulterer i dannelse af et distinkt rødt fluorescenssignal på hvert HER2-genlocus og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver kromosom 17-centromer. Efter en stringent vask monteres prøverne med fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI, hvorefter de dækkes med dækglas. Ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med passende filtre (se appendiks 3) lokaliseres tumorcellerne, og der udføres tælling af de røde (HER2) og grønne (CEN-17) signaler. Derefter beregnes forholdet HER2/CEN-17. Normale celler i det analyserede vævssnit tjener som intern positiv kontrol af forbehandlingens og hybridiseringens effektivitet. For detaljer, se afsnittet Fortolkning af farvning. Der henvises til det interaktive e-learning-program HER2 IQFISH pharmdx, der er udviklet med det formål at give bioanalytikere, patologer og forskere nem adgang til akkurat og hurtig information om, hvordan der opnås optimale resultater med HER2 IQFISH pharmdx : www.dako.com Reagenser Gastrisk Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet af tests er baseret på anvendelse af 250 µl pr. objektglas af Flaske 2A (5 8 dråber), 10 µl pr. objektglas af Flaske 3 og 15 µl pr. objektglas af Flaske 5. Opløsningerne i flaske 3 og flaske 5 er viskøse og skal muligvis centrifugeres kortvarigt i en mikrocentrifuge for at kunne opsamle al det leverede reagens. Sættet indeholder materialer til 10 individuelle farvningskørsler (fire separate kørsler, når pepsinnedsænkningsmetoden anvendes). HER2 IQFISH pharmdx forsendes på tøris. Som en (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 29/60

Gastrisk cancer kontrol af at sættets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af kittets komponenter kan være ufrosne. Dette vil ikke påvirke ydelsen af HER2 IQFISH pharmdx. Flaske 1 Flaske 2A Flaske 2B Forbehandlingsopløsning (20x) 150 ml, koncentreret 20x MES (2-[N-morpholino]ethansulfonsyre)-buffer. Pepsin 4 x 6,0 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0; indeholder stabilisator og et antimikrobielt stof. Pepsindiluent (10x) 24 ml, koncentreret 10x Fortyndingsbuffer, ph 2,0, med et antimikrobielt stof. Flaske 3 Flaske 4 HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding 0,2 ml, brugsklar Blanding af Texas Red-mærkede HER2 DNA-prober og fluorescein-mærkede CEN-17 PNA-prober; leveret i IQISH-hybridiseringsbuffer. Stringent vaskebuffer (20x) 150 ml, koncentreret 20x SSC-buffer (natriumcitrat-saltvandsopløsning) med detergent (Tween-20). Flaske 5 Flaske 6 Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml, brugsklar Fluorescensmonteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-phenylindol). Vaskebuffer (20x) 500 ml, koncentreret 20x Tris/HCl-buffer. Dækglasforseglingsmiddel 1 tube, brugsklar Opløsning til aftagelig forsegling af dækglas. BEMÆRK: Følgende kitreagenser: Forbehandlingsopløsning (20x), pepsin, pepsindiluent (10x), stringent vaskebuffer (20x), fluorescensmonteringsmedium, vaskebuffer (20x) og dækglasforseglingsmiddel kan frit ombyttes med de tilsvarende reagenser i Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 30/60

Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96% Xylen eller xylenerstatninger Gastrisk cancer Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område: 37 100 C) Kalibreret overfladetermometer (område: 37 100 C) Dækglas (22 mm x 22 mm) Pincet Stinkskab Dako Hybridizer (kode S2450 eller S2451)* Varmeblok eller hybridiseringsovn* Fugtkammer til hybridisering* Mikrocentrifuge Objektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-l-lysin-coatede objektglas (se Klargøring af præparater) Farveskåle eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2 15 minutter) Hvirvelmixer Vandbad med låg (der kan holde en temperatur på 37(±2) C, 63 (±2) C og fra 95 C til 99 C) Mikrobølgeovn med mulighed for registrering, hvis der udføres forbehandling ved hjælp af en mikrobølgeovn (se B3. Farvningsprotokol. Trin 1: Forbehandling, Metode B) * Der kan anvendes varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (66 (±1) C) og hybridisering (4 5 (±2) C) sammen med et fugtkammer som alternativ til Dako Hybridizer. Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbeltfilter eller FITC og Texas Red monofiltre se appendiks 3 for detaljer Der skal anvendes et fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære som lyskilde. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtre Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende) Forholdsregler Gastrisk 1. Til in vitro diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), kræver ingen faremærkning. Sikkerhedsdatablad (SDS) kan rekvireres af uddannet personale. 4. Flaske 2A, Pepsin, indeholder 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A og 0.011-<0.1% 5-chlor-2-methyl-4-isothiazol-3-one og 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Flaske 2A er mærket: Farlig H314 Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 31/60

H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Gastrisk cancer Kan forårsage allergisk hudreaktion. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes. Ring omgående til en GIFTINFORMATIONS-CENTRAL eller en læge. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Ring omgående til en GIFT-INFORMATIONSCENTRAL eller en læge VED KONTAKT MED ØJNENE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Opbevares under lås. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 5. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x), indeholder indeholder 50-<75% propan-2-ol og 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 2B er mærket: Farlig H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Forårsager alvorlig øjenirritation. Kan forårsage sløvhed eller svimmelhed. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vejrtrækningen lettes. KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 6. Flaske 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, indeholder 10-<25% ethylencarbonat og 3- <5% natriumchlorid. Flaske 3 er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 7. Flaske 4, Stringent Wash Buffer (20x), indeholder indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 4 er mærket: (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 32/60

