MycAssay Aspergillus

Til in-vitro-diagnostik: Roche LightCycler 2.0 MycAssay Aspergillus Roche LightCycler 2.0 REF 080-045 Tilsigtet anvendelse MycAssay Aspergillus er indiceret til brug af kvalificerede laboratoriemedarbejdere til kvalitativ påvisning af Aspergillus spp. genomisk DNA ekstraheret fra respirationsprøver fra de nedre luftveje (f.eks. bronkiale prøver) som en hjælp for diagnosticering hos voksne patienter, som mistænkes at have Aspergillus-infektion eller -allergi. MycAssay Aspergillus er blevet valideret til anvendelse med Roche LightCycler 2.0. Resumé og forklaring Aspergillus spp. er ubikvitære opportunistiske skimmelsvampe, der forårsager både allergiske og invasive syndromer. Genusen omfatter ca. 300 arter, hvoraf 41 er blevet sat i forbindelse med menneskelige sygdomme. De fleste infektioner forårsages af A. fumigatus, A. flavus, A. terreus og A. niger; i mindre almindelige tilfælde har, A. nidulans og andre sjældne arter, som f.eks. A. sydowii, A. versicolor, A. lentulus og A. pseudofischeri været impliceret 1. De fleste infektioner og allergier forårsaget af Aspergillus spp. påvirker luftvejene. Allergiske syndromer inkluderer allergisk bronkopulmonal aspergillose (ABPA) og allergisk Aspergillus bihulebetændelse og forårsages normalt af A. fumigatus. Kronisk pulmonal aspergillose omfatter aspergillom, kronisk kavernøs pulmonal aspergillose og kronisk fibrøs aspergillose. Invasiv aspergillose (IA) forekommer hos risiko-patientgrupper inklusive dem, der er behandlet med kortikosteroider og dem med neutropeni eller fagocytisk dysfunktion (dvs. kronisk granulomatøs sygdom og HIV-infektion). Omkring 80 % af tilfældene af invasiv aspergillose involverer lungerne 2. Rutinediagnose af invasiv pulmonal aspergillose omfatter CT-scanning (Computed Tomography scanning), bronkoskopi og bronkoalveolær lavage (mikroskopi og podning), Aspergillus antigentest af blod, eller histologisk undersøgelse af kirurgiske biopsiprøver. I dette scenarie er podninger ofte fejlagtigt negative. 3. Faktisk er bronkoalveolære skylninger kun positive ved dyrkning i ca. 40 % af tilfældende, selv når diagnosen eftervises med andre metoder. 4,5,6,7, hvilket viser den manglende sensitivitet af podning med hensyn til påvisning af invasiv aspergillose og kronisk pulmonal aspergillose. Imidlertid er podninger vigtige, hvis de er positive, fordi mange diagnostiske test ikke indikerer enten den genus eller de arter af fungus, der forårsager sygdommen, eller dispositionsprofilen af den afsondring, der forårsager infektion. Allergisk bronkopulmonær aspergillosis komplicerer astma og cystisk fibrose 8 og viser sig sjældent uden underliggende sygdomme. De fleste tilfælde er associerede med A. fumigatus, i visse tilfælde med andre implicerede fungi. Sygdommens karakteristika er episodisk obstruktiv lungesygdom med sejt opspyt fuldt af Aspergillus hyfe, total serumværdi IgE >1.000 IU/mL og påviselige A. fumigatus-specifikke IgE og IgG antistoffer eller en positiv Aspergillus priktest. Opspyt-podninger kan være positive for A. fumigatus og bronkietasi ses eventuelt på en CT-scanning af brystkassen. Aktuelle metoder til diagnosticering af kronisk pulmonal aspergillose er en blanding af radiologi (som ikke er specifik) 9 og serologi (Aspergillus IgG antistoffer eller præcipitiner) som er positive ved de fleste former for aspergillose (og derfor ikke specifikke for nogen bestemt manifestation af aspergillose) 1 Podninger er kun positive i 40-65 % af de tilfælde, der er påvist ved radiologi og serologi 10,11. Da differentialdiagnosen er omfattende og inkluderer tuberkulose, atypisk 1 Database over stammer på www.aspergillus.org.uk 2 Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. (2005). The invasive and saprophytic syndromes due to Aspergillus spp. Medical Mycology: 43 (suppl. 1): S207-38. 3 Hope WW, Walsh TJ, Denning DW. (2005). Laboratory diagnosis of invasive aspergillosis. Lancet Infectious Diseases: 9: 609-22. 4 Levy H, Horak DA, Tegtmeier BR, Yokota SB, Forman SJ. (1992). The value of bronchoalveolar lavage and bronchial washings in the diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis. Respir Med: 86: 243-8. 5 Greub G and Bille J. (1998) Aspergillus species isolated from clinical specimens: suggested clinical and microbiological criteria to deteremine significance. Clin Microbiol Infect 4: 710-716. 6 Perfect JR, Cox GM, Lee JY, Kauffman CA, de Repentigny L,Chapman SW, Morrison VA, Pappas P, Hiemenz JW, Stevens DA, and the Mycoses Study Group. (2001). The impact of culture isolation of Aspergillus species: A hospital-based survey of Aspergillosis. Clinical Infectious Diseases; 33:1824 33. 7 Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J, Verbeken E, Verschakelen J, Boogaerts M. (2002. (2002). Use of Circulating Galactomannan Screening for Early Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Allogeneic Stem Cell Transplant Recipients The Journal of Infectious Diseases. 186:1297 306. 8 Tillie-Leblond I, Tonnel AB. (2005). Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy: 60: 1004-13. 9 Greene R. (2005). The radiological spectrum of pulmonary aspergillosis. Med Mycol: 43 (Suppl 1): S147-54. 10 Denning DW, Riniotis K, Dobrashian R, Sambatakou H. (2003). Chronic cavitary and fibrosing pulmonary and pleural aspergillosis: Case series, proposed nomenclature and review. Clin Infect Dis: 37 (Suppl 3): S265-80. 11 Camuset J, Lavolé A, Wislez M, Khalil A, Bellocq A, Bazelly B, Mayaud C, Cadranel J. (2007). Bronchopulmonary aspergillosis infections in the non-immunocompromised patient. Rev Pneumol Clin. 63:155-166. Dansk1 030-152 Version 1.3 01MAR12

