Til identifikation og tælling af CD34+ celler i humane, mobiliserede blodprøver og blodprøver taget ved leukaferese.

Transkript

1 CD34Count Kit Kodenr. K udgave Til identifikation og tælling af CD34+ celler i humane, mobiliserede blodprøver og blodprøver taget ved leukaferese. Sættet indeholder reagenser til 50 dobbelte tests. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 1/13

2 Indhold Tilsigtet anvendelse... 3 Resumé og forklaring... 3 Procedureprincip... 3 Reagenser... 4 Medfølgende materialer... 4 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 4 Klargøring af reagens... 5 Forholdsregler... 5 Opbevaring... 6 Indsamling og klargøring af prøver... 6 Farvningsprocedure... 6 Farvning af celler og tilsætning af kontroltælleperler... 6 Retningslinjer for vådspids reverspipetteringsteknik... 7 Kvalitetskontrol... 7 Kontrolprøve... 7 Tid som kvalitetskontrol... 8 Dobbelte tests... 8 Dataindsamling... 8 Opsætning til dataindsamling for CD34Count Kit... 8 Analyse af data Resultater Værdiangivelse Begrænsninger Fejlfinding Instrument Referencer Side ( ) K2370/DK/JLA/ p. 2/13

3 Tilsigtet anvendelse Til in vitro diagnostisk brug i flowcytometri. CD34Count Kit er beregnet til brug som en in vitro diagnostisk test til at identificere og tælle CD34-positive (CD34+) hæmatopoietiske stamceller I humant mobiliserede, perifere blodprøver og blodprøver tages ved leukaferese. Resumé og forklaring Hæmatopoietiske progenitorceller (HPC er) kan mobiliseres fra knoglemarven til perifert blod (PB) af cytotoksiske stoffer, cytokininer, eller en kombination af begge. Denne mobilisering gør det muligt at opsamle HPC er ved aferese i tilstrækkeligt store mængder til at foretage transplantationer (1, 2). Brugen af PB-stamceller (PBSC er) til transplantation er vokset i løbet af de sidste ti år, og til autolog transplantation foretrækkes PB nu frem for knoglemarv som kilde til HPC er. Traditionelt har den totale mononukleære celletælling af celler fra knoglemarven i forhold til modtagerens kropsvægt været en brugbar indikation for transplantationspotentialet. Dette kan dog ikke anvendes ved mobiliseret opsamling af PBSC, da deres indhold af HPC varierer. Sidst i firserne blev det bestemt, at aktivitet og transplantationspotentiale af praktisk taget alle kolonidannende celler (CFC er), der var høstet fra knoglemarv eller perifert blod, var indeholdt i en lille population af celler med CD34-antigen (3). CD34 er et celleoverfladeantigen, der på de hæmatopoietiske celler er begrænset til de tidlige progenitorer af alle stammer (1, 2). CD34+ HPC er kan således gendanne multistamme-hæmatopoiese hos patienter, der har fået foretaget myeloablation. Antallet af CD34+ celler bestemt ved flowcytometri pr. kilo af recipientens blod er den bedste indikator for den rekonstruktive hæmatopoietiske kapacitet af perifer stamcelletransplantation (PBSC) (1, 2). Sutherland et al. (5) har udviklet et sæt kliniske retningslinjer for "International Society for Hematotherapy and Graft Engineering" (ISHAGE - det internationale selskab for hæmoterapi og transplantatteknik) til enkel og standardiseret CD34+ tælling. Disse retningslinjer er anvendt i CD34Count Kit, der indeholder anti-cd45/fitc og anti-cd34/rpe, og gør det således muligt at identificere leukocytterne (CD45+) og finde de "rigtige" CD34+ celler, der dæmper CD45- fluorescensen og har lav sidespredning (CD45 dim, SSC low ). Tilsætning af CytoCount tælleperler til celleopløsningen