Gastrisk cancer H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 8. Flaske 6, Wash Buffer (20x), indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% trometamol. Flaske 6 er mærket: H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. 9. Coverslip Sealant, indeholder 100% naphtha (råolie), hydrogenbehandlet let, og er mærket: Farlig H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Kan være livsfarligt, hvis det indtages og kommer i luftvejene. Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations- og lysudstyr samt til al håndtering af materialet. Undgå udledning til miljøet. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller en læge. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl eller brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regulativer. 10. Præparaterne og alle materialer, der komme i berøring med disse, skal både før og efter fiksering håndteres som værende i stand til at overføre smitte og skal bortskaffes under overholdelse af de korrekte forholdsregler (16). Pipetter aldrig med munden, og undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og præparater. Hvis reagenser kommer i kontakt med følsomme områder, skylles disse med rigelige mængder vand. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 33/60

Gastrisk cancer 11. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlagtige resultater. 12. Andre inkubationstider og -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 13. Andre vævsfikseringsmetoder og prøvetykkelser end de specificerede kan påvirke vævets morfologi og/eller signalets intensitet. 14. Undgå fordampning af HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding under hybridiseringen ved at sikre tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 15. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan føre til tab af ydeevne. 16. Bær passende personligt beskyttelsesudstyr for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 17. Det er på grund af de gastriske cancerpræparaters heterogene natur vigtigt at foretage en grundig scanning af hele præparatet for at evaluere signalfordelingen, inden området for signaltælling vælges. 18. Evaluering af meget små præparater anbefales ikke (således skal præparaterne have intakt morfologi og tilstrækkelige kerner til tælling). 19. Hvis der udføres HER2 FISH-analyse på et biopsipræparat, skal der analyseres flere (7-8) vurderbare biopsier fra forskellige regioner af tumoren for at sikre en pålidelig bestemmelse af HER2-status. 20. Med henblik på identifikationen af samtlige vævskerner i en biopsiprøve er det vigtigt at inspicere det H&E-farvede objektglas. 21. Der må kun anvendes rene farvningsskåle til pepsinnedsænkningsmetoden (trin 2, metode C). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 34/60

Gastrisk cancer Opbevaring Gastrisk HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding (flaske 3) skal opbevares mørkt ved -18 C. Alle øvrige reagenser kan opbevares mørkt ved 2 8 C. Alle reag enser tåler opbevaring i fryser. Frysning og optøning af reagenserne op til 10 gange påvirker ikke ydelsen. Pepsin, HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding og fluorescensmonteringsmedium (flaske 2A, 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse reagenser ved stuetemperatur. HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding og fluorescensmonteringsmedium (flaske 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er stemplet på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er specificeret i indlægssedlen, skal brugeren validere reagensernes ydeevne (13). Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt Dakos tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med HER2 IQFISH pharmdx. Klargøring af prøver Gastrisk Adenokarcinomprøver fra ventriklen herunder fra den gastroesofageale overgang fra biopsier, excisioner eller resektioner skal behandles for at bevare vævet til FISH-analyse. Der skal anvendes standardmetoder til behandling af væv til immuncytokemisk farvning for alle præparater (14). Ved test af små biopsipræparater fastslås intakt tumormorfologi og tilstedeværelsen af tilstrækkelige tumorceller for signaltælling. Hvis der udføres HER2 FISH-analyse på et biopsipræparat, skal der analyseres flere (7-8) vurderbare biopsier fra forskellige regioner af tumoren for at sikre en pålidelig bestemmelse af HER2-status. Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutral, bufferjusteret formalin og indstøbt i paraffin, er egnet til brug. Præparaterne kan f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i 18 24 timer i neutral, bufferjusteret formalin. Biopsipræparaterne blev fikseret i 6 8 timer under ToGA-forsøget (forsøgsreferencen findes under (25)). Derefter dehydreres vævene i en gradueret serie af ethanol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvis temperatur holdes på maks. 60 C. Korrekt fikserede og indstøb te vævssnit kan holde sig uendeligt inden opskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares køligt (15 25 C) (14, 15). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævsprøverne skal skæres i snit med en tykkelse på 3 6 µm. Objektglassene, der er nødvendige til analyse af HER2-genamplifikation og bekræftelse af tilstedeværelse af tumor, skal klargøres samtidigt. Det anbefales at anvende mindst 2 serielle snit, 1 snit til bekræftelse af tilstedeværelse af tumor farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E stain) og 1 snit til analyse for HER2-genamplifikation. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly L lysin coatede objektglas. Præparaterne skal analyseres inden for 4 6 måneder efter opskæring, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 35/60

Gastrisk cancer BRUGSVEJLEDNING Gastrisk A. Klargøring af reagens Gastrisk Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Forbehandlingsopløsning Der kan forekomme krystaller i Flaske 1, men de vil gå i opløsning ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 1 (forbehandlingsopløsning 20x) ved at fortynde koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet opløsning kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet opløsning, hvis den er uklar. A.2 Stringent vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 4 (stringent vaskebuffer 20x) ved at fortynde koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis de n er uklar. A.3 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde fra flaske 6 (vaskebuffer 20x) ved fortynding af koncentratet 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Ethanolserie Klargør 3 kar med henholdsvis 70%, 85% og 96% ethanol ud fra en 96% ethanolopløsning. Opbevar de tildækkede kar ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kasser opløsningerne, hvis de er uklare. A.5 Pepsinopløsning Der er kun brug for en pepsinopløsning ved anvendelse af pepsinneddypningsmetoden (metode C). Klargør pepsinopløsningen som følger: Klargør 60 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til seks objektglas. Tilsæt 48 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsindiluent (10x) (flas ke 2B) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) til be holderen. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Til en beholder med kapacitet til 24 objektglas og 240 ml pepsinopløsning: Tilsæt 192 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) pepsindiluent (10x) (fla ske 2B) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) til b eholderen. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Når pepsinopløsningen har nået den fastsatte temperatur, skal den bruges inden for 5 timer. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 36/60