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 mykobakteriose, sarkoidose, histoplasmose, coccidioidomykose, pneumokoniose, reumatoid lunge, Bechterew's sygdom og andre, er dokumentation af tilstedeværelsen af Aspergillus spp. i respirationsprøver vigtig for at forhindre forsinkelse af erkendelsen af pulmonal aspergillose og forkert behandling. MycAssay Aspergillus er et molekylært diagnosesæt til påvisning af Aspergillus spp. genomisk DNA ved hjælp af Molecular Beacon 12 Real-Time PCR-teknologi. Hele testproceduren, inklusive ekstraktion af DNA fra den kliniske prøve, kan gennemføres i løbet af 4 timer, sammenlignet med svampepodning, hvor det kan tage flere dage at producere positive resultater. Denne analyse giver fordele i forhold til de aktuelt tilgængelige diagnosemetoder for akut invasiv og kronisk pulmonal aspergillose. Disse fordele omfatter hurtigere påvisning af Aspergillus spp. og muligheden for forøget sensitivitet overfor Aspergillus spp. hos kraftigt immunsvækkede patienter, som mistænkes at have invasiv pulmonal aspergillose. Procedurens principper Efter blanding af reagenserne i MycAssay Aspergillus-sættet med en prøve, der indeholder den ønskede Aspergillus DNA-sekvens (en del af Aspergillus ribosomal 18S genet), vil thermocycling resultere i DNA-amplifikation. Analysen indeholder også en Internal Amplification Control (IAC), et DNA-fragment der ikke findes i Aspergillus, andre fungale, bakterielle eller humane genomer, for at påvise PCR-hæmmende substanser og bekræfte funktionen af testreagenserne. De amplificerede DNA-mål påvises ved hjælp af Molecular Beacon teknologi. Molecular Beacons er enkeltstrengede oligonukleotid hybridiseringsprober, som danner en trin-og-spiral struktur. Spiralen indeholder en probesekvens, som er komplementær til en målsekvens, og trinnet dannes af adouceringen af komplementære armsekvenser, som er placeret på hver side af probesekvensen. En fluorofor, som fluorescerer, når den exciteres med lys med den passende bølgelængde, er kovalent bundet til enden af én arm og en slukker, som undertrykker fluorescensen af fluoroforen ved tæt fysisk nærhed, er kovalent bundet til enden af den anden arm. Molecular Beacons fluorescerer ikke, når de befinder sig frit i opløsningen. Når de imidlertid hybridiserer til en nukleinsyrestreng, der indeholder en målsekvens, undergår de en konformationsændring, som fysisk adskiller flouroforen og slukkeren og gør dem i stand til at fluorescere ved excitation. Mængden af fluorescens ved en hvilken som helst given cyklus, eller efter gennemført cyklus, afhænger af mængden af tilstedeværende specifikke amplikoner på det pågældende tidspunkt. Real-Time PCR-systemet monitorerer samtidigt fluorescensen, der udsendes af hver beacon. Forholdsregler Sættet er udelukkende beregnet til at blive anvendt af professionelle laboratoriemedarbejdere. Der kræves procedurer til non-aerosol manipulation af prøver. Standardforholdsregler og institutionsretningslinjer skal følges ved enhver håndtering af alle prøver. Et materialesikkerhedsdatablad kan fås hos Myconostica Ltd. Denne test er udelukkende beregnet til in-vitro-diagnostisk anvendelse. Denne test må kun anvendes med Roche LightCycler 2.0 og LightCycler V4.1 software. Brug ikke reagenser eller kontroller, hvis de beskyttende poser er åbne eller gået i stykker ved modtagelsen. Reagenser og kontroller kan ikke ombyttes imellem sæt med forskellige partinumre. Hæld aldrig reagenser eller kontroller sammen fra forskellige glas, selvom de er fra samme parti. Anvend aldrig reagenser eller kontroller efter deres udløbsdato. Reagenser og kontroller må ikke genfryses eller genanvendes efter åbning. Anvend beskyttelsestøj og engangshandsker ved håndtering af kitreagenser. Undgå mikrobiel smitte og kontaminering med deoxyribonuclease (DNAse)-kontaminering af reagenser, når de afmålte mængder hældes ud af glassene. Det anbefales at bruge sterile, DNase-fri, lav-retentions, engangsfilterspidser eller positive fortrængningspipettespidser. Brug en ny spids til hver prøve eller hvert reagens. Bortskaf ubrugte reagenser og affald i overensstemmelse med gældende nationale og lokale love og forskrifter. For at undgå kontaminering med Aspergillus eller IAC-amplikoner må reaktionsglassene ikke åbnes efter amplifikation. Der kan eventuelt testes yderligere kontroller i overensstemmelse med vejledninger fra nationale, lokale eller akkrediterende organisationer. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i områder, hvor prøver eller sættets reagenser håndteres. Lave koncentrationer af DNA kan være ustabile ved ukorrekt opbevaring. Det anbefales, at ekstraktioner af DNA fra kliniske prøver opbevares ved -80 o C for at bevare deres integritet. Desuden skal gentagne optøninger og genfrysninger altid undgås, når det er muligt. 12 Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: 303-308. 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 2

