EdvoKit 204: ADSKILLELSE AF DNA og RNA. Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA

Transkript

1 EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA EdvoKit 204: ADSKILLELSE AF DNA og RNA Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA Hele kittet opbevares i køleskab Oversat og bearbejdet af Birgit Sandermann Justesen, Nærum Gymnasium, september

2 EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA Opbevaring: Alle kittets dele opbevares i køleskab. Formål med forsøget At introducere søjlekromatografi som en metode til at adskille RNA og DNA på bagrund af molekylernes størrelse og form Indhold i kittet A B C LyphoSample (frysetørret prøve indeholdende RNA, DNA og farve) Dry Matrix Koncentreret elueringsbuffer 10x Gel Loading Solution Practice Gel Loading Solution UltraSpec- Agarose 50x elektroforesebuffer (TAE) FlashBlue farve Kromatografisøjler 1 ml pipette Transferpipetter Mikrocentrifugerør Nødvendigt udstyr Elektroforeseudstyr til vandret elektroforese Strømforsyning til elektroforeseapparaterne Lysbord Mikropipetter med tilhørende spidser 6 holdere/stativudstyr til søjlerne 6 x5 ml eller 10 ml pipetter ml målebægre 6 bægerglas e.l. (25 ml) 12 bægerglas til søjleelueringsvæsken og buffer Demineraliseret vand 2

3 Separation of RNA and DNA by Gel Filtration Chromatography EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA Gel og filtration DNA chromatography (sometimes referred to a chromatography) is a method that separates molecu their size and shape. The separation of the componen Quick Reference: mixture frequently, but not always, correlates with weights. In these cases, gel filtration can be used as an a to determine the molecular weight of an uncharacte Gel filtration is an important preparative technique s Reservoir chromatographic step in the purification of proteins, filled with and nucleic acids. Reservoir/tragt fyldt med buffer buffer Pakket materiale - matrix Membran Eluant spout of Elueringsmund(tud) på søjlen column Spids til at lukket søjlemunden Packed bed Frit med Teori Søjlekromatografi er en metode, hvor molekylerne adskilles run dry. efter Otherwise, størrelse cracks og and fissures develop and t be removed and repacked. form. Ved søjlekromatografi føres opløsningen med det eller de ønskede produkter gennem en søjle. Opløsningen kaldes den mobile The gel filtration fase og matrix consists of microscopic beads t søjlematerialet kaldes den stationære fase. Eftersom forskellige and internal stoffer channels. ikke The larger the molecule, the m bindes lige stærkt til søjlematerialet, kan man adskille for de it pågældende to pass through stoffer. the pores and penetrate the bea Metoden benyttes ofte til at adskille proteiner, polysaccarider ecules tend og to nukleinsyrer. flow around and in between the beads ume buffer between the beads is the void volume Søjlematerialet, kaldet matrix, er det, der adskiller stofferne. I bunden af søjlen, ecules tend to spend more time in the maze of chann lige inden tuden findes en lille membran eller porøs plade, the bed. der Consequently, sikrer at matrix the larger, higher molecular w forbliver i søjlen, mens elueringsbuffer og opløste stoffer are eluted kan passere. from the column before smaller molecul ecules take the faster, more direct path that involves l Når man skal benytte søjlen skal den først pakkes. Matrix opløses i en buffer og denne grød hældes forsigtigt ned i søjlen, så man ikke får bobler, men pakkes godt. Når først søjlen Duplication er pakket of this document, skal den in holdes conjunction fugtig, with use således of accompanying at søjlematerialet reagents, is permitted for classroom/labora document, or any part, may not be reproduced or distributed for any other purpose without the written consent of EDV Copyright 1987,1988,1993,1994,1995,1997, 1998, 1999, 2000, EDVOTEK, Inc., all rights reserved. ikke revner. Hvis først det sker, skal søjlen pakkes om. The basic components of the gel filtration experimen chromatography column and the elution buffer. Th material in the column that actually performs the sep stationary phase of the chromatography. The column frit and elution spout. The frit is a membrane or poro ports and retains the matrix in the column but allow solved solutes to pass. The elution buffer is the mob chromatography and flows through the matrix and ou The column, with the matrix and applied sample, is the elution buffer. This means that the molecules in carried by the flow of buffer into the matrix where th separated. The separated zones of molecules then flo umn where they are collected for analysis. Filling the chromatography column with matrix is ca Matrix that is suspended in the buffer and ready to ferred to as the slurry. The slurry is carefully poure column to minimize bubbling and turbulence. A rese buffer is connected to the column and the column is op of buffer forces the matrix down to form an even, hom The packed matrix is called the bed and the volum termed the bed volume. It is very important not to Gelfiltreringsmaterialet, matrix, består af mikroskopiske små perler med porer og kanaler. Jo større molekyler desto sværere vil de have ved at passere gennem materialet, - derimod passerer de udenom perlerne. Små molekyler derimod trænger ind i perlernes porer og kanaler. Det betyder, at store molekyler elueres først. Ud over størrelsen har molekylernes form også betydning for hvor hurtigt de passerer gel- materialet, idet de mest kompakte molekyler vil passere hurtigst. 3