B. Farvningsprocedure Gastrisk Gastrisk cancer B.1 Procedurebemærkninger Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal ækvilibreres til den rette temperatur inden brug som følger: Flaske 1: Den fortyndede forbehandlingsopløsning skal ækvilibreres til 95 99 C, hvis der anvendes vandbad til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode A). Hvis der anvendes en mikrobølgeovn med mulighed for registrering til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode B), skal den fortyndede forbehandlingsopløsning ækvilibreres til stuetemperatur 20 25 C. Flaske 2A: Pepsin skal anvendes ved 2 8 C (B3, Farvningsprotokol, Trin 2 Metode A og B) og holdes koldt konstant. Flaske 2B: Pepsindiluent (10x) skal anvendes ved 2 8 C (B3, Farvningsprotokol, Trin 2 Metode C). Flaske 3: HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding separerer i to faser, mens den opbevares ved -18 C. Før anvendelsen af flaske 3 skal det sikres, at der kun er én fase, ved at lade probeblandingen opnå stuetemperatur (20 25 C) efterfulgt af blanding. Optø flaske 3 ved stuetemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter ( beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken grundigt i 15 sekunder ved 2500 rpm med en hvirvelmikser. Opbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brug. Flaske 4: Fortyndet stringent vaskebuffer: Én beholder skal ækvilibreres til stuetemperatur, en anden beholder skal ækvilibreres til 63 (±2) C forud for brugen. Flaske 5: Fluorescensmonteringsmedium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 6: Den fortyndede vaskebuffer skal ækvilibreres til stuetemperatur 20 25 C. Dækglasforseglingsmidlet kan anvendes ved enhver temperatur fra 2 25 C. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren omfatter et antal dehydreringer efterfulgt af tørring af vævssnittene. Sørg for, at vævssnittene er helt tørre, inden der fortsættes til næste trin. Vævssnittene må ikke tørre under de andre proceduretrin. Hvis det er nødvendigt at afbryde farvningsproceduren, kan objektglassene opbevares i vaskebuffer efter afparaffineringstrinnet i maks. 1 time ved stuetemperatur (20 25 C) uden at dette påvirker resultaterne. B.2 Behandling af væv inden farvning Afparaffinering og rehydrering: Forud for analysens udførelse skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad, og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 96% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 70% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 4. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit B.3, Trin 1, Forbehandling. Xylen- og alkoholopløsningerne skal udskiftes efter 200 objektglas eller færre. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 37/60

Der kan anvendes xylenerstatninger. Gastrisk cancer BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturen kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. B.3 Farvningsprotokol Trin 1: Forbehandling Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A) eller alternativt ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B). Metode A: Forbehandling med vandbad Fyld farvningskar (f.eks. Coplin-kar) med den fortyndede forbehandlingsopløsning (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.1). Anbring farvningskarrene med den fortyndede forbehandlingsopløsningen i et vandbad. Opvarm vandbadet og forbehandlingsopløsningen til 95 99 C. Mål tempera turen i karret med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Sæt låg på karrene for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede forbehandlingsopløsning i farvningskarrene. Kontroller igen temperaturen og inkuber i 10 (±1) minutter, ved 95 99 C. Tag hele karret med objektglassene op af vandbadet. Tag låget af, og lad objektglassene køle af i forbehandlingsopløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Metode B: Forbehandling ved hjælp af mikrobølgeovn med mulighed for registrering Fyld et plastkar med fortyndet forbehandlingsopløsning ved stuetemperatur (20 25 C). Nedsænk de afparaffinerede snit i forbehandlingsopløsning, dæk karret med et låg med ventilationshuller, og placer det i mikrobølgeovnen. Aktiver kogepunktssensoren, og vælg et program, der kører i 10 minutter efter at temperaturen er nået op på kogepunktet*. Efter de 10 minutters inkubation tages karret med objektglas ud af ovnen, låget fjernes, og skålen lades henstå til afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Flyt objektglassene over i en skål med fortyndet vaskebuffer, og lad dem ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. * Kravet om brug af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering betyder, at ovnen skal have en sensor og programmer, som indledningsvis opvarmer forbehandlingsopløsningen til kogepunktet og derefter opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC), mens den forudindstillede tid tæller ned (10 (±1) minutter). På visse mikrobølgeovne med mulighed for registrering er det muligvis ikke muligt at indstille en valgfri nedtællingstid. Hvis ovnen kun har forudindstillede programmer, skal der vælges et program, som opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC) i mindst 10 (±1) minutter, hvorefter man skal stoppe programmet manuelt efter 10 (±1) minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Trin 2: Pepsin, brugsklar (RTU) eller pepsinopløsning Pepsininkubering kan udføres ved direkte anvendelse af RTU-pepsindråber på objektglassene enten ved stuetemperatur (20 25 C) (metode A) elle r ved 37 C (metode B). Alternativt kan objektglassene neddyppes i en pepsinopløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (metode C). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 38/60

Gastrisk cancer Metode A og metode B: Bank overskydende buffer af. Tør med en fnugfri klud (såsom en absorberende serviet eller et stykke gaze) omhyggeligt af rundt om prøven for at fjerne overskydende væske og holde reagenserne inden for det foreskrevne område. Tilsæt 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) pepsin (fl aske 2A) for at dække prøven. Opbevar altid pepsin ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, brugsklar - inkubering ved 20 25 C Inkuber i 5 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 5 15 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede vaskebuffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Metode B: Pepsin, brugsklar - inkubering ved 37 C Placer prøven med pepsin på en varmeblok ved 37 C - f.eks. en Dako Hybridizer - og inkuber i 3 5 minutter. En inkubationstid på 3 5 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank pepsinet af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Metode C: Pepsinopløsning - nedsænkning af objektglas i pepsinopløsning ved 37 C Sættet indeholder reagenser til fire separate kørsler (60 ml pepsinopløsning, lille beholder til seks objektglas) eller en enkelt kørsel (240 ml pepsinopløsning, stor beholder til 24 objektglas). Klargør pepsinopløsningen som beskrevet i afsnit A.5. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Sørg for, at temperaturen får tid til at stabilisere sig. Mål temperaturen i beholderen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Bank overskydende vaskebuffer af. Neddyp objektglassene i pepsinopløsningen ved 37 (±2) C. og inkuber i 20 30 minutter. En inkubationstid på 20 30 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsinopløsning af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Trin 3: HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding separerer i to faser, mens den opbevares ved -18 C. Før anvendelsen af flaske 3 skal det sikres, at der kun er én fase, ved at lade probeblandingen opnå stuetemperatur (20 25 C) efterfulgt af blanding. Optø flaske 3 ved stuetemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken grundigt i 15 sekunder ved 2500 rpm med en hvirvelmikser. Opbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brug. Tilsæt 10 µl HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding (flaske 3) over midten af vævssnittet. Anbring straks et 22 mm x 22 mm dækglas over probeblandingen, og lad det sprede sig jævnt under (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 39/60