synliggør koncentrationen af CD34+ celler pr. enhed af den oprindelige prøve (f.eks. den total CD34+ celletælling) ud fra en enkelt flowcytometrisk bestemmelse (enkeltplatformsteknik) (1-3). Enkelt-platformsteknikken har færre kilder til variation i forhold til de almindeligt brugte dual-platformsteknikker, og multicenterundersøgelser har vist, at de giver en bedre variationskoefficient (CV), og at der er mindsket risiko for afvigende resultater (4). Den valgfri tilsætning af DNA-farvningen, 7-aminoactinomycin D (7-AAD), der også er indeholdt i sættet, gør det muligt at udelukke døde celler fra analysen (1, 2). 7-AAD kan kun diffundere ind i og farve døde celler, da disse cellers membran ikke længere er intakt. Procedureprincip CD34Count Kit er beregnet som en optimal metode til tælling af CD34+ celler, og sættet følger ISHAGE-retningslinjerne for enkelt-platformsteknikker (1, 2, 5). Testen udføres i to eksemplarer ved at farve prøven med en tofarvet reagens, der består af antihuman CD45/FITC og antihuman CD34/RPE. Efter farvningen af prøven lyseres de røde blodlegemer med et ammoniumkloridbaseret reagens til lysering, og 7-AAD tilsættes (valgfrit) til prøven, hvis levedygtigheden ønskes målt. Som en intern referencepopulation tilsættes der fluorescente kontroltælleperler (CytoCount ) til prøven. Under analysen kan den totale koncentration af CD34+ celler i prøven bestemmes ved at dividere antallet af CD34-events med antallet af fluorescente perle-events og gange værdien med perlekoncentrationen i CytoCount. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 3/13

4 Princippet i ISHAGE-retningslinjerne er at anvende en sekventiel Boolsk gating-strategi til at definere de egentlige progenitorceller med et regenerativt potentiale. Dette opnås ved at kontrastfarve CD34+ cellerne med anti-cd45/fitc og således rense analysen for rester og ikke-specifikke events (1, 2). Denne metode gør det også muligt at skelne mellem HPC er, der udtrykker et relativt lavt niveau af CD45 på overfladen, og lymfocytter og monocytter, der udtrykker høje niveauer. Ikke maligne CD34+ hæmatopoietiske stamceller og precursorceller danner ligesom lymfocytter, monocytter og granulocytter diskrete clustere på bivarierende plot af CD45 versus sidespredning (SSC) (1, 2). Tilsætning af en kendt koncentration af referenceperler gør det muligt at beregne den totale koncentration af CD34+ celler i den oprindelige prøve til for eksempel at bestemme antallet af CD34+ celler pr. µl prøve. Udelukkelsen af døde celler fra CD34+ celletællingen er valgfri og kan opnås ved at udføre DNA-farvning med 7-AAD, der gør det muligt at skelne mellem levedygtige og ikke levedygtige celler. 7-AAD eksiteres ved 488 nm og har en maks. emission ved 660 nm. Tilsætning af 7-AAD kan specielt anbefales, hvis der analyseres leukafereseprøver, der har været opbevaret i mere end fire timer eller leukafereseprøver, der analyseres efter optøning. Reagenser Medfølgende materialer Flaske 1 Flaske 2 Monoclonal Mouse Anti-Human CD45/FITC, Clone T29/33 + Monoclonal Mouse Anti-Human CD34/RPE, Clone BIRMA-K3 1 ml, klar til brug EasyLyse 2 x 5 ml, 20 x koncentreret Erytrocytlyserende reagens, ammoniumkloridbaseret Flaske 3 Flaske 4 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 1 ml (0,01% w/v), klar til brug Til farvning for levedygtighed CytoCount 17 ml, klar til brug efter genopløsning Kontroltælleperler Nødvendige materialer, der ikke medfølger x 75 mm polystyrenrør. 2. Kalibreret pipette til 10 µl og 100 µl. 3. Blodmixer eller rotationsmixer, til opløsning af CytoCount perler. 4. Deioniseret eller destilleret vand. 5. Hvirvelmixer. 6. Volumendosator eller pipette (2 ml) til dosering af 2 ml EasyLyse. 7. PBS til fortynding af prøven, hvis nødvendigt. 8. Sheat Fluid. 9. CD34+ kontrolprøver. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 4/13