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 Sættets indhold Beskrivelse Sættet består af fem forseglede 3-rums folieposer, som hver kan tages ud af boksen og anvendes separat. Hver pose indeholder tilstrækkeligt reagens til 8 reaktioner. Glas 1 (orange hætte) Glas 2 (grøn hætte) Glas 3 (klar hætte) Glas 4 (sort hætte) dntps MgCl 2 Bufferet opløsning af DNA polymerase kompleks <0,01 % primere <0,01 % Molecular Beacons <0,0001 % Internal Amplification Control (IAC) Internal Amplification Control er et rekombinant DNA-plasmid, der indeholder en ikke-infektiøs sekvens uden relation til målsekvensen (Aspergillus) Tris-HCl buffer Negativ kontrol Vand Positiv kontrol <0,0001 % positiv kontrol DNA Det positive kontrolmolekyle er et rekombinant plasmid, der indeholder Aspergillus -målsekvensen Tris-HCl buffer Volumen 66 µl 66 µl 25 µl 25 µl Sættet indeholder desuden: - MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol CD-ROM - Brugsanvisning - Analysecertifikat Opbevaring Sættet skal opbevares i frossen tilstand (-15 til -25 C) indtil udløbsdatoen, der er angivet på etiketten på sættets boks. Derefter skal det bortskaffes ifølge lokale forskrifter. Når en pose er blevet åbnet, skal dens indhold anvendes straks og må ikke genfryses eller genanvendes på et senere tidspunkt. Nødvendigt udstyr/materiale (medfølger ikke) Roche LightCycler 2.0 Real-Time PCR-system (herunder brugerhåndbog, tilsluttet computer og LightCycler software V4.1) LC 2.0 karruselcentrifuge (ekstra kapillæradaptere til mini-centrifuge) Prøvekarrusel for 20 µl kapillærer LC 2.0 20 µl kapillærglas med hætter Holder til kapillærstativ Kapillærudløser Instrument til påsætning af hætter Mikrocentrifuge Vortexmixer Mikropipetter (nødvendigt volumen 7,5 µl 20 µl) Sterile lav-retentions filterspidser Engangshandsker, uden pudder Mønsterbeskyttet DNA-dekontamineringsopløsning DNA-isolationssæt (se nedenfor) MycAssay TM CC-sæt (se nedenfor) Dansk 3 030-152 Version 1.3 01MAR12