Gastrisk cancer dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, fjernes de ved at slå forsigtigt på dækglasset med en pincet. Husk at opbevare flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brugen. Forsegl dækglasset med dækglasforseglingsmidlet ved at presse dette ud i en fuge langs kanten af dækglasset. Lad dækglasforseglingsmidlet overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at dækglasforseglingsmidlet dækker hele dækglassets kant. Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450 eller S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er mættede og optimale for brug. Start Hybridizer'en, og vælg et program, der: Denaturerer ved 66 C i 10 minutter efterfulgt af h ybridisering ved 45 C i 60 120 minutter. Placer objektglassene i Hybridizer en, sørg for, at låget er korrekt lukket, og start programmet. Der henvises til brugervejledningen til Dako Hybridizer for detaljerede oplysninger. * Instrumenter, der gør det muligt at opnå betingelser, der er identiske med de ovenfor beskrevne, kan anvendes til denaturering og hybridisering: Placer objektglassene på en jævn overflade af metal eller sten (varmeblok eller på en blok i en hybridiseringsovn), der er forvarmet til 66 ±1) C. Denaturer i nøjagtigt 10 minutter. Anbring objektglassene i et forvarmet, hybridiseringsfugtkammer. Læg låg over kammeret, og inkuber ved 45 (±2) C i 60 120 minutter. Bemærk, at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke er egnet til brug med proberne, der er indeholdt i dette sæt. Trin 4: Stringent vask Fyld to farvningskar (f.eks. Coplin-kar) med den fortyndede stringente vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Det anbefales at bruge mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hvert kar. Anbring det ene af farvningskarrene med fortyndet stringent vaskebuffer ved stuetemperatur i et stinkskab og det andet i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede stringente vaskebuffer til 63 (±2) C. Sørg for, at temperatur en har stabiliseret sig. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Den stringente vaskebuffer indeholder detergent og kan blive turbid ved 63 C. Dette påvirker ikke ydelsen. Tag objektglassene ud af hybridiseringskammeret ved hjælp af en pincet eller handsker, fjern forsigtigt dækglasforseglingsmidlet og dækglassene, og placer objektglassene i forvaskekarret, der har stuetemperatur, et ad gangen. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskekarret, der har stuetemperatur, til karret i det 63 (±2) varme va ndbad. Umiddelbart efter at have overført objektglassene til den 63 (±2) C varme beholder i vandbadet, skal timeren startes. Udfør stringent vask i nøjagtigt 10 minutter. Fjern objektglassene fra den fortyndede stringente vaskebuffer og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene tørre fuldstændigt. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 40/60

Gastrisk cancer Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI (flaske 5) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglassene opbevares mørkt ved -18 8 C. Kvalitetskontrol Gastrisk 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Normale celler bør indeholde 1 2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN-17- PNA-proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler skal ligeledes have 1-2 tydeligt synlige røde signaler, der indikerer, at HER2-DNA-proben har hybridiseret godt til HER2-amplikonet. På grund af vævssektionering vil nogle af de normale celler indeholde færre end de forventede 2 signaler af hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en analysefejl, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI-filter. Talrige spøgelseslignende celler og en generelt dårlig kernemorfologi indikerer overfordøjelse af prøven, hvilket resulterer i tab af eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Det mindste antal evaluerbare tumorceller er 20. 5. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning Gastrisk Evaluerbart væv Lokaliser tumoren på det HE farvede objektglas og evaluer det samme område på det FISH farvede objektglas (i DAPI-filteret). Kun prøver fra patienter med gastrisk eller gastroesofagealt overgangsadenokarcinom bør analyseres. I tilfælde med intestinal metaplasi og adenocarcinom i samme præparat skal kun carcinomkomponenten bedømmes. Undgå områder med kraftig inflammation, nekrose og områder, hvor de nukleære grænser er tvetydige. Tag ikke kerner med, der kræver subjektiv vurdering. Medtag ikke kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund. Begynd med en mikroskopisk vurdering af henholdsvis hele det FISH-farvede snit og det område, der er udpeget på H&E-snittet. Inden tællingen af det FISH farvede objektglas noteres den generelle signalfordeling (homogen eller heterogen) på arket til signaltælling. I tilfælde af heterogen fordeling noteres det, hvorvidt der forekommer fokal amplifikation eller enkeltcelleamplifikation (mosaik). 1) Homogen signalfordeling Såfremt signalfordelingen er homogen, tælles henholdsvis antallet af kromosomcentromerer (grønne signaler) og antallet af HER2-gener (røde signaler) fra 20 celler i 1-2 repræsentative tumorområder. 2) Heterogen signalfordeling Såfremt signaldistributionen er heterogen, evalueres i alt 20 celler fra udvalgte områder som specificeret herunder: A) Hvis der er fokal amplifikation, skal der udvælges områder med amplificerede celler. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 41/60