5 Klargøring af reagens 1. Fortynd den ønskede mængde EasyLyse, flaske 2, 1:19 med deioniseret vand ved stuetemperatur. Alternativt blandes indholdet af et glas (5 ml) EasyLyse med 95 ml deioniseret vand ved stuetemperatur. Vand fra vandhanen er ikke kompatibelt med lyseringsreagenset. 2. Hent flaske 4, CytoCount, fra 2 8 C lageret. S ørg for, at hætten slutter tæt for at undgå lækager, og bland godt for at sikre, at perlerne opløses helt. Undgå at bruge hvirvelmixer, da der kan opstå luftbobler, som kan mindske volumen af de pipetterede perler. Det tilrådes at anbringe perlerne på en rotationsmixer i 5 60 minutter, for at sikre at perlerne forbliver opløst, indtil der er brug for dem. Lad CytoCount reagenset få stuetemperatur, før det anvendes. Forholdsregler 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Flaske 1, antihuman CD45/FITC + antihuman CD34/RPE, indeholder materialer af animalsk oprindelse. Som ved alle produkter, der er udledt af biologisk materiale, gælder det, at produkterne skal håndteres på korrekt vis. 3. Reagenserne må ikke nedfryses, og de skal holdes væk fra direkte sollys. 4. Flaske 3, 7-AAD, er et nukleinsyrebindende farvestof. Koncentrationen af farvestoffet i opløsningen er 0,01%, og det er derfor ikke nødvendigt at mærke den med et faremærkat. Farvestoffets toksikologiske egenskaber er ikke undersøgt. 5. Koncentrationen af perler i flaske 4, CytoCount, varierer fra parti til parti. Koncentrationen af perler (C) og standarddeviationen (S) angives på flasken som antal perler pr. µl. 6. Flaske 1, 2, 3 og 4 indeholder natriumazid (NaN 3 ), et kemikalie yderst giftig i ren form. Ved produktkoncentrationer, der ikke er klassificeret som farlige kan natriumazid reagere med bly- og kobberinstallationer og skabe højeksplosive aflejringer af metalazider. Ved bortskaffelse skylles med store mængder vand til forbyggelse af aflejringer af metalazider i afløbsrør. 7. Sørg for at flaske 4, CytoCount, opbevares tæt tillukket i opret stilling for at undgå lækager. CytoCount perlerne skal opløses grundigt før brug. For kraftig blanding af CytoCount perlerne på en hvirvelmixer kan forårsage luftbobler i væsken, og dette kan mindske det forventede volumen af pipetterede CytoCount perler. Det tilrådes at blande forsigtigt (f. eks. på en rotationsmixer eller en blodprøveglasrulle). 8. Pas på ikke at miste noget af CytoCount, før det opløses, da tælling af perlerne ellers vil være ugyldig. Hvis der ved modtagelsen er lækket væske ud af flaske 4, CytoCount, må perlerne ikke anvendes. Kontakt Dako tekniske service for at få udskiftet flaske Det er yderst vigtigt, at der anvendes samme kalibrerede pipette og vådspids reverspipettering både til prøverne og til CytoCount perlerne. Det er vigtigt, at det pipetterede volumen af CytoCount perler og prøver er nøjagtigt. Volumen af antistofreagenset og lyseringsreagenset er knap så vigtig for bestemmelsen af det totale antal CD34+ celler. Det er forholdet mellem prøvens volumen og volumen af perler, der er afgørende. 