Indholdsfortegnelse: Indholdsfortegnelse:... Forord:...2 Indledning:...2 Teori:...3 Vicinale diketoner:...3 Dannelsen af diacetyl:...4 Nedbrydelsen af diacetyl:...6 Gærtyperne:...7 Forsøg:...9 Materialer:...9 Forsøg i køleskab:...9 Forsøg i varmeskab:...9 Fremgangsmåde:... Bearbejdning af prøver:...3 Resultater:...4 Gaschromotograf og SCABA:...4 Temperatur:...9 Diskussion:...9 Resultater:...2 Diacetyls rolle i gærcellernes stofskifte:...25 Vurder fremtidig effektivisering af ølbrygning:...26 Konklusion:...27 Litteraturliste:...29 Primærlitteratur:...29 Sekundær Litteratur:...3 Mundtlige Kilder:...3 Noter og bilag:...3 - -
Forord: Indledningsvis vil jeg starte med at sige tak til Albani Bryggerierne A/S. Ikke kun fordi jeg har kunne låne deres udstyr på laboratoriet, men i særdeleshed også fordi de, især laboratoriechef Lars Bo Mathiesen og laborant John B. Larsen, har hjulpet mig med at finde et emne som jeg syntes var spændende og som var realistisk og skrive en 3. års opgave omkring. Endvidere vil jeg gerne takke Dansk Industri for at have formidlet kontakten til Albani Bryggerierne i form af det Industri Stipendium jeg modtog af dem i uge 45. Jeg vil også takke brygmester Carsten Andersen, Den Skandinaviske Bryggerhøjskole, for at have stillet deres bibliotek til rådighed og for at have hjulpet mig med at finde brugbart materiale til min opgave. Jeg vil også takke Novozymes, især Rikke Festersen, for at have besvaret alle mine spørgsmål, samt hjulpet mig med materiale. Til sidst vil jeg takke De Danske Spritfabrikker for det materiale de har sendt mig Indledning: Grunden til at jeg fandt interesse for at skrive om koncentrationen af det lille organiske molekyle diacetyl, er at jeg under mit besøg på Albani så hvor meget apparatur og hvor meget tid de bruger på dette ene molekyle. Grunden til at det blev det, var en samtale jeg havde med Lars Bo Mathisen. Vi snakkede om hvad grunden var til at netop koncentrationen af diacetyl, var så vigtig at vide når man bryggede øl. Der er to grunde. For det første har diacetyl en utrolig kraftig aroma af smør eller honning, se/lugt vedlagte prøve udendørs. Det er denne aroma der giver smør sin smag og man kan derfor finde diacetyl som tilsætningsstof i bl.a. plantemargarine. Denne aroma kan nok afskrække de fleste. Derfor skal diacetyl koncentrationen i øllet inden det tappes på Albani ligger under, den af Albani definerede, smagsgrænsen på. mg/l. Ikke desto mindre findes der øl hvor koncentrationen af diacetyl er væsentligt over denne grænse. F.eks. findes der britiske portere og ales der kan have niveauer så høje som,6 mg/l. På baggrund af dette alene kan man ikke principielt sige at diacetyl er % uønsket i øl. Det er jo trods alt et aromastof om man så kan lide der eller ej. Grunden at diacetyl alligevel er bandlyst i langt de fleste øl er sammenkoblingen mellem diacetyl og øl-sarcina. Øl-sarcina eller sarcinasyge er resultatet af en infektion i øllet med ølpediokokker som er i stand til at danne diacetyl og derved give øllet en uønsket smag. Det er denne sidste grund der er den egentligt grund til at diacetyl er uønsket i øl. Ganske enkelt på grund af at man fra gammel tid forbandt - 2 -
diacetyl med infektion af øllet af pediokokker, samt definitionen af diacetyl som en uønsket aroma. Det er på denne baggrund at jeg har valgt emnet og det dertil hørende forsøg som jeg selv har designet. Jeg har lavet et gæringsforsøg ved to forskellige temperaturer dels med bagegær og dels med bryggær. Dette forsøg og de deraf afledte resultater samt teoretisk viden skulle gerne sætte mig i en position hvor jeg kan besvare følgende punkter fyldestgørende: Redegør for metodiske overvejelser og den endelige metode, samt teorien bag det eksperimentelle arbejde. Analyser og diskuter resultater, og bedøm diacetyls rolle i gærcellernes stofskifte. Vurder fremtidig effektivisering af ølbrygning. Teori: Vicinale diketoner: Diacetyl 2 og dens homologe forbindelse 2,3.pentandion 3 er to vicinale 4 diketoner, som er afgørende for aromaen i øl. Navnet VDK henviser til de to ketongrupper der er vicinale i begge molekyler. Diacetyl og 2,3-pentandion adskiller fra hinanden ved at 2,3-pentandion indeholder er en methyl-gruppe på kulstof atom nummer 4. Jeg vil herefter ikke beskæftige mig mere med 2,3-pentandion, udover at nævne at dannelsen og nedbrydelsen af 2,3-pentandion er analog med dannelsen af og nedbrydelsen af diacetyl. Derved skal forstås at ligesom diacetyl dannes af forstadiet til valin (α-acetolaktat), dannes 2,3-pentandion udfra forstadiet til isoleusin (α-acetohydroxybutyrat). En konstatering af præcist hvor ens de to stoffer er ses ved at det er det samme enzym som danner både α-acetolaktat og α-acetohydroxybutyrat, de såkaldte α-acetohydroxysyrer. - 3 -
Dannelsen af diacetyl: Diacetyl dannes som et biprodukt at glykolysen, nærmere betegnet syntesen af aminosyren valin. Se figur 3 5. Diacetyl dannes i princippet ud fra to pyruvat molekyler. Det ene pyruvat molekyler sættes, ved hjælp af transferasen Acetolaktat syntease, sammen med coenzymet thiamin pyrofosfat 6. Dette kompleks decarboxyleres derefter af pyrovat decarboxylase til α- hydroxyethyl-tpp. Dette stof kaldes også aktivt acetaldehyd. Dette skyldes den energirige binding mellem acetaldehyd og TPP. α-hydroxyethyl-tpp kan gå to veje. Største delen af det producerede α-hydroxyethyl-tpp vil blive omdannet til frit acetaldehyd samt TPP. Dette acetaldehyd vil normalt reagere som følgende og danne ethanol: CH 3 CHO + NADH + H + CH 3 CH 2 OH + NAD + - 4 -