Gastrisk cancer B) I tilfælde af mosaikfordeling eller forekomst af amplificerede, polysomale og disomale celler tælles der i områder med amplificerede celler. Inden for disse områder skal ikke kun amplificerede celler men også de tilstødende ikke-amplificerede celler tælles til et samlet antal på 20 celler. Undgå om muligt at udvælge overlappende områder. Ignorer farvning af bakterielt DNA Et antal specialiserede celler (mastceller og makrofager), der findes spredt i det gastriske væv, udviser et højt farvningsniveau med HER2-proben på grund af forekomsten af bakterielt DNA. Dette resulterer i kraftigt røde fluorescerende celler, der tydeligt adskiller sig fra tumorceller med høj HER2-genamplifikation. Signaltælling Når et område er blevet udvalgt til signalevaluering, skal analysen startes i én af de 20 tilstødende valgte kerner, og derefter skal tælling foretages celle for celle, hvor der kun ses bort fra kerner, der ikke opfylder kvalitetskriteriet. Tæl antallet af signaler inden for den nukleære grænse for hver evalueret kerne i henhold til nedenstående vejledning (se ligeledes Appendiks 7). - Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. - Tæl to signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er (lig med eller) mindre end diameteren af signalet, som kun ét signal. Afstanden skal mindst være lig med diameteren af ét signal af normal størrelse for at tælle to individuelle signaler. Når afstanden mellem to signaler er mindre end diameteren af et signal, skal det tælles som ét. - I kerner med høje niveauer af HER2 genamplifikation, kan HER2-signalerne være placeret meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I disse tilfælde kan antallet af HER2- signaler ikke tælles, men må i stedet estimeres. Vær særlig opmærksom på de grønne signaler, da klynger af røde HER2-signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved anvendelse af et specifikt FITC-filter. Tæl ikke kerner uden signaler, eller med signaler af kun en farve, med. Tæl kun de kerner med, der indeholder et eller flere FISH-signaler af hver farve. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 42/60

Gastrisk cancer Tællevejledning 1 Skal ikke tælles. Kerner overlapper, ikke alle kerneområder er synlige. 2 To grønne signaler. Tæl ikke kerner med kun en signalfarve med 3 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 4 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 5 Tælles ikke med (under eller overfordøjede kerner). elle Manglende signaler i centrum af kernerne (donut-formede kerner). 6 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 7 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler 8 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 9 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC filter, eller tæl ikke kernen med Optegn tallene i en tabel som vist i Appendiks 5 og 6. Tæl 20 kerner pr. vævsprøve, når det er muligt, fra distinkte tumorområder. Beregn HER2/CEN-17-forholdet ved at dividere det samlede antal røde HER2-signaler med det samlede antal grønne CEN-17-signaler. Prøver med et HER2/CEN-17-forhold, der er større end eller lig med 2, skal betragtes som HER2-genamplificerede (26). Resultater ved eller tæt på cut-off (1,8 2,2) skal tolkes med forsigtighed. Hvis forholdet er borderline (1,8 2,2), tælles yderligere 40 kerner, og forholdet beregnes ud fra de 40 kerner. Hvis tællingen stadig er borderline, er resultatet af den anden evaluering gyldigt. En immunhistokemisk farvning af HER2 skal i givet fald indbefattes for bedre orientering under den anden tælling. I tvivlstilfælde skal prøven tælles igen. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskelig. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 43/60

Gastrisk cancer Begrænsninger Gastrisk 1. FISH er en flertrins diagnostisk proces, der kræver specialiseret uddannelse vedrørende valg af passende reagenser såvel som vævsselektion, -fiksering, -behandling og klargøring af FISH-objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. 2. FISH-resultaterne er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For optimale og reproducerbare resultater skal objektglassene med vævsprøverne afparaffineres fuldstændigt. Fjernelsen af paraffin skal være fuldført ved begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSVEJLEDNING, afsnit B.2). 4. Der må kun anvendes temperaturkalibrerede vandbade, varmeblokke og hybridiseringsovne. Brug af andre typer udstyr kan resultere i fordampning af HER2/CEN-17 IQISH-probeblanding under hybridiseringen, og skal valideres af brugeren. Præstationskarakteristika Gastrisk Baggrund Sikkerheden og effektiviteten ved trastuzumab (Herceptin ) er blevet påvist i en klinisk undersøgelse (ToGA-forsøget) (25). Undersøgelsen var udformet som en open-label, randomiseret, multicenter fase III-undersøgelse af HER2-positive patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk eller gastroesofagealt overgangsadenokarcinom. I ToGA-forsøget defineredes HER2-positivitet som værende enten IHC-positiv (3+) (HercepTest, Dako) og/eller positiv med HER2 FISH (HER2/CEN- 17 2,0)(HER2 FISH pharmdx Kit, Dako (kode K5331)). Patienterne blev efter inklusion i undersøgelsen randomiseret til at modtage kemoterapi (5 FU eller capecitabin og cisplatin) eller kemoterapi plus trastuzumab. Det primære endepunkt i undersøgelsen var generel overlevelse (OS). I undersøgelsen blev i alt 594 patienter randomiseret, og 584 patienter modtog forsøgsmedicinen og blev inkluderet i det fulde analysesæt (FAS). For det primære endepunkt viste kombinationen af kemoterapi plus trastuzumab sig at være statistisk bedre end kemoterapi alene. Den mediane OS steg fra 11,1 til 13,8 måneder (p=0,0046) med en hazard ratio på 0,74 (95% CI: 0,60 0,91). Kaplan-Meier-kurverne for OS vises i figur 3. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 44/60

Gastrisk cancer Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 Logrank-test P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Tid (måneder) Antal overlevende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 3. Kaplan-Meier-kurve for OS (n=584). Der blev udført præspecificerede, eksploratoriske undergruppeanalyser efter HER2- status, så snart dataene blev tilgængelige, og derudover blev to nye HER2-undergrupper defineret post hoc baseret på IHC-scoring: Gruppe 1 ( gruppe med lav HER2-ekspression ): Gruppe 2 ( gruppe med høj HER2-ekspression ): IHC 0/FISH+ og IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ og IHC 3+ (FISH+ eller FISH- eller FISH intet resultat) (n=446) Når den primære analyse af OS blev gentaget post hoc for gruppen med høj HER2- ekspression (n=446), var fordelene for den kombinerede behandling endnu større. Den mediane OS for gruppen af patienter, der havde modtaget kemoterapi plus trastuzumab, steg til 16,0 måneder sammenlignet med 11,8 måneder for patienterne på kemoterapi alene. Hazard ratio for denne analyse faldt til 0,65 (95% CI: 0,51 0,83). Kaplan-Meierkurverne for OS for gruppen med høj HER2-ekspression vises i figur 4. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 45/60