LightCycler 2.0 Prøve Til in-vitro-diagnostisk brug Prøven til MycAssay Aspergillus analyse er totalt genomisk DNA ekstraheret fra klinisk BAL og andre prøver fra de nedre luftveje. Det anbefales at anvende følgende isolationssæt og udstyr, der også blev anvendt ved valideringen, til dette formål: - MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt (REF: 080-005, kan fås hos Myconostica) - Vortex-Genie 2 (Scientific Industrielle Inc., Ny York, USA) - Vortex Adaptor Plate (REF: 080-015, kan fås hos Myconostica) MycAssay Colour Compensation (CC) -sæt Nøjagtig analyse af data, som er produceret af MycAssay Aspergillus-analyse, kræver anvendelse af en farvekompenseringsfil, fremstillet ved hjælp af Myconostica MycAssay CC-sæt [ref 080-080]. Når den først er oprettet, kan filen anvendes til flere kørsler på samme apparat. Kontakt den lokale distributør for detaljer Bemærkninger til proceduren Læs hele protokollen inden arbejdet påbegyndes. Hele MycAssay Aspergillus processen (eksklusive DNA-ekstraktion) tager ca. 2 timer, afhængigt af antallet af testede prøver. Udførelse af testen skal foregå på en PCR-arbejdsstation eller i et præ-pcr laboratorium. Hvis en PCR-arbejdsstation ikke er tilgængelig, skal testen gøres klar i et dedikeret område i laboratoriet, 13, adskilt fra områder der bruges til DNAekstraktion, som regelmæssigt rengøres med DNA-dekontamineringsreagenser. Det skal imidlertid undgås at anvende DNA-dekontamineringsreagenser ved opsætning af Real-Time PCR, da de kan hæmme analysen. Brug mikropipetter til overføring af væsker. Mikropipetter, der kun er beregnet til dette formål, skal bruges til opsætning af disse reaktioner og de skal regelmæssigt dekontamineres. Det anbefales at anvende lav-retentions filterspidser for at sikre, at der ikke mistes noget DNA under opsætningsproceduren. Udvis forsigtighed ved håndtering af Glas 4. Dette Glas indeholder DNA-materiale til positiv kontrol og kontaminering kan medføre falsk positive testresultater. Bær altid handsker. Alle reagensglas skal forsynes med hætte efter brug og inden bortskaffelse. Noter omhyggeligt positionen af alle kapillærer, der indeholder relevante prøver i karrusellen med de 32-positioner på eksperimentalplan. Nøjagtig analyse af data kræver anvendelse af en farvekompenseringsfil, som er fremstillet ved hjælp af Myconostica MycAssay CC-sættet. Anvendelsesprocedure 1. Opsætning af Real-Time PCR 1.1 Tænd først for LightCycler 2.0 Real-Time PCR-systemet (instrument, tilhørende computer og centrifuge) og start den relevante software. Indtast brugernavn og adgangskode og vælg den diagnostiske database. Hvis det er den første kørsel om dagen, skal der udføres en selvtestning af instrumentet inden kørslen. 1.2 Husk: der skal udføres en farvekompenseringskørsel inden resultaterne analyseres for på LightCycler 2.0. Det behøver dog ikke at blive udført, inden dette produkt tages i anvendelse, men kan blive gjort og anvendt på denne kørsels fil senere. 1.2 Kontrollér, at arbejdsområdet er blevet rengjort med DNA-dekontamineringsreagenser og har fået lov at tørre fuldstændigt. Undgå anvendelse under opstilling af analyse, da overskydende rengøringsmiddel kan hæmme PCR-reaktionerne. 1.4 En pose indeholder én af hver af Glas Glas 1, Glas 2 og Glas 3. Der er tilstrækkelig mængde reagenser i én pose til gennemføre 8 reaktioner. Der skal udføres mindst én positiv kontrol og én negativ kontrol-reaktion pr. kørsel, hvor reagenserne er fra et enkelt sæt. Derfor kan én pose analysere 6 patientprøver. Hvis der skal testes mere end 6 prøver, kan der bruges mere end én pose, hvis de anvendte poser er fra samme sæt-parti. Men LightCycler 2.0 kan kun rumme op til 32 prøver i en enkelt kørsel, og der kan derfor udføres maksimum 30 patientprøver i en enkelt kørsel (4 poser). 1.5 Beregn antallet af nødvendige reaktioner iht. til nedenstående tabel: 13 Se for eksempel Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. (eds. Dieffenbach og Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USA. 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 4