Denne reaktion forekommer kun under anaerobe forhold, og skyldes at gærcellerne skal have oxideret NADH til NAD + som er den begrænsende faktor for hvor hurtigt de kataboliske processer i glykolysen kan forekomme. Det α-hydroxyethyl-tpp som ikke omdannes til ethanol, bruges til opbygning af aminosyrer som gærcellen behøver for at kunne formere sig. Således reagere α-hydroxyethyl-tpp med et pyruvat molekyle og omdannes ved hjælp af acetolaktat syntease (AS) til α-acetolaktat. Enzymet AS spiller altså en væsentlig rolle i dannelsen af diacetyl, idet det både sætter pyrovat sammen med TPP og danner begge α-acetohydroxysyrer. Dette enzym er et regulatorisk allosterisk enzym. AS s aktive center ændres ved høje koncentrationer af aminosyrerne valin og isoleusin, se figur 4 7. Disse to aminosyrer virker som modulatorer på AS. Det ses at der selv ved høje koncentrationer dannes acetolaktat, og det ser ud som om der er en grænse for hvor meget valin kan hæmme AS. Denne effekt vare dog ved selv ved meget små koncentrationer at valin. Dette er praktisk i den henseende at de ville være spild af energi for gærcellen af lave en masse valin selv om der var masser tilstede i cytoplasmaen. AS er det eneste enzym, der er omtalt i litteraturen, der indgår i dannelsen af diacetyl, der er allosterisk og som kan katalyserer flere forskellige processer. Derfor må man formode af alle de andre enzymer er specifikke og ikke påvirkelige af substrater eller metabolitter. Den dannede α-acetolaktat udskilles derefter til substraten. Man mener i dag ikke at gæren optager de hydroxysyrer som cellerne tidligere har spyttet ud. Dette underbygges også stærkt af at α-acetolaktat fjernes fra øllet med en hastighed som er lig den vi kan beregne. 8. Dette faktum samt samspillet mellem valin og α-acetolaktat koncentration tyder på at α-acetolaktaten bliver transporteret ud af cellen ved hjælp af faciliteret transport, gennem et uniport-transport membran protein. Således vil koncentrationen af α- - 5 -
acetolaktat inde i cellen være højere under selve hovedgæringen, hvorefter at det omvendte vil være tilfældet når glykolysen bremses af lave koncentration af coenzymet NAD +. Ude i substraten sker der ved en ren kemisk reaktion en oxidativ decarboxylering af α-acetolaktat til diacetyl. Denne reaktion sker ikke kun når der er ilt tilstede. I så tilfælde ville der jo ikke dannes noget diacetyl under en anaerob gæring. Den oxidering der sker foretages dels af evt. ilt, men hovedsageligt af metalioner der eksistere frit i substraten. Idet disse metalioner skal fungere som elektron donor er der kun metalioner som Cu +2, Al +3 og Fe +3 der indgår i processen. Idet denne reaktion ikke er enzymatisk afhænger den i langt højere grad af temperaturen end de enzymatiske reaktioner gør. α-acetolaktat vil således oxideres hurtigere til diacetyl ved høje temperaturer. Dette er grund til jeg forventer højere diacetyl koncentrationer ved 2 C. Figur 5 9, samt bilag 5, viser hvorledes halveringstiden for α-acetolaktat afhænger at temperaturen. Det ses tydeligt at resultaterne utvetydigt bekræfte sætningen Q = 2. Dannelsen af diacetyl vil ske så længe der er α-acetolaktat og et oxidationsmiddel. I urt uden gær vil 4% af α-acetolaktat således omdannes til diacetyl. Produktionen af α-acetolaktat vil kun blive ved så længe der er mangel på valin og glykolysen kører, og stopper derfor % når gæren har forgæret alle de forgærbare kulhydrater. Derefter begynder modningsfasen, hvor diacetyl reduceres. Nedbrydelsen af diacetyl: - 6 -
Nedbrydelsen af diacetyl sker af to trin. I det første trin reduceres diacetyl ved hjælp af de to NADH eller NADPH afhængige 2 isoenzymer 3 diacetyl reduktase og acetoin dehydrogenase til (R)-acetoin. Dette stereospecifikke molekyler kan så enten reduceres videre til (R,R)-butandiol eller ved hjælp af Acetoin isomerase omdannes til isomeren (S)-acetoin. (S)-acetoin vil derefter blive reduceret til (S,S)-butandiol ligeledes under oxidation af NADH eller NADPH. Begge isomerere af butandiol er smagsløse alkoholer. Resultatet vil således i en brygmesters øjne være at gærcellen omdanner et utroligt uønsket aroma aktivt stof til en alkohol der næsten ikke kan smages. Alle disse enzymatiske reaktioner foregår inde i gærcellerne. Derfor vil det være natuligt at forvente at en forskel i gærstamme vil give en forskel i diacetyl koncentrationen. Jeg vil derfor nu se på de to gærstammer. Gærtyperne: Alle gærstammer fra genuset Saccharomyces (S.) er fakultative anaerobe. S. cerevisiae er nu den bedst kendte eukaryote organisme. Med denne baggrund er det pinligt at følge de modsigende diskussioner omkring elementære værdier, startende med taksonomi 4 5. Det har gennemgående været svært at finde rundt de mange forskellige navne der bruges i flæng, men jeg har fundet frem til følgende, se figur 8, som de fleste kilder menes at kunne være enige i. Problemet er bare at der f.eks. er tre navne for den samme bryggær: [S. uvarum = [S. carlsbergensis] 6 = S. pastorianus.] 7 Saccharomyces Bagegær S. cerevisiae Bryggergær S. carlsbergensis I mine gæringer brugte jeg to slags gær: Bagegær og bryggær. Bagegæren, S. cerevisiae 8, var den man kan købe i alle supermarkeder, produceret af De Danske Spritfabrikker. Bryggæren var Albanis gær, S. pastorianus, som jeg fik nogle prøver af. Pga. af mangel på litteratur omkring - 7 -
S. pastorianus bruger jeg de ting jeg fandt omkring Carlsbergs gær S. carlsbergensis. Dette mener jeg med rette at kunne gøre, på baggrund af artiklen MUC. MUC beskrive en undersøgelse hvorved at man har fundet en utrolig lighed i mtdna et hos stammerne i arten S. uvarum (= S. carlsbergensis = S. pastorianus). Forskellene på bagegær og bryggær er bl.a. de ændringer i deres stofskriftehastigheder der er blevet fremelsker ved opformering i de medier og forhold de skal gære under. Denne forskel i stofskiftehastighed kan vise sig at komme til udtryk i mine resultater på baggrund af MBS. Niveauet af acetohydroxysyrer i øl er en funktion af gærstamme og er forstærket af forhold som fører til rivende gær vækst (forhøjet produktion af pyruvat) 9. Det andet er rent morfologisk. Bagegæren er en såkaldt overgær. Hvorimod bryggæren er en undergær. Forskellen er at overgæren foretager hovedgæringen i overfladen af substraten. Dette gør den fordi at den lukker det dannede CO 2 inden i vakuoler således at den svæver op til overfladen. I princippet det samme som en helium ballon. Denne egenskab har undergæren ikke. Den vil under hovedgæringen cirkulere rundt i substraten, men så snart de forgærbare kulhydrater er væk, flader undergæren til bunds. I et mikroskop vil overgæren se ud som på figur 9 2 og undergæren som på figur. Her ses en anden tydeligt forskel. Overgæren hænger sammen i lange kæder. Dette er ikke tilfældet for undergæren. Man kan endvidere se knopskydning i gang hos undergæren. Disse morfologiske forskelle skulle dog ikke have nogen betydning i mit forsøg. Efter at have gennemgået forskellene mellem de to gærstammer så vil jeg forvente følgende forskelle mellem de to gærstammer. For det første så vil bagegæren blive udsat for stress ved at komme ned i et nyt medium, hvilket vil føre til en langsommere forgæring. For det andet så vil bagegæren producere mere diacetyl end bryggæren da produktionen af diacetyl ikke er en uønsket egenskab hos bagegæren, og den er derfor ikke fremelsket til at producere mindst mulig diacetyl. - 8 -