Gastrisk cancer Overlevelsessandsynlighed 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Tid (måneder) Antal overlevende Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Behandlingsgruppe Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Figur 4. Kaplan-Meier-kurve for OS for gruppen med høj HER2-ekspression (n=446). BO18255-undersøgelsen demonstrerede den kliniske nytte både af HercepTest og HER2 FISH pharmdx Kit til vurdering af HER2-status hos patienter med inoperabelt, lokalt fremskredent, tilbagevendende og/eller metastatisk gastrisk eller gastroesofagealt overgangsadenokarcinom. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet for HER2/CEN-17 IQISH-probeblandingen blev undersøgt ved anvendelse af 18 gastrisk cancer adenokarcinompræparater. Forholdet mellem antallet af HER2-signaler og CEN-17-signaler blev beregnet baseret på en tælling af 20 kerner fra normale celler omkring tumoren. HER2/CEN-17-forholdet for de 18 gastriske cancer adenokarcinomprøver var mellem 0,95 og 1,06. Analytisk specificitet HER2 DNA-proberne i HER2/CEN-17 IQISH-probeblandingen er blevet endesekvenseret og kortlagt for at bekræfte en samlet dækning på 218 kb inklusive HER2- genet. CEN-17 PNA-proberne i HER2/CEN-17 IQISH-probeblandingen er blevet testet individuelt og i kombination for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. For at måle analysens evne til kun at identificere målsubstanserne HER2 og CEN-17 uden interferens fra andre stoffer, blev der udført undersøgelser på gastriske cancer adenokarcinomprøver ved hjælp af flaske 3 indeholdende hybridiseringsbufferen men uden probeblandingen. I alt 18 prøver blev evalueret for tilstedeværelse af signaler, der ikke var relateret til probeblandingen. Der blev ikke observeret detektion af andre kromosommål eller interferens med nært beslægtede stoffer i nogen af de 18 prøver. Robusthedsundersøgelser HER2 IQFISH pharmdx analysens robusthed blev testet ved at ændre forbehandlingstiden, temperaturen og metoderne til opvarmning af forbehandlingsbufferen (mikrobølgeovn eller vandbad), pepsininkuberingstiden og -metoden (RTU-pepsin eller (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 46/60

Gastrisk cancer nedsænkning), denatureringstemperaturen og -tiden, hybridiseringstiden og tid og temperatur for den stringente vask. Der observeredes ingen betydende forskelle i resultater ved følgende eksperimentbetingelser: Forbehandling, metode A) Vandbad i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 95 C, 95 99 C og 99 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 95 99 C. Forbehandling, metode B) Mikrobølgeovn i 9, 10 og 11 minutter ved >95 C. Pepsinfordøjelse, metode A) med inkuberingstider på 5, 10 og 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Pepsinfordøjelse, metode B) med inkuberingstider på 3, 4 og 5 minutter ved 37 C). Pepsinfordøjelse, metode C)med inkuberingstider på 20, 25 og 30 minutter kombineret med hver af temperaturerne 35, 37 og 39 C. Denaturering i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 65, 66 og 67 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 66 C. Hybridiseringstider på 60, 90 og 120 minutter ved 45 C. Stringent vask i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 61, 63 og 65 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 63 C. Bemærk: I forbindelse med robusthedstestene blev kun et enkelt af farvningsprocedurens parametre ændret ad gangen, mens alle øvrige parametre blev holdt konstante. Det anbefales, at man overholder de tider og temperaturer, der er angivet i farvningsproceduren. Farvningsproceduren til HER2 IQFISH pharmdx byder på protokolvariabler for så vidt angår varme-forbehandling, pepsinfordøjelse og hybridiseringstid. Hver af de unikke kombinationer er blevet valideret med hensyn til HER2-genstatus. Valideringen blev udført på 10 FFPE-prøver af humant gastrisk og gastroesofagealt overgangsadenokarcinom for hver af de 12 mulige kombinationer. HER2 FISH pharmdx Kit (K5331) blev brugt som reference. HER2/CEN-17-forholdet for hver enkelt af prøverne ses i figur 5. Krydstabuleringer mellem de 12 test og referencefarvningen viste en generel overensstemmelse for så vidt angår HER2- genstatus på 100% (10/10) med nedre og øvre tohalede 95% konfidensgrænser på henholdsvis 78,3% og 100%. Kappa-værdien var 1,00, og McNemars test viste fravær af bias (tohalet t-værdi på 1,00). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 47/60

Gastrisk cancer Figur 5. Individuelle HER2/CEN-17-forhold for 10 humane gastriske adenokarcinomprøver farvet med de 12 mulige kombinationer af protokolvarianter med HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) (test 1-12) og HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331) reference (R). Den vandrette linje viser cut-off-værdien på 2,0. Reproducerbarhed Reproducerbarheden for HER2/CEN-17-forholdet blev undersøgt med HER2 IQFISH pharmdx analysen ved hjælp af på hinanden følgende snit af ni forskellige gastriske adenokarcinomprøver enten med ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Der blev testet tre snit af hver prøve i samme kørsel. Den gennemsnitlige variationskoefficient var 3,5% for ikke-amplificerede prøver (område fra 1% til 5%) og 2,8% for amplificerede prøver (område fra 1% til 5%). Reproducerbarheden på efter hinanden følgende snit af gastriske adenokarcinomprøver med forskellige tykkelser (2, 3, 4, 5, 6 og 7 µm) blev testet med HER2 IQFISH pharmdx. Den gennemsnitlige variationskoefficient for HER2/CEN-17-forholdet var 4,5% (område fra 3% til 6%). dvs. samme område som for væv af samme tykkelse og inden for grænserne for de på forhånd opstillede kriterier for accept. Reproducerbarhed HER2 IQFISH pharmdx analysen blev testet for lot-til-lot- og observatør-til-observatørreproducerbarhed ved hjælp af tre lot af HER2 IQFISH pharmdx og tre observatører. Reproducerbarheden blev testet på ni forskellige gastriske adenokarcinomprøver enten med ikke-amplificeret eller amplificeret HER2-genstatus. Den gennemsnitlige variationskoefficient lot-til-lot-reproducerbarhed var 3,8% for ikkeamplificerede prøver (område fra 2% til 7%) og 1,8% for amplificerede prøver (område fra 1% til 3%). Den gennemsnitlige variationskoefficient for observatør-til-observatør-reproducerbarhed var 4,3% for ikke-amplificerede prøver (område fra 3% til 5%) og 4,4% for amplificerede prøver (område fra 2% til 7%). De gastriske adenokarcinomprøver bestod af 78,8% resektions- og 22,2% biopsiprøver. 55,6% af prøverne blev taget i ventriklen og 44,4% i den gastroesofageale overgang. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 48/60