10. Det anbefales at fastsætte en tærskelværdi for FL1 ( nm), da dette vil mindske risikoen for at miste CytoCount under tællingen. Pas på ikke at udelukke nogen CD34+ event ved at sætte tærskelværdien for FL1 for højt. Der henvises til afsnittet om fejlfinding. 11. Afprøvninger viser ingen overførsel mellem to forskellige prøver. Det kan dog anbefales, at vurdere hvert flowcytometer for overførselseffekt mellem prøver. For at undgå overførsel fra en prøve med høj koncentration til en prøve med en lav koncentration af CD34+ celler, kan der køres perifert blod gennem flowcytometeret mellem prøverne. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 5/13

6 12. Optimal kompensationsindstilling er afgørende, når 7-AAD anvendes som markør for døde celler, da signalet fra RPE-kanalen overlapper signalet fra 7-AAD-kanalen. I værste fald vil positive CD34 events blive udelukket, hvis de falder inden for udelukkelsesområdet for døde celler i kanalen for 7-AAD vs. sidespredning (SSC) AAD eksiteres ved 488 nm og har en maks. emission ved 660 nm (FL3 eller FL4, afhængig af instrumentet). Farvestoffet kan derfor ikke anvendes i et enkelt-lasersystem med andre fluorokromer med emissioner over 600 nm såsom PerCP eller RPE-Cy Der er rapporteret om aggregering af kontroltælleperler (4). CytoCount perler udviser et specielt lavt antal multipler (under 3%), hvilket gør det nemmere at markere perlernes område. Hvis der observeres et større antal CytoCount multipler, og der er mistanke om problemer med produktet, kontaktes Dako tekniske serviceafdeling. Opbevaring Opbevar sættet i mørke ved 2 8 C. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen på flasken. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de specificerede, skal betingelserne verificeres af brugeren. EasyLyse, flaske 2, er holdbart i 6 måneder, efter at flasken er åbnet. Efter fortynding er lyseringsreagenset holdbart i 20 dage ved 2 24 C. Opbevar alle reagenser i opret stilling. Indsamling og klargøring af prøver Indsaml perifert blod aseptisk ved venepunktur i et sterilt K 3 EDTA blodprøveglas. Hver test kræver 200 µl af blodprøven (100 µl pr. glas). Følg anvisningerne for indsamling af blodprøver, som angivet af producenten af prøveglasset. Saml prøver taget ved leukaferese i henhold til anvisningerne fra producenten af leukafereseinstrumentet. Opbevar antikoagulerede blodprøver ved stuetemperatur (20 til 25 C), indtil de skal farves. Farv perifere blodprøver inden 24 timer efter indsamlingen. Det anbefales at farve prøver taget med leukaferese, når leukafereseproduktet behandles. Udfør en tælling af hvide blodlegemer (WBC) på alle de prøver, der skal vurderes. Hvis WBC-tællingen er større end 10 7 WBC/mL, fortyndes prøven med perifert blod til ca WBC/mL. Registrer fortyndingsfaktoren med henblik på beregningen af det totale antal CD34+ celler i den oprindelige prøve. Anvend ikke præfikserede celler. Farvningsprocedure Farvning af celler og tilsætning af kontroltælleperler 1. Fortynd den oprindelige prøve med perifert blod til ca leukocytter pr. ml. Registrer fortyndingsfaktoren nøjagtigt. I de fleste til fælde vil det kun være nødvendigt at fortynde prøver taget ved leukaferese. 2. Hver prøve skal køres dobbelt. Der skal derfor markeres to prøveglas til hver prøve. 3. Pipetter 100 µl prøve i hvert prøveglas. Brug reverspipettering (se retningslinjerne for vådspids reverspipettering herunder). 4. Tilsæt 10 µl fra flaske 1 (antihuman CD45/FITC + antihuman CD34/RPE) til hvert glas, og bland på en hvirvelmixer. Inkuber glassene i 30 minutter ved 2 8 C eller i minutter ved stuetemperatur (20 25 C). 5. Tilsæt 2 ml fortyndet lyseringsreagens (flaske 2, EasyLyse fortyndet 20 x). Bland prøven på en hvirvelmixer umiddelbart efter, at lyseringsreagenset er tilsat. 6. Inkuber i mørke i 10 minutter ved stuetemperatur. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 6/13