Forsøg: Materialer: Forsøg i køleskab: Forsøgs opstilling Køleskab 2 x liters dunke m. tappehane 2 x drop udstyr 2 x liter urt 3 x 5g bagegær 5g af Albanis bryggær 3 ml konisk kolbe 48 x 2 liters fryseposer CO 2 trykflaske Forsøg i varmeskab: Forsøgs opstilling 2 Varmeskab DMI-24 multimeter m. termosonde Datakabel 2 x liters dunke m. tappehane 2 x drop udstyr 2 x liter urt 3 x 5g bagegær 5g af Albanis bryggær 36 x 5 ml glas CO 2 trykflaske - 9 -
Fremgangsmåde: Jeg ville gennem dette forsøg opnå indsigt i hvorledes temperatur og gærstamme var afgørende for koncentrationen af diacetyl i øl. Grunden til at jeg valgte disse to parametre var følgende: Jeg forventede at der ville være en forskel ved forskellige temperaturer. Dette skyldes følgende citat: Jo koldere gæringstemperaturen er jo mindre diacetyl ( ) bliver der produceret, dog vil det tage længere tid at få det der bliver dannet ned på acceptable niveauer. 2. Jeg valgte at bruge to forskellige gærstammer da jeg gerne ville arbejde med to parametre og ikke mente at det ville være praktisk muligt med det udstyr jeg havde til rådighed at lave forsøg med både temperatur og f.eks. ph. Det ville ganske enkelt blive en alt for stor opgave i forhold til at det må fylde 5 sider. Derfor valgte jeg gærstammer som det andet parameter, da det var simpelt at lave to tanke i stedet for ved de forskellige temperaturer. Inden jeg startede forsøget skulle finde ud i hvilke volumen jeg skulle lave gæringerne. Dertil er der tre forhold der skal tages i betragtning: Den forventet tid det ville tage for gæringen og den efterfølgende modning. Hver prøve skulle være på mindst 3 ml for at analysere den for diacetyl (gaschromotografisk), ethanol samt hvor meget af de forgærbare kulhydrater der rent faktisk var forgæret (RDF 22 ) Jeg ville have nogle fine grafer, hvilket kræver løbende/mange prøvetagninger. Jeg kan tilføje at inde ved Albani måler de to gange på diacetyl under en gæring. Jeg målte henholdsvis 24 (7 C) og 8 (2 C) gange. Ifølge LBM kunne jeg forvente at gæring samt modning ved 7 C ville tage ca. 22 dage, og ca. 6 dage ved 2 C. Med dette i mente satte jeg mig ned og overvejede hvor mange prøver jeg kunne tage. Man skal huske at efter gæringen vil en væsentlig del af volumen være gær. Derfor kunne jeg ikke regne med at der ville være urt til ( liter/ 3ml) 33 prøver. Så for at være på den sikre side besluttede jeg at tage prøver hver dag ved forsøget på 7 C samt to prøver i opstartsfasen. - -
Grunden til at jeg tog de to prøver i opstartsfasen var for at se på alkohol indholdet om hvor hurtigt gæringen gik i gang. Det kunne jo være at iltindholdet i urten var blevet højt efter at være blevet hældt dels ned i dunkene på Albani, og derfra over i gæringsdunken hjemme hos mig. Hvis dette var tilfældet ville gæren jo have respireret i starten i stedet for at gære. Dette er normalt tilfældet inde ved Albani, da gunstige forhold for gæren i starten vil tilsidesætte væksten af fremmede organismer. Jeg besluttede altså at lave 24 prøver på gæringerne ved 7 C. Ved forsøget på 2 C vidste jeg at det ville gå utroligt stærkt. Derfor skulle der en del målinger til for at jeg skulle få en fin graf ud af analyse resultaterne. Jeg besluttede efter drøftelse med John B. Larsen at tage prøver tre gange om dagen. Altså en prøve hver 8. time. Dette gjorde jeg på den baggrund at Albanis gaschromotograf kunne tage 38 prøver pr gang, og derfor ville det være praktisk at ligger under dette tal. Ellers ville det tage to dage for at analysere alle resultater hvilket ville irriterende både for mig, men også for Albani, da de måske skulle bruge gaschromotografen. Da jeg gjorde dette i 6 dage, blev det til 36 prøver. Efter at have besluttet hvor meget jeg skulle gære, kom problemet med at lave en alm. liters dunk om til en dunk man kunne gære i uden at den eksploderede. Jeg fandt efter mange overvejelser frem til at løsningen ikke var at sætte et almindeligt gærrør på dunkene. Dette skyldes to ting. For det første så ville det blive et problem ved forsøget på 2 C at sørge for at der hele tiden var vand nok i gærrøret da dette ville fordampe relativt hurtigt. For det andet så skulle jeg finde en måde hvorpå jeg kunne tage prøver fra dunken uden at der heraf dannede undertryk inde i beholderen ville suge atmosfærisk luft ind i dunken. Denne problemstilling svare til de problemer der altid er med at få ketchup ud af flasken. Grunden til at det går så langsomt er at ketchup er så tyktflydende og der derfor ikke kan komme ilt ind i flaske så trykket bliver udlignet. Dette problem ville man ikke have hvis man borede et hul i bunden på flasken. Dette ville dog være mindre praktisk. Jeg skulle altså finde en måde at få en gas ind i dunken. Da gæren jo selv producere CO 2 var det nærliggende at bruge denne gas. Jeg tænkte på at når nu gæren laver al den gas (og dermed overtryk) kunne jeg så ikke lave en slags buffersystem, hvorved den dannede gas blev gemt til jeg skulle tage prøverne og derved udligne trykket. Først tænkte jeg på simpelt hen at sætte en stort plastik pose til dunke, men dette ville blive utroligt upraktisk, idet at varme og køleskabet kun lige kunne have de to dunke, og slet ikke to store - -