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 Antal poser Maksimalt antal patientprøver 1 6 2 14 3 22 4 30 1.6 Tag det passende antal poser ud af fryseren. Brug aldrig en pose, der ikke længere er forseglet. Tag også patientprøverne ud af fryseren, hvis de blev frosset efter ekstraktionen. 1.7 Åbn det nødvendige antal poser og tag glassene ud. Hvis der anvendes mere end én pose, men der kun gennemføres ét sæt positive og negative kontroller, er det kun nødvendigt at tage Glas 3 og 4 ud af den ene pose. Udvis forsigtighed ved håndtering af Glas 4. Dette Glas indeholder DNA-materiale til positiv kontrol og kontaminering kan medføre falsk positive patientresultater. 1.8 Lad glassenes indhold tø op ved at anbringe dem på laboratoriebænken i 5-10 minutter og sikre, at indholdet af hvert glas er helt optøet inden der fortsættes. Bland glassenes indhold og patientprøverne med Vortex mixer; centrifugér dem derefter kort i en mikrocentrifuge for at sikre samling af alt indholdet i glassenes bund inden anvendelse. 1.9 Anbring det påkrævede antal 20 µl kapillærglas i en holder til kapillærstativer. Pas på ikke at efterlade mærker på glasset. 1.10 Opsæt altid først den negative kontrol og derefter patientprøverne. Den positive kontrol skal altid opsættes til sidst. 1.11 Reagens- og DNA-volumener vises i nedenstående tabel: Reagens Reaktion Negativ kontrol Patientprøver Positiv kontrol Glas 1 (orange hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 2 (grøn hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 3 (klar hætte) 10 µl - - Patientprøver - 10 µl - Glas 4 (sort hætte) - - 10 µl Totalt volumen 25 µl 25 µl 25 µl 1.12 Tilføj reagenser i den rækkefølge, der er vist i ovenstående tabel; Glas 1, derefter Glas 2, fulgt af skabelonen (negativ kontrol, patientprøve eller positiv kontrol). Vær forsigtig ved udtagning af alikvoter fra Glas 1; væsken er en smule viskøs og kan klæbe til glassets indvendige rand. Hvis dette sker, skal det køre igen i centrifugen for at samle det endelige indhold i bunden af glasset, inden det forsøges at fjerne de endelige alikvoter. 1.13 Brug en ny pipettespids til hver væskeoverføring. Sæt hætten på hvert reagensglas igen efter brug og kassér det straks sammen med det resterende indhold i en lukket beholder til klinisk affald. Ubrugte reagenser kan ikke gemmes til senere brug. 1.14 Vær især forsigtig ved udtagning af væsken med pipette fra Glas 4 (DNA til positiv kontrol) for at sikre, at den ikke kontaminerer andre reaktioner. Sæt hætte på de andre kapillærglas, inden der åbnes for Glas 4, for at reducere risikoen for krydskontaminering. 1.15 Sæt hætterne, der er vedlagt i æsken med kapillærglas, forsigtigt på kapillærglassene med et instrument beregnet til formålet. Kontrollér, at hætterne sidder godt fast på kapillærglassene. Kapillærglas kan få hætterne på, når skabelonen er blevet tilsat reaktionen, hvis det ønskes, for at reducere risikoen for kryds-/miljøkontaminering. 1.16 Hvis karruselcentrifugen ikke er tilgængelig, centrifugeres prøverne ned i en minicentrifuge med de adaptere, der er vedlagt en stativholder. Ellers fortsættes med 1.17. 1.17 Overfør meget forsigtigt alle kapillærglassene til karrusellen i præcist den samme rækkefølge som i stativet. Start med det første kapillærglas i position 1 og fortsæt i stigende rækkefølge uden mellemrum. Skub hvert kapillærglas hele vejen ned til det sidder helt på plads. 1.18 Hvis ikke allerede er centrifugeret ned i 1.16, skal prøverne centrifugeres med LC 2.0 karruselcentrifugen. 1.19 Gå straks videre til Afsnit 2. -reaktioner er stabile på laboratoriebænken i op til 60 minutter. Dansk 5 030-152 Version 1.3 01MAR12

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 1.20 Efter PCR-opsætningen skal det sikres, at arbejdsområdet rengøres omhyggeligt med DNAdekontamineringsreagenser. 2. Udførelse af kørslen 2.1 Indsæt MycAssay Aspergillus Myconostica Protocol CD-ROM'en. 2.2 Gå til Import via mappen File og vælg filerne Object.ixo. Importer filen Macro MAA V1.2.ixo fra cd'en til din database. 2.3 Gå til Save via mappen File og gem makroskabelonen på det ønskede sted i din database. 2.4 Vælg Run Macro fra værktøjslinjen. 2.5 Vælg skabelonfilen Macro MAA v1.2 og tryk på Open. 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 6

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 2.6 Følg guidens vejledninger. Afkryds feltet Perform Self-Test, hvis det er den første kørsel på dagen. 2.7 Navngiv og gem kørselsfilen på det ønskede sted. 2.8 Gå til prøveafsnittet ved at klikke på fanen i venstre side af skærmbilledet. Rediger prøvens nummer i feltet Samples Count og navne i fanen Capillary view. Navngiv prøverne ifølge din eksperimentalplan ifølge positionerne i karrusellen. 2.9 Anbring den centrifugerede karrusel i LC 2.0-instrumentet. Kontrollér, at rillen under prøveposition 1 på karrusellen låses på plads med stiften på det termiske kammer. Sørg for, at karrusellen er sat fast i kammeret og luk låget. 2.10 Efter det er gjort, trykkes på knappen Start. Kontroller, at instrumentet har fundet alle kapillærglas i karrusellen, og at programmet er startet. Dansk 7 030-152 Version 1.3 01MAR12

LightCycler 2.0 3. Dataanalyse og fortolkning Til in-vitro-diagnostisk brug 3.2 Husk: der skal anvendes et farvekompenseringsobjekt, inden resultaterne analyseres for på LightCycler 2.0. Hvis du ikke har oprettet en, skal du gøre det nu, inden der fortsættes med dataanalyse og fortolkning. Når kørslen er afsluttet, kontrolleres indholdet af pop-up rapporten og den kan eventuelt udskrives. 3.3 Aspergillus-resultaterne kan ses i Pathogen (530) analyseafsnittet og IAC- resultaterne i IAC (560) analyseafsnittet. 3.4 I begge afsnit, ASP (530) og IAC (530), vælges den korrekte farvekompenseringsfil (MycAssay CC-filen), der skal anvendes til eksperimentet. 3.5 Analysér hver prøve ved at starte med kontrollerne, som vist i nedenstående flowskema (detaljer findes også i tabellen under flowskemaet). 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 8

