Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.1 AKUT TOKSICITETSTEST MED FERSKVANDSKREBSDYRET DAPHNIA MAGNA K. Ole Kusk September 2009 Daphnia magna tilhører dyregruppen krebsdyr. Dafnie-arterne er ferskvandsorganismer, som filtrer planktonalger ud af vand og udnytter dem som føde. Dafnier og lignende små krebsdyr er til gengæld føde for fisk og deres larver. Dafnier findes i de fleste søer og vandhuller i Danmark, og da de er energi-bindeled mellem primærproducenterne (mikroalgerne) og større organismer, er de samtidig en økologisk vigtig gruppe. Mange dafniearters livcyklus er bemærkelsesværdig, fordi hunnerne kan få unger uden befrugtning (jomfrufødsel). Ungerne, der fødes på denne måde er dermed genetisk identiske med deres mødre. Hvis forholdene i en sø eller vandhul bliver dårlige (fødemangel, kulde, tørke) kan der blandt afkommet komme hanner, og en egentlig parring og befrugtning kan derefter finde sted. Resultatet af en sådan bliver et tykskallet hvileæg, som kan oversomre eller overvintre og klække, når forholdene igen bliver gunstige for dafnierne. Den danske klon af Daphnia magna blev isoleret i 1978 i en sø ved Birkerød og har siden været dyrket i laboratoriet, hvor den fodres med dyrkede grønalger evt. suppleret med lidt tørgær. Daphnia magna kan leve i adskillige måneder. Den begynder typisk at få de første unger, når den er 8 dage gammel. Inden fødslen opbevares ungerne i en rugepose i moderens rygskjold, hvor de kan ses som u- udviklede eksemplarer med et tydeligt øje (se figur 1). En hun får typisk 2-3 kuld om ugen og kan i løbet af tre uger producere 60-120 unger. Det er de nyfødte unger (< 24 timer gamle) som normalt anvendes i akuttests. Princip i akut-testen Dafnier eksponeres for forskellige koncentrationer af teststoffet i op til 48 timer. Efter 24 og 48 timer optælles antallet af mobile og immobile dyr og resultatet noteres. Koncentrationer som immobiliserer 50 og 10 % af dyrene efter 24 og 48 timer beregnes eller aflæses af en graf (EC 10,24 t, EC 50,24t, EC 10,48 t, EC 50,48t ) 1. 1 Lejlighedsvis ses effekt-koncentrationer fra dafnietests angivet som IC-værdier (IC ~ Immobilising Concentration)
Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.2 Figure 1: Daphnia magna-hun med unger i rugeposen. Tillige ses tarmkanalen, som er fyldt med grønalger og øverst på hovedet det store nauplius-øje (kan også ses hos ungerne). Dafnierne har et to-klappet skjold som omgiver hele kroppen. Imellem de to skjold-halvdele ses de såkaldte bladfødder, der dels fungerer som gæller og dels som filtreringsapparater. Den store antenne, som de svømmer med ligger her på billedet tæt ind til skjoldet. Immobilitet Dyr, som ikke er i stand til at svømme inden for 15 sek efter en forsigtig omrøring i testglasset, anses for at være immobile. Før testen: 24 timer før teststart oprenses kulturerne. Dagen efter kan de producerede unger høstes og anvendes i test, da de på dette tidspunkt alle vil være mindre end 24 timer gamle. Fortyndingsrækken fremstilles ligeledes inden teststart. Fremstilling af fortyndingsrække: Fremstil en stamopløsning per teststof. Om muligt fremstilles stamopløsningen ved at opløse teststoffet direkte i mediet. Fremstil 5-7 testkoncentrationer ud fra stamopløsningen. Medium uden teststof anvendes som kontrolmedium. Mål ph i kontrollen og i stamopløsningen før start. Om nødvendigt justeres ph med stærk syre eller base til kontrolmediets ph.
Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.3 Fremgangsmåde ved testen: Undersøgelser af stoffer toksicitet foretages normalt i to trin et første præliminært, hvor der fastlægges et omtrentligt koncentrationsområde med effekt og et andet definitivt trin, der er den egentlige test, og hvor det toksiske stofs EC50 bestemmes. I den præliminære test anvendes en stor faktor (f.eks. en faktor 10) mellem koncentrationsniveauerne. På den måde kan undersøges et stort koncentrationsinterval, hvor man typisk finder en eller flere koncentrationer, hvor alle dør, og tilsvarende en eller flere koncentrationer uden effekt, men et sted i koncentrationsrække vil man finde ændringen fra ingen til fuld eller delvis effekt, og det er i koncentrationsområdet, hvor ændringen sker, at den definitive test udføres og nu anvendes en mindre faktor mellem koncentrationerne (typisk en faktor 1.6-max. 3). Den preliminære test: 5-7 koncentrationer fremstilles med en faktor 10 mellem koncentrationerne (eks: (mg/l) 0.001; 0.01; 0.1; 1; 10; 100). Desuden skal der være en kontrol-gruppe, som ikke udsættes for toksisk materiale. Da det ikke er hensigten at underkaste resultaterne statistisk behandling udføres denne test oftest med færre dyr (f.eks. 10 dyr i to grupper) per koncentration. (Hvis man på forhånd har en vis viden om det toksiske niveau, kan man evt. springe direkte til den definitive test) Den definitive test: På basis af resultatet af den preliminære test fastlægges en koncentrationsrække for den definitive test. Faktoren imellem de enkelte koncentrationer er ofte 2-2,5 og der testes 5-7 koncentrationer (eks: (mg/l) 1; 2; 5; 10; 20; 50; 100). Koncentrationsrækken skal inkludere mindst en koncentration, hvor der i den præliminære test ikke blev observeret effekter, og mindst en koncentration, hvor der blev observeret en høj effekt (80% eller mere). Hvis koncentrationsrækken er fornuftigt valgt, vil det som regel være muligt at beregne en EC50 og en EC10-værdi på basis af resultatet af den definitive test, hvilket er det væsentligste formål med at udføre undersøgelsen. Der anvendes 20 dyr per koncentration fordelt i 4 grupper (5 dyr per bægerglas).
Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.4 Fremgangsmåde: Der anvendes et testmedium, som fremstilles i laboratoriet (se senere). 1. Testen udføres i 50- eller 100-ml bægerglas med 25 ml testopløsning. (Overvej om teststoffet vil sorbere til glasvæggene.) 2. 5 dyr overføres til bægerglassene med et net, hvorved det overførte vandvolumen minimeres. Skyl nettet i kontrolmedium, når det har været i berøring med testopløsning. 3. 20 dyr bruges per testkoncentration (dvs. 4 bægerglas per koncentration) og 20 dyr i kontrolgruppen (ligeledes fordelt på 4 glas). 4. Bægerglassene overdækkes med transparent film eller andet velegnet dække. Alle glas placeres på en bakke som igen placeres mørkt ved 20 o C. 5. Efter 24 timer tælles antallet af mobile og immobile dyr ved at placere glassene på en lys baggrund (evt. et lysbord). Resultaterne indføres straks i et skema (se bagest i denne vejledning). Optælling igen efter 48 timer. 6. Ilt (O2) og ph males ved start og slutningen af testen i mindst kontrol og højeste koncentration. 7. På basis af observationerne beregnes eller aflæses 2 EC 10,24h and EC 50,24h ved hjælp af et probit-program eller probit-papir. (Se Program-beskrivelsen Probit ). Hvis mindre end to koncentrationer giver et partielt respons (0 < respons < 100 %) kan probit-papir ikke anvendes eller EC-værdierne beregnes i stedet kan EC-værdierne angives som koncentrationsintervaller. Validitetskriterie: 1. Iltindholdet i testopløsninger skal være > 30 % af mætning ~ til ca. 2 mg O 2 /L 2. Dødeligheden i kontrollen må ikke overstige 10 % Andet; Hvis teststoffet ikke kan opløses direkte i mediet, kan man lave en stærkere stamopløsning i acetone eller DMSO og derfra fortynde videre i dafniemedium. Vær opmærksom på koncentrationen af opløsningsmiddel ikke overstiger 0,1 i den færdige testopløsning. Husk! at medtage kontrol prøver i testen med rent medie tilsat 0,1 opløsningsmiddel (solvent-kontrol).. Ved akuttest af forurenede vandprøver, der ikke må fortyndes anvendes forskriften ifølge ISO 1996 (5.2) hvor saltene til mediet afvejes direkte i prøven. 2. EC = Effect Concentration
Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.5 Til referencetest anvendes: Kaliumdichomate (K2Cr2O7) som opløses i dafniemedie. Konc : IC 50,24t skal intervallet ligge mellem 0,9-2,4 mg/l i følge ISO 1996. Koncentrationsrækken fremstilles i 100 ml. målekolber. Materialeliste: - M7- medie eller minimal-medium - Teknisk vægt - 100 ml-målekolber - Diverse Finn-pitpetter og spidser - 50 ml- eller 100 ml-bægerglas (24-32 stk) - Vandfast tusch eller labels til mærkning af glas og kolber - ph-meter - Iltmåler - Plastkar til opbevaring af dafnier - Stereolup eller lysbord - Finmasket nylonnet (200 m) - Urglas eller parafilm til overdækning af bægerglas - Grå bakker - Resultatskema til notering af antal dafnier ved start og immobilitet/dødelighed.
Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.6 Data fra akut toksicitetstest på TESTORGANISME: DAPHNIA MAGNA STARTDATO:.. KURSUS/FAG : NAVN PÅ TESTSTOF: OBSERVATØR: ph O 2 -INDHOLD (% AF MÆTNING) START SLUT START SLUT KONTROL HØJESTE KONCENTRATION Koncentration (Enhed) :. Total antal dyr per koncentration Antal dyr per glas A C B D Antal immoblile 24 timer A B C D Total antal immobile 24 timer Antal immoblile 48 timer A B C D Total antal immobile 48 timer Kontrol
Daphnia magna - Akut toksicitetstest Side 5.7 0 timer 24 timer 48 timer KONC. O 2 ph O 2 ph O 2 ph Kontrol (Enhed) :. (Enhed) :. 24 timer 48 timer EC 10 EC 50 EC 90 Effect Concentrations (EC)