plastik poser. Jeg kom da til at tænke på at når man ligger på sygehuset og er blevet opereret (er opereret et par gange) så får man en såkaldt sommerfugl på overfladen af hånden som er tilsluttet et drop som enten indeholder fysiologisk saltvand (9g NaCl/L H 2 O) eller sukkeropløsninger. Disse drop sæt ville være perfekte til det jeg skulle bruge dem til. Derfor var jeg ude på Svendborg Sygehus og høre om jeg kunne få sådan to drop sæt. Det kunne jeg heldigvis godt. Det sidste problem var nu hvordan jeg skulle tilslutte drop sættene til dunkene. Det gjorde jeg ved at sætte den kapsel der normalt lukker den ende af droppet som passer til sommerfuglen ind i dunken ved hjælp af silikone. Forinden havde jeg skåret et lille hul i kapselen, således at jeg nu havde skabt et lukket system, som ikke kunne eksplodere. Jeg kunne opsamle CO 2 en i tomme dropposer og lukke dem og gemme dem til produktionen af CO 2 faldt således at der ville dannes undertryk i dunkene når jeg tappede fra dem. Desuden så skulle dropsættet jo ikke sættes i dunkene hvor som helst. Det skulle være et sted hvor urten aldrig ville komme op til, for hvis der først kom væske i dropslangen, ville gassen have sværere ved at komme i gennem. Derfor satte jeg dropsættene fast i den hårdeste del af dunken, oppe ved håndtaget, som det kan ses på opstilling og 2. Da jeg satte mig ned og regnede lidt på hvor meget CO 2 der ville blive produceret, fandt jeg frem til at det ikke var nok til at der ikke ville blive undertryk i beholderen. Derfor var jeg nød til at tilføre systemet CO 2. Dette gjorde jeg ved at låne en CO 2 beholder af Albani, og tilslutte den dropsættet, i stedet for dropposerne når jeg tog mine prøver. Derved havde jeg et lukket som system som under ingen omstændigheder kunne blive tilført ilt. Jeg kunne nu starte mine gæringer. Først satte jeg forsøget ved 7 C over, da det ville tage længst tid, og derfor skulle jeg have god tid hvis det skulle gentages. Jeg opløste bagegæren i lunkent vand med lidt sukker i. Dette gjorde jeg for at bagegæren havde samme betingelser som bryggæren der allerede var i flydende medium. Normalt gælder der en tommelfingerregel at forholdet mellem gær og urt skal være :. Men idet jeg ikke kunne ilte gæren som de gør det inde ved Albani tilsatte jeg 5% som kickstarter på gæringen. Overstående proces hvorved gæren blev påsat er analogt med forløbet af samme proces i forsøget ved 2 C. Ved forsøget på 7 C brugte jeg en konisk kolbe til at tappe 3 ml prøver med, og derefter hælde det ned i en frysepose og ned i fryseren. Ved forsøget på 2 C brugte jeg nogle specielle - 2 -
glas som jeg lånte af Albani. Disse glas kunne tåle at blive frosset ned. Så her blev prøverne kun hældt over en gang, fra dunk til glas. Grunden til at jeg ikke brugte glas første gang var at jeg ikke vidste hvordan analyserne blev udført inde på Albani. Derfor brugte jeg en del tid, og en masse kræfter på at slå på frosne urt i fryseposerne i stykker og komme den ned i de glas som jeg brugte ved det andet forsøg. Derefter blev prøverne tøet op i et vandbad. På figur ses sådanne optøede prøver. Det er svært at se men prøve 2,4 og 6 fra højre er mørkere end,3 og 5. Dette skyldes af den lyse overgær svæver frit i prøve,3 og 5 hvorimod undergæren ligger på bunden i prøve 2,4 og 6. Bearbejdning af prøver: Efter at prøverne var tøet op, skulle de analyseres. Diacetyl (og 2,3-pentandion) blev målt på gaschromotograf. For metode, se bilag 23. Et eksempel på en gaschromotograf analyse ses på bilag 2. Grunden til at alle resultater ikke er vedlagt, men kun indsat i tabeller er at en måling fylder A4 side 24. RDF og alkohol indhold blev målt på en SCABA 25. Vejledning til denne form for analyse kan ses på bilag 3. Et eksempel på sådan resultat kan ses på bagsiden af bilag 2. Ved mit forsøg var der nogle af prøverne der indeholdt koncentrationer af diacetyl som gaschromotografen ikke var kalibreret til at måle. Resultatet var at den kunne give mig arealet under diacetyl toppen men ikke koncentrationen. Derfor var jeg nød til at ekstrapolere. Dette vil som navnet antyder sige at finde noget mellem to poler, resultater. Dette gjorde jeg efter følgende formel: A A 2 HEX DIA 2 * * C 2 DIA CDIA A HEX A = DIA ( Afvigelse) ( Forhold ) I den første parentes tages der hensyn til evt. afvigelser mellem målinger idet den interne standard 26 (Hexandion) altid vil være det samme, da der blev tilsat 5µL til hver prøve. I den anden parentes regner man forholdet ud mellem de to arealer. Ved at gange afvigelsen med forholdet mellem de to prøver med resultatet af den. prøves koncentration fås koncentrationen i den anden prøve. - 3 -
På forsøget i varmeskab lavede jeg en dataopsamling for at se varmeudviklingen under gæringen. Dette ville give et fingerpeg om hvornår gæringen var på sit øverste. Alle disse resultater indsatte jeg i nedenstående tabeller og udarbejdede derefter grafer for diacetyl, alkohol samt RDF. Grafen for varmeudviklingen er lavet i datalyse under selve målingen. Resultater: Gaschromotograf og SCABA: Resultater fra gaschromotograf og SCABA er indsat i nedenstående tabeller hvor beholdernes indhold er som følgende:. liter urt tilsat Albanis gær. Afgæring og modning sker ved 7 C 2. liter urt tilsat almindeligt bagegær. Afgæring og modning sker ved 7 C 3. liter urt tilsat Albanis gær. Afgæring og modning sker ved 2 C 4. liter urt tilsat almindeligt bagegær gær. Afgæring og modning sker ved 2 C Beholder : nr. Tid efter start hvor prøven er taget. Diacetyl indhold Alkohol indhold vægt % RDF Dato - tid Start,3863,3 4,3 6/2 9: 3 ½ dag,2728,66 9, 7/2 7: 5 dag,734, 3,7 7/2 9: 7 2½ dag,4949,99 27,2 8/2 7: 9 3 dage,6586 3,9 4, 8/2 9: 4 dage,8275 3,96 5,8 9/2 9: 3 5 dage,7956 4,74 6,6 2/2 9: 5 6 dage,769 5,7 66,8 2/2 9: 7 dage - pga. sygdom 7 8 dage,6384 5,23 68,4 23/2 9: 9 9 dage,589 5,32 68,5 24/2 9: 2 dage,5499 5,8 69,3 25/2 9: 23 dage,5368 5,34 69,3 26/2 9: - 4 -
25 2 dage,573 5,39 69,5 27/2 9: 27 3 dage,4876 5,33 7, 28/2 9: 29 4 dage,4589 5,33 7, 29/2 9: 3 5 dage,45 5,43 7, 3/2 9: 33 6 dage,4246 5,4 7,4 3/2 9: 35 7 dage,3892 5,53 7,2 / 9: 37 8 dage,3756 5,44 7,4 2/ 9: 39 9 dage,379 5,46 7,4 3/ 9: 4 2 dage,282 5,48 7,7 4/ 9: 43 2 dage,394 5,58 7,7 5/ 9: 45 22 dage,2886 5,57 7,6 6/ 9: 6 Alkohol i vægt % 5 4 3 2 Alkohol Diacetyl i mg/l,8,6,4,2 Diacetyl 8 RDF i % 6 4 2 RDF Beholder 2: nr. Tid efter start hvor prøven er taget. Diacetyl indhold Alkohol Indhold vægt % RDF Dato - tid 2 Start,3822,44 6,5 6/2 9: 4 ½ dag,539,55 7,6 7/2 7: 6 dag,33,78,9 7/2 9: 8 2½ dag,597,32 8,5 8/2 7: 3 dage,52,94 26,5 8/2 9: - 5 -