7 7. Hvis der ønskes farvet for levedygtighed, tilsættes 10 µl fra flaske 3 (7-AAD) til hver prøve, og der blandes. Ellers fortsættes til trin 8. Inkuber i mindst 5 min. med 7-AAD, før der tælles. 8. Opløs flaske 4 (CytoCount ) på en rotationsmixer som beskrevet under Klargøring af reagens. Tilsæt 100 µl til den farvede og lyserede prøve. Pipettering af begge prøver samt CytoCount perlerne skal udføres med den samme kalibrerede pipette og ved hjælp af en vådspids reverspipetteringsteknik (4) (se retningslinjerne for vådspids reverspipettering herunder). 9. Bland perler og prøve forsigtigt på en hvirvelmixer i 3 sekunder inden tællingen for at sikre, at CytoCount perlerne er jævnt fordelt i hele prøven. 10. Prøven skal tælles inden 45 minutter efter tilsætning af lyseringsreagenset (trin 5). 11. Tæl mindst hvide blodlegeme (WBC) events, 1000 CytoCount perler og mindst 100 CD34+ celler (4). Der henvises til opstilling af tælling for CD34Count Kit. Retningslinjer for vådspids reverspipetteringsteknik Brug samme pipette til dosering af prøve og perler. Brug en ren pipettespids til hvert reagens. Hvis der anvendes samme teknik til dosering af prøve og perler, vil resultatet blive mere overensstemmende. Prøve 1. Tryk stemplet til andet stop, anbring spidsen i væsken, og sug prøven op. Tryk herefter stemplet i til første stop, og dosér prøven. Pipettespidsen indeholder nu overskydende væske. 2. Gentag dette trin, mens pipettespidsen holdes nede i prøven. 3. Pipettespidsen er nu klar til brug. Tryk stemplet til andet stop, anbring spidsen i væsken, og sug prøven op. Fjern omhyggeligt pipettespidsen fra prøven, og tør forsigtigt overskydende væske af. Sørg for ikke at røre ved hullet i spidsen, så der ved et uheld fjernes noget af prøven fra pipettespidsen. 4. Hold pipetten så lodret som muligt. Kontroller, at der ikke er luftbobler i spidsen. Hvis der er luftbobler, doseres væsken tilbage til prøven, og proceduren gentages. 5. Doser prøven til første stempelstop, der skal kunne ses restvæske i pipettespidsen, efter at væsken er doseret. Rør ikke ved prøveglassets væg, når spidsen fjernes. Perler 6. Klargør pipetten med de opløste CytoCount i flaske 4, som beskrevet her over for prøven (trin 1 3). 7. Perleopløsningen doseres, ved at pipettespidsen anbringes på prøveglassets væg i nærheden af prøvens overflade. Hvis prøveglasset og pipetten vippes lidt, vil det lette dette trin. Doser til første stempelstop, der skal kunne ses restvæske i pipettespidsen, efter at væsken er doseret. 8. Yderligere pipettering af perlerne udføres ved at anbringe pipettespidsen i flasken med CytoCount og suge mere perleopløsning op uden først at tømme restvæsken fra første pipettering ud. 9. Hvis spidsen ikke har rørt prøven, skal restvæsken tømmes ud i flasken med CytoCount. Hvis restvæsken smides ud, er der måske ikke nok reagens til 50 dobbelte test. Kvalitetskontrol Kontrolprøve Det anbefales at inkludere en positiv kontrol som kvalitetskontrol for en korrekt opsætning af CD34+ celletællingen. Deltagelse i en ekstern plan for kvalitetsbedømmelse kan stærkt anbefales. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 7/13

