Vestsjællands Amtssygehus Klinisk Biokemisk Afdeling Centralsygehuset i Slagelse

Transkript

1 Bilag D Vestsjællands Amtssygehus Klinisk Biokemisk Afdeling Centralsygehuset i Slagelse INTERN RAPPORT Afprøvning af Immunofixation af M-komponenter (Bestemmelse af immunoglobulin-klasse og -type) på Hydrasys fra Sebia Tillæg til Afprøvning af Hydrasys fra Sebia, ILS ApS Til analysering af Elektroforeser Januar Dorit Borgstrup, Birgit Hansen og Mikala Klok Jørgensen April 2003

2 1. INTRODUKTION... 3 RESUMÉ... 3 BEGRUNDELSE FOR OPSÆTNING AF ANALYSEN... 3 BESKRIVELSE AF METODEN MATERIALER OG METODER... 3 PRØVE- OG KONTROL-MATERIALE... 3 APPARATUR... 4 REAGENSER... 4 PROGRAMMERING AF MASKINE/PROGRAMPARAMETRE... 4 METODESAMMENLIGNING RESULTATER OG DISKUSSION... 5 PRØVEMATERIALE... 5 HÆMOLYSE, LIPÆMI, IKTERI... 5 FEJLKILDER... 5 REFERENCEINTERVAL KONKLUSION LITTERATUR- OG BILAG

3 1. Introduktion Resumé Denne rapport er et tillæg til den oprindelige afprøvningsrapport for Hydrasys fra Sebia. Det skal vurderes, om udstyret og de tilhørende kits kan anvendes til klasseog type-bestemmelse af M-komponenter i serum. Metode/diskussion: Til vurdering af analysen blev rekvireret 7 serum-prøver fra Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) Holbæk, hvori der dér var fundet og klasse- /type-bestemt M-komponent. Disse prøver samt 4 prøver, der tidligere var analyseret på KBA Slagelse ved anvendelse af det nu nedbrudte elektroforeseapparatur, blev re-analyseret ved brug Hydrasys fra Sebia og det tilhørende kit til klasse- og typebestemmelse af M-komponenter. I alle prøver blev M-komponent klasse og type påvist i overensstemmelse med de tidligere bestemmelser. Konklusion: Vi mener, at serum M-komponent kan klasse- og typebestemmes tilfredsstillende ved den anvendte metode. Begrundelse for opsætning af analysen Som hovedrapporten Beskrivelse af metoden Immunofixation af M-komponenter Der køres elektroforese i gel af typen Hydragel 2 IF. Samme prøve køres i seks parallelle baner. Efter elektroforesen inkuberes hver bane med forskellige antistofopløsninger (se nedenfor). Efter inkubation vaskes gelen grundigt, hvorved alt ikkeimmunfixeret protein vaskes ud. Derefter farves gelen, hvorved immunfixeret protein bliver synligt. Det vil herefter af båndmønstret være muligt at vurdere, hvorvidt der findes en eller flere M-komponenter i serumprøver og i dette tilfælde bestemme M-komponentens klasse (IgG/IgA/IgM) og type (kappa/lambda). 1: Fixeringsopløsning 2: antistof mod IgG tunge kæder (anti-γ), 3: antistof mod IgA tunge kæder (anti-α), 4: antistof mod IgM tunge kæder (anti-µ), 5: anti-stoffer mod frie og bundne lette kappa kæder (anti-κ), 6: anti-stoffer mod frie og bundne lette lambda kæder (anti-λ). 2. Materialer og metoder Prøve- og kontrol-materiale Til afprøvning af klasse- og typebestemmelse af M-komponent er anvendt dels 4 sera, der tidligere er klasse- og typebestemt i KBA, Slagelse, ved analyse på det kasserede udstyr, dels er der anvendt 7 sera, der tidligere er blevet klasse- og 3

4 typebestemt i KBA, Holbæk. Resultater af tidligere klasse- og typebestemmelse af de 11 sera ses i tabel 1. Apparatur Som hovedrapport Reagenser Der anvendes kittet HYDRAGEL 2 IF fra Sebia (katalognummer PN4152, lot-nummer 26092/04), udløbsdato juli 2004, indlægsseddel vedlagt som bilag A. Destaining solution fra Sebia (katalognummer PN4540) indlægsseddel vedlagt som bilag B. HYDRASYS Wash Solution fra Sebia (katalognummer PN4541) indlægs-seddel vedlagt som bilag C. Ingen reagenser var over udløbsdatoen. Programmering af maskine/programparametre Maskinen programmeres til at køre programmet IF (forprogrammeret). Metodesammenligning Det har været muligt at fremskaffe i alt 10 prøver indeholdende M-komponent og 1 prøve uden M-komponent, hvorpå der tidligere er foretaget klasse- og type bestemmelse. Disse prøver analyseres på Hydrasys-apparaturet. Der testes dermed kun en enkelt negativ prøve, idet de fremkomne bånd ligger forskelligt i gelerne og således er hinandens negative kontrol. Der findes kun 4 prøver, der tidligere har været testet på vort gamle udstyr. Derfor blev det valgt også at sammenligne analysesvar fra afprøvningen af den nye analyse med analysesvar på 7 prøver fra KBA Holbæk. 4