Gastrisk cancer Klinisk anvendelighed Den kliniske anvendelighed af Dako HER2 IQFISH pharmdx (kode K5731) blev undersøgt i en komparativ undersøgelse med Dako HER2 FISH pharmdx Kit (kode K5331). Undersøgelsen omfattede 79 gastriske cancerprøver bestående af forskellige gastriske adenokarcinomvævstyper herunder ventrikel- eller gastoesofageale overgangsadenokarcinomer og resektioner eller biopsier med homogen eller heterogen (fokal eller mosaik) signalfordeling. Tumorerne var alle blevet evalueret for HER2- proteinudtrykkelsesstatus ved hjælp af Dako HercepTest (kode K5207). Prøver fra hver af de fire IHC-scoringsgrupper (0, 1+, 2+, 3+) blev inkluderet i undersøgelsen. Krydstabulering af HER2-status opnået med de to analyser gav en generel overensstemmelse på 98,7% med nedre og øvre grænser for 95% konfidensintervallet på 94,2% og 99,9%. Kappaværdien var 0,97 med nedre og øvre grænser for 95% konfidensintervallet på 0,92 og 1,00. p-værdien for McNemars test var 1,00, hvilket peger på fravær af bias mellem de to analyser. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 49/60

Gastrisk cancer Fejlfinding Gastrisk Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler. 1a. Sættet har været udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring. 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Kontroller, om der stadig var tøris i pakken ved modtagelsen. Kontroller, at flaske 3 har været opbevaret mørkt ved -18 C. Kontroller, at flaske 2A og 5 har været opbevaret mørkt og ved højst 2 8 C. 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til anvendelse sammen med kittets fluorokromer og at kviksølvlampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt ud over den forventede levetid. (Se appendiks 7). I tilfælde af tvivl kontaktes leverandøren af mikroskopet. 1c. Falmede signaler 1c. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 1d. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 1e. Fordampning af probeblanding under hybridisering. 1d. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 1e. Sørg for tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 2. Ingen grønne signaler 2a. Ukorrekte betingelser for stringent vask. 2a. Sørg for at anvende den anbefalede temperatur og tid for stringent vask og at fjerne dækglas inden udførelse af stringent vask. 3. Ingen røde signaler. 4. Områder uden signal 3a. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 3a. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 4a. Probevolumen er for lille. 4a. Sørg for, at probevolumen er stor nok til at dække området under dækglasset. 4b. Der er opstået luftbobler under tilsætning af probeblanding eller montering. 4b. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 50/60

Gastrisk cancer Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 5. Overdreven baggrundsfarvning 5a. Ukorrekt vævsfiksering. 5a. Sørg for kun at anvende formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 5b. Paraffinen er ikke helt fjernet. 5b. Følg proceduren for afparaffinering og rehydrering beskrevet i afsnit B.2. 5c. For lav temperatur for stringent vask. 5c. Sørg for, at temperaturen for stringent vask er 63 (±2) C. 6. Dårlig vævsmorfologi 7. Kraftig grøn autofluorescens på objektglasset herunder i områder uden FFPE-væv 5d. Langvarig eksponering af det hybridiserede snit for kraftigt lys 5d. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet, og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 6a. Ukorrekt pepsinbehandling. 6a. Overhold de anbefalede pepsininkubationstider. Se afsnit B.3, Trin 2. Sørg for at håndtere Pepsin ved den korrekte temperatur. Se afsnit B.1. 6b. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser kan medføre et uklart eller tåget udseende. 6c. For langvarig pepsinbehandling eller en meget tynd snittykkelse kan føre til forekomst af spøgelsesceller eller "donut"-celler. 7. Brug af udløbne eller ikkeanbefalede glasobjektglas 6b. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 6c. Forkort Pepsininkubationstiden. Se afsnit B.3, Trin 2. Sørg for, at snittykkelsen er 3 6 µm. 7. Kontroller, at det belagte glasobjektglas (Dako Silanized Slides, kode S3003 eller poly-l-lysinbelagte objektglas) ikke har overskredet udløbsdatoen. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 51/60

Gastrisk cancer Appendiks 4 Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Protokolcheckliste Farvningskørslens log-id: Dato for kørslen: HER2 IQFISH pharmdx, K5731 Lot: Prøve-ID: Udstyrs-ID: Dato for fortynding/udløb af 1 x vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20): / Vævet fikseret i neutral, bufferjusteret formalin Ja Nej Trin 1: Forbehandling Dato for fortynding/udløb af forbehandlingsopløsning (flaske 1 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af forbehandlingsopløsning (95 99 C) hvis der anvendes et vandbad til opvarmning. C Forbehandling (10 minutter) og afkøling (15 minutter) Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Trin 2: Pepsin Varighed af pepsinbehandling (flaske 2) ved 37 ºC eller Varighed af pepsinbehandling (flaske 2) ved stuetemperatur eller Varighed af pepsinneddypning ved 37 (±2) C Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i graduerede serier af ethanol og lufttør Trin 3: HER2/CEN-17-probeblanding minutter minutter minutter Tilsæt probeblanding (flaske 3), læg dækglas på og forsegl med dækglasforseglingsmiddel Målt denatureringstemperatur (66 (±1) C) C Denaturering i 10 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 (±2) C) C Hybridiseringstid (60 til 120 minutter) Trin 4: Stringent vask minutter Dato for fortynding/udløb af stringent vaskebuffer (flaske 4 / fortyndet 1:20) Målt temperatur af stringent vaskebuffer (63 (±2) C) C Stringent vask (10 minutter) efter fjernelse af dækglas Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) C Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i graduerede serier af ethanol og lufttør minutter (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 52/60