2 4 dage,7876 27 2,45 33,4 9/2 9: 4 5 dage,86 3,6 42,5 2/2 9: 6 6 dage,8662 3,85 5,5 2/2 9: 7 dage - pga. sygdom 8 8 dage,87 4,37 57,8 23/2 9: 2 9 dage,943 4,47 6, 24/2 9: 22 dage,34 4,6 62,2 25/2 9: 24 dage,784 4,72 62,6 26/2 9: 26 2 dage,6262 4,62 62,9 27/2 9: 28 3 dage,659 4,76 63, 28/2 9: 3 4 dage,4844 4,78 63,4 29/2 9: 32 5 dage,4278 4,77 63,5 3/2 9: 34 6 dage,335 4,78 63,7 3/2 9: 36 7 dage,339 4,89 63,9 / 9: 38 8 dage,2977 4,76 64, 2/ 9: 4 9 dage,2747 4,84 64, 3/ 9: 42 2 dage,2629 4,83 64, 4/ 9: 44 2 dage,2467 4,88 64, 5/ 9: 46 22 dage 4,9 64,3 6/ 9: 6,2 Alkohol i vægt % 5 4 3 2 Alkohol Diacetyl i mg/l,8,6,4,2 Diacetyl RDF i % 7 6 5 4 3 2 RDF - 6 -
Beholder 3: nr. Tid efter start hvor prøven er taget. Diacetyl indhold Alkohol Indhold vægt % RDF Dato - tid Start,258,36 5,4 23/ 24: 3 8 timer,9597 2,45 36, 24/ 8: 5 6 timer,696 4,73 68,6 24/ 6: 7 dag,24 4,86 69,6 24/ 24: 9 dag, 8 timer,729 4,9 69,7 25/ 8: dag, 6 timer,237 4,94 7,2 25/ 6: 3 2 dage Pga. sygdom 5 2 dag, 8 timer,939 4,98 7,5 26/ 8: 7 2 dag, 6 timer,4 5,2 7,6 26/ 6: 9 3 dage,693 5,5 7,7 26/ 24: 2 3 dag, 8 timer,538 5,7 7,8 27/ 8: 23 3 dag, 6 timer,777 5,7 7,6 27/ 6: 25 4 dage,53 5, 7,7 27/ 24: 27 4 dag, 8 timer,896 5,4 7,7 28/ 8: 29 4 dag, 6 timer,28 5,6 7,7 28/ 6: 3 5 dage, 5,6 7,7 28/ 24: 33 5 dag, 8 timer,4 5,5 7,6 29/ 8: 35 5 dag, 6 timer,6 5,6 7,6 29/ 6: 37 6 dage,85 5,6 7,4 29/ 24: 6,2 Alkohol i vægt % 5 4 3 2 Alkohol Diacetyl i mg/l,8,6,4,2 Diacetyl - 7 -
8 RDF i % 6 4 2 RDF Beholder 4: nr. Tid efter start hvor prøven er taget. Diacetyl indhold Alkohol Indhold vægt % RDF Dato - tid 2 Start,453,7 6, 23/ 24: 4 8 timer,5252 2,5 3, 24/ 8: 6 6 timer,66 4,52 65,8 24/ 6: 8 dag,96 4,86 7, 24/ 24: dag, 8 timer,727 4,88 7, 25/ 8: 2 dag, 6 timer,73 4,92 7,3 25/ 6: 4 2 dage Pga. sygdom 6 2 dag, 8 timer,5 4,94 7,6 26/ 8: 8 2 dag, 6 timer,894 5, 7,7 26/ 6: 2 3 dage,7 5,6 7,8 26/ 24: 22 3 dag, 8 timer,583 5,7 7,8 27/ 8: 24 3 dag, 6 timer,825 5,7 7,6 27/ 6: 26 4 dage,25 5, 7,8 27/ 24: 28 4 dag, 8 timer,24 4,99 7,6 28/ 8: 3 4 dag, 6 timer,245 5, 7,9 28/ 6: 32 5 dage,54 5, 7,9 28/ 24: 34 5 dag, 8 timer,98 5, 7,9 29/ 8: 36 5 dag, 6 timer,2432 5, 7,9 29/ 6: 38 6 dage,527 5, 7, 29/ 24: - 8 -
6 2 Alkohol i vægt % 5 4 3 2 Alkohol Diacetyl i mg/l,5,5 Diacetyl 8 RDF i % 6 4 2 RDF Temperatur: Diskussion: - 9 -
Jeg vil i min analyse af mine resultater først bearbejde hvert bryg og derefter vurdere bryggene i forhold til hinanden her. Jeg vil uundgåeligt komme ind på det det samme i min konklusion. Endvidere vil jeg bedømme diacetyls rolle i gærcellens stofskifte. Til sidst vil jeg vurdere en om end mulig fremtidig effektivisering af ølbrygningsprocessen. Resultater: Beholder. I denne beholder var der tilsat bryggær ved 7 C. Der ses et utroligt tæt forhold mellem forgæringsgraden (RDF) og alkohol procenten under hovedgæringen. Det ses at der fra start af går en smule trægt med gæringen. Dette skyldes at gæren er blevet opformeret aerobt på Albani og skal derfor omstille sig til de anaerobe forhold. Derved tænker jeg blandt andet på at gæren skal producere flere glykolytiske enzymer samt overkomme det stress denne omstilling må aflede. Efter de første 3 prøver (dag) accelerere gæringen til hvad må være højest praktisk mulige. Efter RDF i % RDF i % 8 7 6 5 4 3 2 8 7 6 5 4 3 2 6 5 4 3 2,8,6,4,2 Alkohol i vægt % Diacetyl i mg/l RDF Alkohol RDF Diacetyl prøve 7 (5 dage) aftager gæringshastigheden igen, da gæren er ved at have udnyttet alle de tilgængelige kulhydrater. Når man sammenligner graferne for diacetyl og RDF ses det at diacetyl koncentrationen er stigende op til to dage før RDF stabilisere sig. Resultaterne fra gaschromotografen er svingende i denne fase, men viser dog alligevel den samme tendens. Det kan skyldes fejlkilder i forbindelse med håndtering af prøver, f.eks. under prøvetagningen hvor nogle af prøverne kunne være blevet oxideret mere end andre. Herved tænker jeg specielt på prøve og 3. Ellers ligger resultaterne næsten perfekt. Det ses at koncentrationen af diacetyl er konstant aftagende, men intensiteten hvor ved reduceringen sker er faldende. Denne del af grafen - 2 -
passer perfekt til bilag 4 28. Dette skyldes at den gradient som den faciliterede transport foregår pga. er faldende, således at jo mindre diacetyl der er i den ekstracellulære substrat jo mindre er gradienten og derved hastigheden hvorved diacetyl bliver ført ind i cellen. Det ses at i den tid hvor RDF ligger nogenlunde stabilt er den dog stadig stigende. Dette skyldes nok følgende. Idet diacetylen bliver reduceret inde i cytoplasmaen, vil der blive dannet NAD + som så vil kunne bruges som coenzym i glykolysen. Dette vil dog ske meget langsomt og i meget små kvantiteter pga. de relativt små koncentrationer som diacetyl er til stede ved. Beholder 2: I denne beholder var der tilsat bagegær ved 7 C. Det ses her at alkohol og RDF graferne er en anelse forskudt fra hinanden i forhold til i beholder. Dette kan skyldes at bagegæren omdanner mere af sukkeret til CO 2, eller andre ikke alkoholiske stoffer, end bryggæren. Dette virker sandsynligt idet det jo er bagegærens primære rolle i dej at producere CO 2 således at dejen hæver. Det før omtalte opstartsfase gør jeg også gældende her. Ser vi på graferne for diacetyl og RDF ses en noget slingrende kurve for diacetyl under hovedgæringen. Tendensen er dog en stigende linie så grunden til at 7 6 5 4 3 2 7 6 5 4 3 2 resultaterne ikke passer perfekt må være diverse fejlkilder, se konklusion. Eller ser vi en fin kurve for nedbrydelsen af diacetyl. Det ses i sammenhæng med reduceringen af diacetyl at RDF er svagt stigende. RDF i % RDF i % 6 5 4 3 2 Alkohol i vægt %,2,8,6,4,2 Diacetyl i mg/l RDF Alkohol RDF Diacetyl Beholder 3: - 2 -