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 NEJ Kontrollér den negative kontrol Er ASP Cp 39.0 eller registreret som No Cp? JA Kørslen er kontamineret HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den negative kontrol Er IAC Cp 30.3-33.9? Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen JA Kørselsfejl HANDLING: Gentag kørslen NEJ Kontrollér den positive kontrol Er ASP Cp 15.0-20.0? JA Positiv for Aspergillus DNA JA Kontroller de kliniske prøver Er ASP Cp 37.0 NEJ Negativ for Aspergillus DNA JA Kontroller de kliniske prøver Er IAC Cp 30.3-33.9? NEJ IAC fejl HANDLING: Gentag prøven. Hvis det samme resultat opnås igen, mistænkes inhibitoren i prøven Prøve Pathogen (530) Cp IAC (560) Cp Fortolkning Yderligere handling Negativ kontrol 39.0 eller No Cp Indenfor 30.3-33.9 Negativ kontrol acceptabel Patientresultater er gyldige Negativ kontrol 39.0 eller No Cp <30.3 eller >33.9 Fejl i negativ kontrol Gentag hele kørslen Negativ kontrol <39.0 Indenfor 30.3-33.9 Kontaminering Gentag hele kørslen Positiv kontrol Indenfor 15.0-20.0 Ikke relevant Positiv kontrol acceptabel Patientresultater er gyldige Positiv kontrol <15.0 eller >20.0 Ikke relevant Fejl i positiv kontrol Gentag hele kørslen Patient prøve Patient prøve Patient prøve 39.0 eller No Cp Indenfor 30.3-33.9 Negativ for Aspergillus Rapportér resultat: Resultat 1 37.0 Ikke relevant Positiv for Aspergillus Rapportér resultat: Resultat 2 39.0 eller No Cp <30.3 eller >33.9 IAC fejl i prøve Gentag prøve: Resultat 3 * CCO = clinical cut-off. Alle resultater på eller under dette niveau betragtes som klinisk positive. Andre prøver rapporterer eventuelt Cp-værdier >37.0, men disse afspejler normale eller baggrundsniveauer af Aspergillus-indholdet i luftvejsprøven. Se klinisk rapport (Resultat 1, 2 eller 3) Dansk 9 030-152 Version 1.3 01MAR12

LightCycler 2.0 4 Fejlfinding 4.1 Den negative kontrol har genereret et positivt signal i 530-kanalen: Til in-vitro-diagnostisk brug Der opstod kontaminering under opsætningen. Resultater fra hele kørslen er ikke pålidelige og kan ikke betragtes som nøjagtige. Gentag hele kørslen og vær meget omhyggelig ved tilføjelse af skabelonerne, især den positive kontrol (Glas 4), for at sikre, at der ikke sker krydskontaminering. Kontrollér at arbejdsområdet og instrumenterne bliver korrekt dekontamineret før og efter brug. Den negative kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg for, at kapillærglassene er angivet korrekt inde i softwaren. 4.2 Den negative kontrol IAC Cp-værdi ligger ikke inden for det acceptable område: PCR er blevet hæmmet. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne er helt tørre efter brug af dekontamineringsmidler inden PCRopsætning. Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Reagens fra enten Glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til PCR-reaktionen, eller der blev tilsat den dobbelte mængde fra Glas 2. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis væskeniveauet er højere eller lavere i ét kapillærglas i forhold til andre. Den korrekte CC-fil blev ikke anvendt til dataene. Opret en CC-fil med Myconostica MycAssay CC-sæt og brug den til resultaterne og gentag analysen. Kontakt din lokale distributør for detaljer angående dette sæt. 4.3 Den positive kontrol er negativ: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Der opstod en fejl under trin 1.11-1.13 og den positive kontrolskabelon (Glas 4) blev anbragt i det forkerte reaktionsglas. Gentag kørslen idet der udvises stor forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis der observeres et højere væskeniveau i et reaktionsglas og et lavere niveau i et andet, i forhold til normalt niveau. Reagenset fra enten Glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til reaktionen. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan påvises, hvis der observeres et lavere væskeniveau i denne reaktionskapillærglas sammenlignet med andre. Den positive kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg for, at kapillærglassene er angivet korrekt inde i softwaren. 4.4 Patientprøve(r) er negativ(e) og IAC er udenfor område (Resultat 3): Det er sandsynligt, at den/de ekstraherede kliniske prøve(r) indeholder PCR-hæmmere. Vi anbefaler, at DNA fra prøver ekstraheres ved hjælp af MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt. 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 10

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 4.5 Patientenprøven er negativ i ASP (530)-afsnittet og IAC (560)-diagrammet afviger signifikant fra den almindelige baseline (som vist i eksemplet herunder. Pilene angiver abnorme diagrammer): PCR-reaktionen var hæmmet. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne er helt tørre efter brug af dekontamineringsmidler inden PCRopsætning. Kør patientprøven igen. Hvis problemet gentages, er der PCR-inhibitor i prøven. Rapporter prøven som ubestemt. 4.6 Resultatet i IAC (560)-afsnittet er næsten identisk med resultaterne i Pathogen (530) -afsnittet. Der blev ikke anvendt nogen eller der blev anvendt en ukorrekt farvekompenseringsfil til eksperimentets resultater. Kontroller i begge analyseafsnit at der tændt for Colour Compensation. og at den samme MycAssay CC-fil anvendes i begge kanaler. 4.7 Basislinjen for visse prøver svarer til den negative kontrol, og angiver at der ikke er opstået amplifikation. Men softwaren har rapporteret en positiv Cp-værdi (som i figuren herunder): Et output af en positiv Cp for et negativt amplifikationsdiagram er kun blevet set to gange i 154 negative reaktioner udført under valideringsundersøgelser. Skulle dette ske, skal prøven/erne gentages for at bekræfte et negativt resultat. Dansk 11 030-152 Version 1.3 01MAR12