8 Tid som kvalitetskontrol Tiden kan bruges som en intern kvalitetskontrol for bestemmelser på enkelt-platform, da undersøgelser har vist, at antallet af talte perler i et bestemt tidsrum er ret konstant for de fleste flowcytometre. Brugeren kan derfor for hvert nyt parti af perler udlede et gennemsnitligt antalsområde ± 2 SD for et givet tidsrum. Enhver prøve med en perletælling uden for dette område er tegn på en mulig pipetteringsfejl, og prøven bør genfarves (6). Dobbelte tests Hver prøve skal testes i to eksemplarer. Forskellen mellem de opnåede værdier for de dobbelte tests må ikke overstige 15%. I modsat fald skal testen gentages. Forskellen mellem de dobbelte værdier (X og Y) beregnes således: X-Y (X+Y)/2 x 100% Dataindsamling Følg producentens anvisninger for opsætning af cytometeret til trefarvet dataindsamling. Opsætningen skal omfatte indstilling eller kontrol af fotomultiplikatorrørets spænding og instrumentets sensitivitet samt kompensation, hvis der anvendes hardwarekompensation. Opsætning til dataindsamling på FACSCalibur (Beckton Dickinson) og på Coulter XL (Beckman Coulter) flowcytometre er beskrevet af Sutherland et al. (1) og af Gratama et al. (2). Opsætning til dataindsamling for CD34Count Kit Data kan enten indsamles med hardwarekompensation, mens opsamlingen finder sted, eller de kan indsamles uden kompensation, der så vil blive anvendt under analysen af de indsamlede data. Se almindelige retningslinjer for flowcytometri vedrørende kompensationsopsætning. Følgende protokol er beregnet til både dataindsamling og analyse. 1. Opret følgende todimentionelle datavisninger (prikplot), og indstil regionerne i henhold til figurerne: Plot A: CD45 FITC vs. SSC-H (Region 1 og Region 5) Plot B: CD34 RPE vs. SSC-H (Region 2) Plot C: CD45 FITC vs. SSC-H (Region 3) Plot D: FSC-H vs. SSC-H (Region 4) Plot E: 7-AAD vs. SSC-H (Region 8) Plot F: CD45 FITC vs. CD34 RPE (Region 6 og Region 9) Plot G: Tid vs. FSC-H ledt hen på CytoCount events (Region 7) Plot H: FSC-H vs. SSC-H 2. Opret følgende gate-logik (farve er valgfri): ( ) K2370/DK/JLA/ p. 8/13

9 G7 kaldes stamceller og tilføjes i Gate logic builder en for at farve de positive CD34+ events. Farve-gating er nyttig under opsætning af dataindsamling og analyse. 3. Anvend gatene på plottene som følger Plot A: G1 Plot B: G2: Plot C: G3: Plot D: G4 Plot E: Ugatet Plot F: Ugatet Plot G: G6 Plot H: Ugatet 4. Sæt tærskelværdien på FL-1, så alle CD45-negative events udelukkes. Det anbefales at indstille tærskelværdien på FL-1, da dette mindsker risikoen for udelukkelse af CytoCount perlerne. Indstilling af tærskelværdien på FSC-parameteret kan udføres, men vær forsigtig med ikke at udelukke nogen perle-events. Der henvises til afsnittet om fejlfinding. 5. Sæt den første prøve i, og juster PMT-forstærkningen for FSC og SSC ved at se på Plot H for at sikre, at alle populationer ligger på skalaen. Sørg for at CytoCount event ene ligger over tærskelværdien, hvis der indstilles en tærskel for FSC-parameteret. 6. Juster PMT for CD45/FITC. Lymfocytpopulationen skal falde inden for den tredje dekade (Plot A). Sørg for, at ingen dæmpede CD45+ celler udelukkes. I tvivlstilfælde sænkes FL1-tærsklen, eller PMT-forstærkningen for FL1 øges. Hvis PMT-indstillingerne ændres, kan det være nødvendigt også at justere kompensationsindstillingerne. Plot A Plot B Plot C 7. Juster PMT for CD34/RPE. Størstedelen af de negative events skal falde mellem den første og den anden dekade (Plot B). 8. Juster PMT for 7-AAD. Størstedelen af de negative events skal falde indenfor den første dekade (Plot E). ( ) K2370/DK/JLA/ p. 9/13