I denne beholder var der tilsat bryggær ved 2 C. Her ses igen en utrolig flot sammenhæng mellem RDF og alkohol graferne. Der er tilsyneladende ingen opstartsfase under denne gæring, eller også er der for langt mellem målingerne til RDF i % 8 7 6 5 4 3 2 6 5 4 3 2 Alkohol i vægt % RDF Alkohol jeg har kunne målt. Det ses at hovedgæringen er færdig efter bare 6 timer (prøve 3). Dog kan det ses ved sammenligning med temperaturgrafen at dette ikke helt er tilfældet. På temperatur grafen ses det at der går yderligere 2 timer ( time mellem målinger) inden at temperaturen begynder at falde. Det ses RDF i % 8 7 6 5 4 3 2,2,8,6,4,2 Diacetyl i mg/l RDF Diacetyl endvidere at der går 6 målinger inden at temperaturen er nede på de 2 C som varmeskabet var kalibreret til. Dette er samtidigt som diacetyl grafen er faldet til et nogenlunde stabilt niveau. Dette vil jeg se nærmere på i min konklusion. Derefter følger en periode på mellem 24 og 32 timer hvor de sidste forgærbare kulhydrater bliver forgæret. Dette sker samtidigt med at diacetyl niveauet falder til et konstant niveau på ca., mg/l. Udviklingen i diacetyl grafen efter prøve nr. 8 må skyldes at der er nogle gærceller som stadig har haft et diacetyl indhold i sig som er autolyserede. Da gæren enten er død eller ligger på bunden (jf. undergær) vil den ikke være i stand til at fjerne den tilbageværende diacetyl. Enten fordi gæren er død eller fordi den ikke kan nå diacetylen fra bunden. Dette viser med andre ord at man skal fjerne gæren fra urten efter hovedgæringen. Beholder 4: I denne beholder var der tilsat bagegær ved 2 C. Her ser vi igen den opstartsperode der var fraværende i beholder 3. Ellers er grafen for RDF og alkohol som vi kunne RDF i % 8 7 6 5 4 3 2 6 5 4 3 2 Alkohol i vægt % RDF Alkohol - 22 -
have forventet. Det interessante ser vi i grafen for diacetyl. Her ser vi at den. del af grafen er som vi kunne have forventet på baggrund af 3 forrige beholdere. Det er den sidste halvdel der er interessant. Her stiger koncentrationen af diacetyl så kraftigt at det ikke kan skyldes evt. fejlkilder. Dette burde være umuligt, jf. RDF i % 8 7 6 5 4 3 2 2,5,5 Diacetyl i mg/l RDF Diacetyl teoriafsnit, idet gærcellerne her ikke har nogen kulhydrater der kan spaltes til pyruvat og derfra omdannes til diacetyl. Derfor kan der kun være en grund til denne stigning. En bakteriel infektion. I GO fandt jeg et forløb ved en bakteriel som svarede så godt som % til hvad der var sket i beholder 4. Denne bakterie er årsagen til den indledningsvis nævnte sarcinasyge, eller ølsarcina Pediococcus damnosus eller ølpediokokker. Den optimale temperatur for vækst er 8-25 C ( ). Selv ved optimal temperatur er væsken (.) ret langsom; i urt varer det i reglen 3-6 dage, inden der kommer vækst ( ) 29. Ølsarcina ( ) foretrækker substrater hvori der er gærautolysat, ( ); Gærens udskilningsprodukter og autolyserede gærceller indeholder netop de kvælstofforbindelser, der tilfredsstiller dens behov. 3. Disse betingelser passer perfekt til min graf for diacetyl. Temperaturen er 2 C og der er masser af autolyserede celler i substraten, pga. mangel på føde. Eksempel på ølpediokokker omkring autolyserede gærceller er figur 2 3. Desuden ses det på grafen at den første tildens til at diacetyl koncentrationen stiger er ved prøve (efter 4 dage). Alle disse indicier peger på at denne sidste bryg blev inficeret med ølpediokokker og det var derfor diacetyl koncentrationen igen begyndte at stige selv om den ellers var faldet fint. Diacetyl i mg/l,2,8,6,4,2-23 - Diacetyl koncentrationer ved 7 C Beholder Beholder 2
Sammenfatning: Det må siges at resultaterne er overraskende gode i forhold til at forsøgene blev lavet i min kælder. Som det ses kom den forbedring jeg lavede fra forsøget ved 7 C til 2 C med at gå fra plastikposer til glas, ikke til at have nogen indvirkning på mine resultater. Denne fejlkilde er relativ i forhold til forskellen på de Diacetyl i mg/l Diacetyl koncentrationer ved 2 C 2,5 Beholder 3 Beholder 4,5 to gærtypers betydning på diacetyl koncentrationen, idet jeg gjorde det samme med begge dunke. Det bliver først et problem ved sammenligning med forsøget ved 2 C. Det er svært at sige % om der rent faktisk blev oxideret noget α-acetolaktat til diacetyl, men faktum er at beholder og 2 stadig når en mindre D max værdi end i beholder 3 og 4. Altså er den eventuelle oxidering ikke stor nok til at ødelægge resultaterne, da de viser hvad der kunne forventes. Mine resultater viser faktisk alle de forventninger jeg havde til dem, lige med undtagelse af beholder 4 der blev inficeret med ølpediokokker. Som det ses på graferne for diacetyl koncentrationen i de to forsøg, er tendensen at bagegærs D max ligger ca.,5 mg/l over D max i forsøget ved 7 C, end ved 2 C. For bryggær er denne værdi ca.,2 mg/l. Dette skyldes at α- acetolaktat hurtigere oxideres til diacetyl, jo varmere det er, jf. Q = 2. Det er dog bekræftende at temperatur stigningen påvirker D max mindre hos bryggæren. Dette beviser at det både er diacetyl og α-acetolaktat koncentrationen der er mindre. Ellers ville diacetyl niveauet have været det samme da omdannelsen af α-acetolaktat ikke er påvirket af enzymer. At bagegæren tydeligt producere mere diacetyl end bryggæren gør, skyldes højst sandsynligt at bagegæren bliver stresset. Dette ses (udfra RDF grafen) ved at den omtalte opstartsperiode er længere end ved bryggæren ved samme temperatur. Bryggærens opstartsperiode går efter -2 målinger over i hovedgæringen ved forsøget på 7 C. Den samme fase, i forsøget på 7 C, tager 2-3 målinger for bagegæren. En anden hypotese kunne være at α-acetolaktat syntease har en højere affinitet over for valin hos bryggæren. Ved forsøget på 2 C er der slet ingen opstartsperiode ved bryggæren, hvorimod der er en denne fase, om end svagere end ved 7 C, ses hos bagegæren. Teorien med at bagegærens - 24 -