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 4.8 Når jeg anvender CC-objekter dykker nogle data i 560 IAC-kanalen, hvilket fører til Cp-værdier, som er udenfor det acceptable område: Dette er fuldstændig normalt for reaktioner, der indeholder høje koncentrationer af den ønskede DNA og vil ikke interferere i fortolkningen af patientresultater. Følg den normale analyse. Det vil kunne ses, at for prøver, som er positive for Aspergillus, er IAC-resultatet ikke påkrævet for at afgøre et resultat for patienten. 4.9 Der findes ingen resultater for kanaler med prøver eller kontroller: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Det anvendte udstyr fungerer ikke optimalt. Kontrollér, at dit Real-Time PCR-instrument er blevet serviceret korrekt og er up-to-date, samt at det er blevet fuldt kalibreret som beskrevet i denne installations- og vedligeholdelsesvejledning. Der blev brugt en ukorrekt protokolfil under opsætning af softwaren. Referér venligst til Afsnit 2 og vælg den korrekte protokolfil, som specificeret for hver softwaretype/-version, fra Myconostica Protocol CD-ROM'en. Det er kun muligt at finde den fil, der passer til softwaren. Gentag kørslen ved hjælp af den korrekte protokolfil. Hvis du har yderligere spørgsmål, eller hvis du får problemer, bedes du kontakte vores tekniske support (productsupport@lab21.com) Præstationskarakteristika og -begrænsninger Sættet blev indledningsvist valideret med Cepheid SmartCycler. Nogle af analysens driftskrav blev genvalideret på LightCycler 2.0 platformen med 20 µl kapillærglas (Roche kat. nr. 04929292001 eller 11909339001), og er rapporteret herunder. Hvor det ikke blev forventet, at forskellene mellem platformene ville påvirke præstationen af analysen, og derfor kravet, blev undersøgelsen ikke gentaget. Disse resultater, der er opnået ved brug af SmartCycler, forudsættes at kunne overføres til LightCycle 2.0 platformen. Analytisk sensitivitet Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol LightCycler 2.0 og PCR-skabeloner genereret hos Myconostica, blev Limit of Blank (LoB) for MycAssay Aspergillus bestemt til at være en Cp-værdi på 39.0, mens Limit of Detection (LoD) blev bestemt til at være <25 kopier af mål-dna ved brug af AF293-stammen af A. fumigatus. Analytisk selektivitet Genomisk DNA ekstraheret fra Penicillium spp. genererer positive resultater. Dette skyldes det faktum, at sekvenserne af de molekylære mål i stor udstrækning bevares mellem Aspergillus og Penicillium. Det skal derfor bemærkes, at et positivt resultat med denne analyse kan være et resultat af infektion med Penicillium, i stedet for Aspergillus. 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 12

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 Analytisk selektivitet blev testet ved hjælp af DNA ekstraheret fra flere forskellige fungale og ikke-fungale arter. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende arter: Blastomyces capitatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus, Fusarium solani, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospermum, S. prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatum. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende arter: Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius. Humant DNA og følgende 3 arter, Pneumocystis jirovecii, Histoplasma capsulatum og Alternaria alternata, blev ikke testet på LightCycler 2.0-systemet, men blevet testet på SmartCycler : Alle 4 gav negative resultater med analysen. Reproducerbarhed og repeterbarhed Repeterbarheden og reproducerbarheden blev bestemt af 4 forskellige operatører, der testede et panel med 7 forskellige skabeloner, i tre eksemplarer, ved i alt 168 analyser. Der blev gennemført eksperimenter ved hjælp af 1 fremstillet portion af sæt, på 2 forskellige instrumenter, der var placeret 2 steder i Storbritannien. Resultaterne blev analyseret i forhold til Limit of Blank (LoB) og clinical cut-off (CCO). Ved en koncentration på 6 gange Limit of Detection (LoD), var resultaterne fra 100 % af alle testede prøver overensstemmende (positive) for LoB, og 87,5 % af prøverne var overensstemmende ved CCO. Ved koncentrationer højere end 6 x LoD var resultaterne fra 100 % af alle prøver positive ved både CCO og LoB. Overførsel af Clinical Cut-Off Clinical cut-off-værdien på 36.0 var blevet fastslået på SmartCycler. Denne cut-off-værdi blev overført analytisk til LightCycler 2.0 -platformen ved hjælp af en skabelon med en Aspergillus koncentration, der var blevet påvist at give 95 % positive resultater ved CCO på SmartCycler. Der blev konstatere en Cp-værdi på 37.0, som derefter blev bekræftet ved hjælp af skabeloner med 3 forskellige koncentrationer. Følgende præstationskrav blev fastlagt ved brug af Cepheid SmartCycler Interfererende substanser (kontraindikationer for brug) Følgende forbindelser blev testet i klinisk relevante koncentrationer og det blev konstateret, at de ikke hæmmede analysen: acteylcystein, amphotericin b, beclometasondipropionat, budesonid, colistimethatnatrium, fluticasonpropionat, formoterolfumaratdehydrat, ipratropiumbromid, lidokain, mannitol, salbutamolsulphat, salmerterol, natriumklorid, natriumcromoglicat, terbutalin, tobramycin. Præstationsevaluering Respirationsprøver (BAL), der var blevet indsamlet fra 2 hospitaler, ekstraheret ved hjælp af MycXtra sættet og opbevaret, blev brugt til at evaluere præstationen af sættet med kliniske prøver. Der blev foretaget sammenligninger af både klinisk diagnose og podning. Cut-off-værdien med en Ct-værdi på 36.0 blev fastslået efter en gennemgang af et datasæt fra prøver, der var indhentet fra forskellige steder og forskellige patientpopulationer.forskellige cut-off-værdier blev evalueret for sandsynligheden for differentiering mellem sygdomstilstand og ikke-sygdomstilstand. Dansk 13 030-152 Version 1.3 01MAR12