10 9. Anvend Region 6 fra Plot F i Plot G. Hvis tærsklen er indstillet på FSC-parameteret, bruges Plot G til at kontrollere, at ingen CytoCount events er udelukket på grund af tærskelindstillingen (se Fejlfinding). Plot D Plot E Plot F 10. Det anbefales at anvende en eksklusionsgate i Plot H. Denne eksklusionsgate skal omfatte de lave SSC- og FSC-events (Region 9). Under dataindsamlingen skal events, der falder inde i denne gate, kasseres. Dette gøres ved at der anvendes et gatefilter (eksklusionsgate) for disse events eller ved at kassere events i R9 i tællevinduet. Når FSC-parameteret anvendes som tærskel, er denne eksklusionsgate ikke relevant. 11. Sørg for at gemme tiden som parameter under dataindsamlingen. Plot G Plot H Instrumentet er nu klar til dataindsamling. 12. Tæl mindst WBC events, 1000 CytoCount events og 100 CD34+ events. Det er kun muligt at indstille et stopkriterium for én af disse værdier. For lave CD34+ prøver vil 100 CD34+ events være stopkriteriet, mens WBC events vil være stopkriteriet for høje CD34+ prøver. Det tilrådes at indsamle så mange events som muligt, da dette vil give det mest nøjagtige antal CD34+ celler. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 10/13

11 Analyse af data Brug samme protokol til analysen som til dataindsamlingen. 1. Anvend kompensationsindstillingen ved at følge softwarets anvisninger for dataindsamling udført uden hardwarekompensation. Bemærk, at kompensation for overlap fra RPE-kanalen ind i 7-AAD-kanalen er kritisk (se Forholdsregler). 2. Statistikker, der viser CD34+ progenitorcellerne, vises for Region 4 (stamceller), og for Region 7 (perler) vises antallet af perler. Der vises også statistikker for Region 1 (G2), hvis antallet af talte, levende CD45-positive celler kræves. 3. Importer filen med de indsamlede data (FCS fil), og placer regionerne. 4. I Plot D anvendes G5, og Region 4 placeres, så den kun omfatter de mindste lymfocytter (Figur 1(a)). 5. Anvend nu G4 i Plot D og hold Region 4 i samme position (Figur 1(b)). a b Figur 1. (a): Region 4 placeres, så der inkluderes både events, der er større end de mindste lymfocytter, og events med lav sidespredning. (b): Efter indstilling af Region 4 på levende lymfocytter, gates plottet på G4 for at vise de events, der opfylder de krav, som er beskrevet i ISHAGE-gatingstrategien. Resultater Beregning af det totale antal CD34+ celler pr. µl af den oprindelige prøve: Brug følgende ligning til at beregne det absolutte antal CD34+ celler: CD34+ celler/µl = Talt antal CD34+ celler (R4) x koncentrationen af CytoCount * x fortyndingsfaktoren Talt antal perler (R7) *Denne værdi (C) findes på etiketten på flaske 4: C= antallet af perler/µl. I det viste eksempel (Plot A til H), beregnes det totale antal CD34+ celler således: 216 x 1006 x 1 = 66 CD34+ celler/µl 3276 Det endelige resultat er gennemsnittet af de to prøver. Dako anbefaler, at prøven analyseres igen, hvis forskellen mellem de to værdier overstiger 15% (se Kvalitetskontrol). Værdiangivelse Koncentrationen af perler (C) og den tilsvarende standarddeviation (S) er angivet på etiketten på flaske 4 som antal /µl. Dette tal er fundet med brug af en Coulter partikeltæller Z1. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 11/13