forhøjede stofskifte skulle kunne føre til forhøjede diacetyl koncentrationer må bortvises ved sammenligning af RDF graferne for bager og bryggær. Det ses at bagegæren er langsommere til at forgære de forgærbare kulhydrater end bryggæren er. Bagegæren har altså et lavere stofskifte i forhold til bryggæren. Dette kan skyldes at stresset har forårsaget en lavere koncentration af glykolytiske enzymer. Diacetyls rolle i gærcellernes stofskifte: Diacetyl har to roller i gærcellernes stofskifte: Diacetyl virker som en buffer i gærcellernes redoxbalance Diacetyl kan være den indirekte kulstofkilde for gærcellerne. Diacetyl kan gå ind og virke som en buffer i gærcellernes redoxbalance pga. følgende. Som konsekvens af at der under hovedgæringen sker en forskydning af redoxbalancen vil gæren forsøge at skabe ligevægt igen. Dette sker ved at gæren kigger sig omkring efter muligheder for at få reduceret nogle af de oxiderede forbindelser, og derved omdanne NAD(P)H til NAD(P) + således at glykolysen kan køre videre. På figur 7 32 ses eksempler på reaktioner hvorved gærcellen kan oxidere NADH: Idet langt størstedelen af diacetylen, ved slutningen af hovedgæringen, befinder sig i substraten og ikke cytoplasmaen, kommer diacetyl til at virke som et buffersystem. Når der er mangel på pyruvat som kan reduceres til ethanol, begynder gæren at reducere diacetyl. Derved muliggør diacetyl at glykolysen, og derved gærcellens levegrundlag, kan køre videre under anaerobe forhold. Det skal dog siges at dette sidste kun kan retfærdiggøres rent kvalitativt. Hvis man ser på det kvantitativt så vil diacetyl kun i mindre grad bidrage til oxidationen af NADH og NADPH. Den største kilde til dette vil næst efter acetaldehyd være fumarat (glycerol). 3% 33 af de forgærbare kulhydrater vil således ende deres dage som glycerol i stedet for ethanol eller CO 2-25 -
Gærcellen kan endvidere udnytte diacetyl (samt butandiol og acetoin) som kulstofkilde. Gær kunne vokse på 2,3-butandiol eller acetoin som den eneste kulstofkilde ( ). Dog var inaktivering af YAL6W (red. Genet for 2,3-butandiol dehydrogenase) ikke dræbende for gæren ( ). Dette hentyder til at andre enzymer udover 2,3-butandiol dehydrogenase kan metabolisere 2,3-butandiol i gær 34. Dette viser at cellen rent faktisk får energi ud af at oxiderer 2,3-butandiol. Dette overrasket jo egentligt ikke, idet dannelsen af 2,3-buntandiol sker ved overførelse af energirige elektroner fra NADH, jf. dannelse af det energi rige stof ethanol. Så ikke nok med at diacetyl kan få glykolysen til at køre i længere tid, men de reducerede forbindelser der er afledt af diacetyl kan bruges som direkte energi kilde for gærcellen. Det konkluders at diacetyl har en mindre rolle i gærcellens stofskifte som et redoxbuffer stof. Dog kan diacetyl (og de heraf reducerede forbindelser) få stor betydning for gæren som kulstofkilde. Vurder fremtidig effektivisering af ølbrygning: På baggrund af ovenstående er der efter min mening tre ting der kan gøres for at effektivisere ølindustrien. Den første mulighed er direkte afledt af mine resultater. Jeg vil på baggrund af disse foreslå at man i stedet for at gennemføre hele gæringen ved en konstant temperatur (i dag mellem -4 C) som man gør i dag,, så begynder man på at gære ved en to forskellige temperaturer. Under hovedgæringen skal temperaturen holdes nede da mine resultater jo viste hvorledes det minimerede produktionen af diacetyl. Straks efter hovedgæringen er overstået skal temperaturen hæves 4-6 C således at nedbrydelsen af diacetyl fremskønnes. Denne temperatur stigning skal dog ske forholdsvis langsomt idet gæren ikke skal stresses. Det sidste trin er så og sænke temperaturen til lige over C således at gæren bundfælles og kan bruges i næste bryg. Se figur 3. Denne metode ville være realistisk idet, lager tankene allerede i dag er udstyret med temperatur regulerende systemer således at Figur 3 temperaturen kan holdes konstant. Problemet er dog bare at idet øl indeholder mellem 25 og 3 aromastoffer kan det ikke undgås at disse temperatur svingninger vil påvirke øllets smag. Derfor kan denne metode ikke implementeres i - 26 -
en nuværende produktion, men kan bruges ved opstart af i ny. Således ville denne metode kunne blive en del af en eventuel ny øls identitet. En anden løsning på problemet med diacetyl er brugen af exogene enzymer. Således har Novozymes produceret α-acetolaktat decarboxylasen Maturex 35. Dette enzym er et GMO enzym. Maturex decarboxylerer α-acetolaktat indtil (R)- acetoin. Således fjernes roden til problemet med diacetyl i øl. Problemet med brug af enzymer er bare at forbrugerne i Danmark forbinder enzymer med vaskepulver. Denne forbindelse samt danskernes store mistro til alt hvad der indeholder tilsætningsstoffer må virke bremsende på brugen af Maturex i Danmark. Endvidere har de danske bryggerier ifølge CA udbygget deres kapaciteter til at kunne følge med i sommerperioden hvor salget af øl er størst. Dette blev gjort for 5--5 år siden. Siden da er forbruget af øl faldet, til fordel for vin. Dette fører så til at der ikke er brug for nogen effektivisering da bryggeriernes nuværende lagerkapacitet er stor nok. Altså er det faldende ølforbrug også skyld i at Maturex ikke bruges i Danmark. En sidste men meget interessant mulighed kunne være følgende. Idet transporten af α-acetolaktat fra cytoplasmaen og ud i urten sker ved hjælp af et bestemt membranprotein, kunne det være interessant hvis man kunne slukke for dette protein. På denne måde ville der aldrig komme noget diacetyl ude i urten. Denne sidste mulighed er dog nok den mest kompliceret idet, gæren således enten skulle genetisk modificeres eller man skulle stoppe syntesen af membranproteiner ved hjælp af f.eks. antisence metoden. Konklusion: Jeg fandt gennem mine forsøg, ved hjælp af mine teoretiske viden, følgende: Det kan konkluderes at diacetyl koncentrationen i høj grad er afhængig af både gærstamme og temperatur. D max når således et højere niveau i beholderne med bagegær i forhold til beholderne med bryggær. Som konsekvens af det må det konstateres at bagegæren enten pga. stress eller enzymaktivitet producere mere diacetyl. Det blev afkræftet af det forhøjede D max skyldes bagegærens stofskifte, selv om jeg syntes det var en logisk mulighed. Dette faktum er tydeligst ved 2 C hvor den øgede temperatur øger omdannelsen af α-acetolaktat til diacetyl. Det ses endvidere at koncentrationen af diacetyl er ekstremt meget langsommere om at falde til et acceptabelt niveau i forsøget ved 7 C end i forsøget ved 2 C. Denne viden har jeg brugt til at opstille nogle metoder hvorved man ville kunne kontrollere diacetyl koncentrationen i øl, eller helt fjerne den. Spørgsmålet er bare om det på et tidspunkt - 27 -