5 3. Resultater og diskussion Der blev analyseret i alt 11 prøver, hvori der tidligere var fundet og klasse- og typebestemt M-komponent. Bestemmelser foretaget ved brug af kittet Hydragel 2 IF og Hydrasys elektroforese-udstyr var overensstemmende med de tidligere bestemmelser i KBA på Holbæk eller i Slagelse (se tabel 1). TABEL1 Prøve nr. Bestemmelse i KBA Holbæk Bestemmelse ved gammel metode i KBA Slagelse Bestemmelse ved ny metode i KBA Slagelse x IgM kappa - 2x IgM kappa IgG kappa - IgG kappa x IgM kappa - 3x IgM kappa IgM kappa - IgM kappa IgM kappa - IgM kappa IgM kappa + IgM lambda - IgM kappa + IgM lambda IgG kappa + IgG lambda - IgG kappa + IgG lambda IgG kappa* IgG Kappa negativ* negativ IgG kappa* IgG kappa IgG lambda* IgG lambda *) Dette resultatet er også nævnt i den oprindelige dokumentationsrapport: Afprøvning af Hydrasys fra Sebia, ILS ApS til analysering af Elektroforeser, januar Prøvemateriale Hæmolyse, lipæmi, ikteri Analysen udføres på serum Serum må ikke være hæmolyseret, da dette vil påvirke protein-indholdet (Bilag A). Serum må gerne være lipæmisk, men kræver i dette tilfælde speciel forbehandling før prøven påsættes (Bilag A). Sker dette ikke, vil apparatet ikke kunne sætte prøvematerialet på gelen. Der er ikke analyseret lipæmiske sera under denne afprøvning. Ikteri vil ikke påvirke analyseresultatet. Fejlkilder 5

6 Som hovedrapport Referenceinterval Minus M-komponent 4. Konklusion Vi mener, at M-komponenter kan findes, klassificeres og typebestemmes tilfredsstillende ved den anvendte metode. 5. Litteratur- og bilag Bilag A kitvejledning til Hydragel 2 IF kit Bilag B kitvejledning til Destaining Solution Bilag C HYDRASYS Wash Solution Bilag D (scannede geler) findes i mappen R:\klinisk biokemi\rapporter\afprøvninger\hydrasys elektroforeseapparat\afprøvningsrapport Immunofixation\ bilag D... 6

7 Bilag B: Destaining solution SEBIA, PN 4540, 10 flasker á 100 ml Fremstilling: 5 ml Destaining Solution fortyndes til 5 l med vand fra den grønne hane. Bland grundigt. Efter fortyndingen vil opløsningen indeholde 0,5 g Citronsyre / l Bruges til at fjerne overskud af farve fra gelen samt til rensning af farvekammeret efter vasketrinnet. Opbevaring: Stam- og fortyndet opløsning opbevares ved o C. Dunken tømmes for eventuelle rester og skylles med vand fra den grønne hane inden den nye opløsning kommer i. Stabilitet: Stamopløsning er holdbar til udløsdato. Den fortyndede opløsning er holdbar i 1 uge ved stuetemp. i lukket beholder. Der må ikke tilsættes Natrium azid. Kasser opløsningen hvis den ændrer udseende, f.eks. bliver uklar på grund af bakterievækst. Hvis opløsningen skal bruges i over 1 uge kan man forebygge bakterievæksten ved at tilsætte 50 µl ProClin 300 / l fortyndet opløsning. Affaldstype: Hældes i vasken sammen med rindende vand. 7

8 Bilag C: HYDRASYS Wash solution, 10 flasker á 80 ml Fremstilling: 1 flaske med 80 ml Wash Solution fortyndes op til 5 l med vand fra den grønne hane. Bland grundigt. Efter fortynding indeholder opløsningen alkalisk buffer ph 8,8 ±0,3 og Na-azid. HYDRASYS Wash solution indeholder 0,625% Na-azid Ætsende R 22: Farlig ved indtagelse R 32: Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre, bly og kobber. Bruges til at vaske upræcipiterede proteiner væk fra gelen og til rensning af farvekammeret. Opbevaring: Stam-og fortyndet opløsning opbevares ved o C. Dunken tømmes for eventuelle rester og skylles med vand fra den fra den grønne hane inden den nye opløsning kommer i. Stabilitet: Stam- og fortyndet opløsning er holdbare til stamopløsningens udløsdato. Affaldstype: Flasken med stamopløsnings lægges i en gul affaldspose Den fortyndede opløsning hældes i vasken sammen med rindende vand. 8