12 Standarddeviationen af perlekoncentrationen medvirker i mindre grad til det samlede analyseresultats usikkerhed. Begrænsninger 1. Da biologiske prøver varierer meget, er det ikke sikkert, at alle prøver vil blive analyseret korrekt En erfaren flowcytometrist gennemgår alle prik-plottene kritisk. Et forkert højt resultat kan medføre, at der gives CD34+ celler i doser, der ligger under den anbefalede tærskel. 2. CD34Count Kit resultater skal fortolkes i sammenhæng med andre oplysninger, der er tilgængelige fra den kliniske vurdering, samt yderligere diagnostiske procedurer. 3. Opbevar blodprøver ved stuetemperatur (20 til 25 C). 4. Brug ikke patientprøver, der tidligere er fikseret og opbevaret. 5. Tællingen af WBC må ikke overstige 10 7 WBC/mL og CD34 celletællingen må ikke overstige 2000 celler/µl i prøven. Fejlfinding Problem Nogle perle-events mistes, fordi FSC-H parameterets tærskelværdi er indstillet for højt. Løsning Kør prøven igen med en lavere tærskelværdi på FSC-H. Det anbefales dog at indstille tærsklen på FL1- parameteret. Forkert: I FSC-H parameteren observeres ingen events under hovedperlepopulationen. Nogle CytoCount perler er udelukket under tællingen. Dele af CD34+ populationen udelukkes fordi FL1- tærsklen er sat for højt. Korrekt: Der ses events, som er mindre end hovedperlepopulationen. CytoCount perlerne er ikke udelukket. Kør prøven igen med en lavere FL1- tærskel. Kvalitetskontrolprøven er uden for området. Kontroller flowcytometeret og opstillingen af dataindsamlingen, og kør kvalitetskontrolprøven igen. Hvis kontrolprøven stadig er uden for området kontaktes instrumentets servicetekniker. ( ) K2370/DK/JLA/ p. 12/13

13 Det er vanskeligt at indstille regionerne. Forstør prikplottene, og genplacer regionen. Instrument CD34Count Kit er beregnet til brug på et flowcytometer. Flowcytometeret skal være udstyret med passende computerhardware og -software samt med en 488 nm laser. Flowcytometeret skal kunne detektere fluorescens ved følgende bølgelængder: nm (FL1), nm (FL2) og >650 nm (FL3 eller FL4, afhængig af instrumentet). Lysspredning (fremad og sidespredning) skal også kunne detekteres. Instrumentet skal kunne indstille tærsklen på enten FL1 eller parameteret for fremadspredningen. Følg anvisningerne for kvalitetskontrolopsætning, der gives af instrumentets producent. Opsætningen skal omfatte indstilling eller kontrol af PMT-spændinger, fluorescenskompensation, og instrumentets sensitivitet. Referencer 1. Sutherland DR, Keeney M, Gratama JW. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Current Protocols in Cytometry. New York: John Wiley & Sons; p Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; p Keeney M, Gratama JW, Sutherland DR. Critical role of flow cytometry in evaluating peripheral blood hematopoietic stem cell grafts. Cytometry 2004;58A: Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry 2000;42: Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother 1996;5: Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric operation: time can tell all. Cytometry 2003;52B: Symbolforklaringer Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer Medicinsk produkt til in vitro diagnostik Se brugsanvisningen Holdes væk fra direkte sollys (se under opbevaring) Indeholder tilstrækkeligt til <n> tests Anvendes senest Producent Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark/ Danemark/ Dänemark Tlf Fax ( ) K2370/DK/JLA/ p. 13/13