bliver accepteret af forbrugerne at bruge enzymer i øl. Dette er nok tvivlsomt dels pga. at vi i Danmark, er kendt/berygtede for vores konservative holdninger. Dels fordi at lige præcist ølindustrien er utrolig konservativ, det er i alt fald min oplevelse efter at have været på Albani, jf. bl.a. grunden til at diacetyl fjernes. Dette skal ikke opfattes negativt, og det er da også noget de selv er bevidste om på Albani Bryggerierne. Alt i alt syntes jeg at det har været en utrolig vellykket opgave. Jeg har opstillet nogle forsøg og bevist min teori udfra disse. Endvidere har jeg haft en masse sjov med selv at gå og pusle med overvejelser omkring forsøgsopstilling inden jeg udførte forsøgene. Jeg syntes derfor på baggrund af ovenstående at kunne postulere at have opfyldt mit formål, og kan derfor med fornøjelse indlevere denne opgave. --------------------------------------- Thomas Rasmussen 4/2-3 - 28 -
Litteraturliste: P rimærlitteratur: Berger, Ralf G.: Broderick, Harold M.: European Brewery Convention: Fix, George J.: Aroma Biotechnology, Springer, 995 (AB) The Practical Brewer, Master Brewers Association of the Americas, 977. (TPB) Fermentation & Maturation, European Brewery Convention, 2 (FM) Diacetyl: Formation, Reduction, and Control, BrewingTechniques.com, 993 (DFRC) Gonzalez, E.: Characterization and functional role of Fernandez, M.R. Larroy, C. Saccharomyces cerevisiae 2,3-butanediol dehydrogenase. Pares, X. Chem. Biol. Interact. 2 Jan 3;3-32(-3):425-34 Biosca, J.A. Fundet på www.ncbi.nlm.nih.gov (CFS) Haukeli, A. D.: Lie, S. Diacetyl og α-acetolaktat i øl, Brygmesteren, Årgang 35, nr. Dansk Brygmester Forening, 978 (DOA) Hough, J.S: Malting and Brewing Science, vol. 2, Briggs, D. E. Chapman & Hall, 982. Stevens, R. (MBS) Y oung, T. W. Jørgensen, Alfred: Gæringsorganismerne, Ejnar Munksgaards forlag, 945. (GO) Murphy, Ceri A.: Strain-dependent variation in the NADH-dependent diacetyl reductase activities of lager- and ale- brewing yeasts, Biotechnology and applied biochemistry, vol. 23, International Union of Biochemistry, 996 (SND) - 29 -
Nguyen, H. V.: Lepingle, A. Gaillardin, C.A. Molecular typing demonstrates homogeneity of Saccharomyces uvarum strains and reveals the existence of hybrids between S. uvarum and S. cerevisiae, including the S. bayanus type strain CBS 38. Syst. Appl. Microbiology 2 Apr;23():7-85 Fundet på www.ncbi.nlm.nih.gov (MUC) Tuite, Michael F.: Saccharomyces, Oliver, Stepen G Plenum Press, 99 (S) Jeg har endvidere brugt kapitlerne Diketones in fermentation (DKB/DIF) samt Anaerobic carbohydrate metab olism ( DKB/ACM ) taget fra modul 3: Fermentation i Den Skandinaviske Bryggerhøjskoles undervisningsmateriale. Jeg har også brugt artiklerne Bagegær (B) samt En beskrivelse af spritgæringen i Grenaa (EBS) som jeg har fået tilsendt fra De Danske Spritfabrikker i Grenaa. Endvidere har jeg brugt kapitel 8 Maturation (BWE) i Novozymes bog Brewing with enzymes. Af internet sider har jeg brugt følgende: www.genome.ad.jp Total oversigt over alle stofskiftereaktioner i diverse organismer, der iblandt S. cerevisiae. w ww.purebeer.com Alt fra quizzer til ordbøger omkring øl. www.ncbi.nlm.nih.gov Kæmpe database med videnskabelige artikler inden for molekylær biologi. w ww.brewingtechniques.com Side omkring alle aspekter af ølbrygning. Lavet for ølentusiaster og hjemmebryggere. - 3 -
Sekundær Litteratur: Aschehoug Clausens Engelsk-dansk tekniske ordbog, Sangill Grafisk Produktion, 2 M undtlige Kilder: Andersen, Carsten: Den Skandinaviske Bryggerhøjskole, Gamle Carlsberg Vej 6 25 Valby Tlf.: 33 27 24 4 (CA) Mathiesen, Lars Bo: Albani Bryggerierne A/S Tværgade 2 5 Odense C Tlf.: 65 48 77 2 (LBM) N oter og bilag: DFRC p., linie 4. 2 Diacetyl = 2,3-butandion. Se figur. 3 Se figur 2. 4 Latin: Vicinalis: naboliggende. Vicinale diketoner: herefter VDK. 5 Figur 3 og Figur 6 har jeg tegnet i Chemsketch da jeg ikke fandt nogle at figurerne i litteraturen fyldestgørende. Figuren er tegnet på baggrund af DOA p. 25, figur 2, DKB/DIF p. samt http://www.genome.ad.jp/dbgetbin/show_pathway?map65+r2947 6 B vitamin Thiamin, der er fosforyleret to gange ved hjælp af ATP og ADP. Thiamin pyrofosfat herefter (TPP). 7 Figur 4 er taget fra DKB/DIF p.. 8 DOA p. 25, linie 2. 9 Figur 5 er oversat fra følgende link på www.purebeer.com: http://www.purebeer.com/school/diacvic/img2.gif Bilag 5: FM p. 93. MBS p. 595, 2. afsnit linie 2. 2 SND overskrift. 3 Enzymer som katalysere den samme reaktion, men som har forskellig genetisk opbygning. Jf. individer som fænotypisk er ens med genotypisk er forskellig. 4 Klassifikationssystem. 5 AB p., afsnit 2., linie 2. 6 S p. 28, linie 6. 7 AB p., afsnit 2., linie 5. 8 B p. 3, 2. afsnit, linie. - 3 -
9 MBC p. 595, 2. afsnit, linie 4. 2 Figur 9 og taget fra GO, tavle XXVI figur 79 og figur 8. Begge er billeder af gær efter 24 timer i urt. 2 TPB p. 246, linie 27. 22 Real Degree of Fermentation. Når denne stabilisere sig = % af forgærbare kulhydrater forgæret. Grunden til at RDF værdien ikke blever % er at der er kulhydrater i urten som gæren ikke kan forgære. 23 Bilag og 2: Bryggerigruppens interne vejledning til måling af diacetyl og 2,3-pentandion på gaschromotograf samt til vejledning af måling på SCABA. 24 Samtlige 82 siders bilag er efter aftale udleveret til min faglærer Mette-lise Gade Nielsen. Disse kan naturligvis fremsendes. 25 Scandinavian Brewing Analyzer. Apparatur der ved at måle alkohol og vægtfylde i en væske kan regne tilbage til hvor meget forgærbart kulhydrat der har været i væsken. 26 27 29 3 33 Ved gaschromotografi analyser laver man altid en intern standard for at kunne se forskellene mellem målinger på det samme stof. Den interne standard tilsættes alle prøver i ens og kendt koncentration. Værdier skrevet med fed skrift er udregnet med formlen i afsnittet Bearbejdning af prøver. 28 Bilag 4: TPB p. 244. GO p. 469, 2. afsnit, linie og 8. 3 GO p. 47, 2. afsnit, linie 8. Figur 2 er taget fra GO, tavle XXXVI figur 3. 32 Figur 7 er fra DKB/ACM p. 4. EBS p., 2. afsnit, linie 6. 34 CFS, linie 9. 35 Al information omkring Maturex er fra BWE - 32 -