Gastrisk cancer Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl fluorescensmonteringsmedium (flaske 5) og læg dækglas på Kommentarer: Dato og underskrift, tekniker: (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 53/60

Gastrisk cancer Appendiks 5 Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Scoringsskema HER2 IQFISH pharmdx, K5731 lot: Farvningskørsels-log-ID: Dato for kørslen: Prøve-ID: Karakterisering af signalfordeling i væv: Homogen: Heterogen fokal: eller Heterogen mosaik: Tæl signaler i 20 kerner Kerne nr. Rød Grøn (HER2) (CEN 17) Kerne nr. 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 I alt 1-10 I alt 11 20 Rød (HER2) Grøn (CEN 17) Til bestemmelse af HER2/CEN-17-forholdet tælles antallet af HER2-signaler og antallet af CEN-17-signaler i de samme 20 kerner, og det samlede antal HER2-signaler divideres med det samlede antal CEN-17-signaler. Hvis HER2/CEN-17-forholdet er borderline (1,8 2,2) tælles yderligere 40 kerner, og forholdet beregnes igen (der henvises til scoringsskemaet for ny tælling). Resultater ved eller tæt på cut-off (1,8 2,2) skal fortolkes med forsigtighed (se tællevejledningen). (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 54/60

Gastrisk cancer HER2 FISH HER2 CEN-17 HER2/CEN 17 forhold SAMLET SCORE (1-20) Forhold < 2: Der blev ikke observeret HER2-genamplifikation Forhold 2: Der blev observeret HER2-genamplifikation Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 55/60

Appendiks 6 Gastrisk Gastrisk cancer HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Scoringsskema til ny tælling HER2 IQFISH pharmdx, K5731 lot: Farvningskørsels-log-ID: Dato for kørslen: Prøve-ID: Signaler i 40 ekstra kerner (1 40) Kerne nr. Rød HER2- Grøn CEN-17 Kerne nr. Rød HER2- Grøn CEN-17 Kerne nr. Rød HER2- Grøn CEN-17 Kerne nr. 1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 33 4 14 24 34 5 15 25 35 6 16 26 36 7 17 27 37 8 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 I alt I alt I alt I alt 1-10 11-20 21-30 31-40 Rød HER2- Grøn CEN-17 Til bestemmelse af HER2/CEN-17-forholdet tælles antallet af HER2-signaler og antallet af CEN-17-signaler i de samme 40 kerner, og det samlede antal HER2-signaler divideres med det samlede antal CEN-17-signaler. Anfør samlet score fra de 1 40 kerner i nedenstående skema. HER2 FISH HER2- CEN-17 HER2/CEN 17 forhold SAMLET SCORE (1 40) Forhold < 2: Der blev ikke observeret HER2-genamplifikation Forhold 2: Der blev observeret HER2-genamplifikation Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 56/60

Gastrisk cancer Appendiks 7 Gastrisk HER2 IQFISH pharmdx, kode K5731 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til anvendelse sammen med HER2 IQFISH pharmdx, K5731: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden). 3. Objektiver Til screening af vævene kan der anvendes fluorescens tør 10x eller fluorescens olieimmersion 16x objektiver. Til højeffektsforstørrelse og bedømmelse af signaler kan der kun anbefales fluorescens olieimmersion objektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtrene udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler anvendelse af et specifikt DAPI-filter i kombination med et højkvalitets Texas Red/FITC dobbeltfilter. DAPI-filter, f.eks. Chroma filter # 31000. Texas Red/FITC dobbeltfilter, f.eks. Chroma filter # 51006. Texas Red og FITC enkelte filtre kan anvendes til bekræftelse. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt mikroskopleverandøren eller den lokale Dako-repræsentant for yderligere detaljerede oplysninger. 5. Olie Ikke fluorescerende olie. Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke. Rhodaminfiltre kan ikke anvendes. Tripelfiltre anbefales ikke. Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt rettet ind og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Man skal bestræbe sig på at udsætte prøven for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Vi anbefaler, at De diskuterer opsætningen af Deres mikroskop med producenten, eller læser litteraturen, inden De påbegynder in situ fluorescenshybridiseringen. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 57/60

Referencer 1. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1997;76(1-2):34-5. 2. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230(4730):1132-9. 3. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229(4717):974-6. 4. Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol 1999;9(4):319-25. 5. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89(12):5321-5. 6. Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30(1):41-8. 7. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235(4785):177-82. 8. Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res 2001;61(3):1214-9. 9. Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990;50(14):4332-7. 10. Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci 2002;32(1):3-11. 11. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16(2):173-82. 12. Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press 1999. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA: NCCLS. 1997. 14. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February 28. 1992. 15. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company. 1980. 16. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press 1981. 17. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92(12):2965-74. 18. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2000;53(12):890-2. 19. Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology 2001;61 Suppl 2:22-30. 20. Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010;78(1):26-33. 21. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007;59(6):795-805. 22. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008;32(1):89-95. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 58/60

23. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005;27(3):681-5. 24. Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16(2):273-8. 25. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376(9742):687-97 26. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology 2008;52(7):797-805. (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 59/60

Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer Medicinsk produkt til in vitro diagnostik Må ikke udsættes for sollys (se afsnittet om opbevaring) Anvendes senest Se brugsanvisningen Indeholder tilstrækkeligt materiale til <n> tests Producent GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 www.dako.com (128961-001) P04090DK_01_K573111-2/2015.06 s. 60/60