LightCycler 2.0 PCR v klinisk diagnose Klinisk positiv Klinisk negativ Til in-vitro-diagnostisk brug PCR positiv 31 1 0,97 PPV (positiv prædiktiv værdi ) PCR negativ 2 10 0,83 NPV PCR v Aspergillus podning 0,94 0,91 Sensitivitet Dyrkning positiv Specificitet Dyrkning negativ PCR positiv 29 3 0,91 PPV (positiv prædiktiv værdi ) PCR negativ 2 10 0,83 NPV 0,94 0,77 Sensitivitet Specificitet Af de testede prøver indeholdt 0,8 % PCR-hæmmere som rapporteret af IAC, efter ekstraktion ved hjælp af MycXtra sættet. Klinisk rapportering MycAssay Aspergillus-sættet er beregnet til at fungere som en hjælp ved diagnosticering. Resultaterne skal vurderes i sammenhæng med patientens kliniske tilstand og andre diagnostiske testresultater. I det følgende er angivet anbefalede rapporter, hver afhængig af fortolkningen af analyseresultatet: Resultat nr. 1 Aspergillus spp. ikke påvist. Resultat nr. 2 Aspergillus spp. påvist; positivt resultat. Denne analyse påviser også Penicillium spp. Resultat nr. 3 Test mislykket; hæmmere eller andre ukendte substanser tilstede. Procedurens begrænsninger Den grundlæggende begrænsning af denne procedure relaterer til kvaliteten af den primære prøve: - Hvis prøven er meget lille eller ikke er hentet fra det påvirkede område af lungen, vil testen være mindre følsom og kan være fejlagtigt negativ. - BAL-prøver skal centrifugeres inden DNA-ekstraktion fra tabletten. - Data har også vist, at en reduktion af voluminet af supernatant, der buges i ekstraktionsprocessen, opnået ved centrifugeringen, reducerer andelen af hæmmere, der trænger ind i systemet. Falske positive resultater er mulige, hvis det inficerende stof er Penicillium spp. som ikke kan differentieres fra Aspergillus spp. ved hjælp af dette sæt. Selvom MycXtra Fungal DNA ekstraktionsproceduren er beregnet til at fjerne PCR-hæmmere, er der ikke foretaget evaluering af alle lægemidler eller patientpopulationer. Proceduren er ikke blevet fuldt vurderet med spyt og er heller ikke blevet vurderet med inducerede saltvandsprøver eller på prøver fra børn. Falske positive resultater kan være forårsaget af ekstern kontaminering af den originale prøve eller test. En sådan kontaminering kan forårsages af Aspergillus-kontamineret luft, ringe eksperimentalteknik med hensyn til positiv kontrol eller ekstern (især via pipette) kontaminering med Aspergillus DNA. Da et sandt positivt resultat kan opnås fra patienter, som forbigående eller vedvarende er koloniseret af Aspergillus spp., kræves der klinisk vurdering ved fortolkning af testresultaterne, i sammenhæng med sygdom. 030-152 Version 13 01MAR12 Dansk 14

Til in-vitro-diagnostisk brug LightCycler 2.0 LICENSER TopTaq TM Hot Start leveres af QIAGEN. QIAGEN er et registreret varemærke tilhørende Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland. Dette produkt sælges under licens fra Public Health Research Institute, Newark, New Jersey, USA og må kun bruges under PHRI-patentrettigheder til human in vitro-diagnostik. SmartCycler er et registreret varemærke tilhørende Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA. En del af dette produkt er dækket af en eksklusiv licens til en patentansøgning ejet af Fred Hutchinson Cancer Centre, Seattle, USA. LightCycler er et registreret varemærke tilhørende Roche Diagnostic, GmbH. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375 Email: productsupport@lab21.com Dansk 15 030-152 Version 1.3 01MAR12