4 EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA Formålet med dette forsøg er ved gelfiltreringskromatografiens hjælp at oprense plasmiddna fra en blanding, som er kontamineret med RNA. Plasmidet er et rundt DNA- molekyle med en molekylvægt på 2 millioner. RNA består af forskellige stumper af mrna, rrna og trna, som har molekylvægt indenfor og I prøven er der også to farvestoffer med forskellig molekylvægt, som vil gøre det muligt, at følge adskillelsen. Som helhed er matrix beregnet til at adskille nukleinsyrer mellem og 5 millioner. Efter kromatografien vil elueringsprodukterne blive analyseret ved hjælp af gelelektroforese. Agarose adskiller ligeledes nukleinsyrer efter deres form og størrelse. Men ved elektroforesen er man i stand til at adskille meget små mængder. I agarosegelen er der en masse små porer og molekylerne vil bevæge sig gennem disse mod den positive pol. Læs mere om søjlekromatografi i bl.a. Kim Bruun m.fl.: Grundbog i Bioteknologi 2 side 57 ff, Gyldendal 2012 Gelmaterialer Der findes en lang række søjlematerialer som har forskellige egenskaber. Søjlematerialet består grundlæggende af en matrix, et porøst fast stof, som helst ikke skal påvirke proteinets struktur. De mest brugte søjlematerialer er polysaccarider som dextran, agarose eller cellulose eller syntetiske polymerer som fx polyacrylamid (PAA) og polystyren. Man kan binde forskellige molekyler, ligander, til gelmaterialet ved elektronparbindinger, hvor- ved gelen kan binde proteiner forskelligt. Gelfiltrering: Proteinerne adskilles udelukkende ved deres størrelse. De største proteiner vandrer hurtigst gennem gelen fordi de vandrer gennem de største porer imellem søjlemateria- let. De mindre proteiner vandrer gennem de mindre porer i selve gelmaterialet. Derfor får de en længere vej gennem gelen. 4

5 Water Quality Testing III: Multiplex PCR Analysis for Water Contaminants EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA Elevvejledning Coli, Serratia, unknown #1, Materialer og udstyr and pr. unknown gruppe: #2). 1 stativ med holdere 1 søjle 12 mikrocentrifugerør 2 engangspipetter 1 bægerglas 1 5 eller 10mL pipette 1 pipettehjælper bath for DNA isolation. matrix Do not use 1 bægerglas med 5 ml 1 bægerglas med 50 ml snap-top elueringsbuffer tubes. 1 mikrocentrifugerør med 0,12 ml prøve 1 mikrocentrifugerør med 0,5 ml vand eller man aflæser selv, hvor 05 ml er på et mikrocentrifugerør Elektroforeseudstyr Module I: Isolation of DNA Work in groups of 5, with each group member working with a different water sample (Bacillus, E. WARNING! Use only screw-cap tubes when incubating in the water ISOLATION OF BACTERIAL DNA FROM FIVE CULTURES 1. Obtain one of the five different bacteria in a 1.5 ml screw-cap trifuge tube from your instructor. 2. Centrifuge for 5 minutes, at maximum speed, in a balanced m fuge to pellet the cells. 3. Remove and discard the supernatant - use care not to disturb Søjlerne pakkes After centrifugation, Sæt søjlen fast i et stativ perature isopropanol to each tube. Use a marker to draw a ci mark location of bottoms of the tubes so you can locate the DNA pellet after c Bland matrix grunding the pellet ved at røre og hvirvle Med en 5 eller 10 ml pipette pipetteres al matrix forsigtigt over i søjlen. Lad det glide roligt ned langs tragten på søjlen. 11. Carefully remove and discard all of the supernatant (avoid los Hvis flowet af matrix stopper pga. en luftboble eller the tube lignende where stoppes it was marked fyldningen. in the previous step. Der bankes på søjlen indtil luftboblen er væk og matrix atter glider. Med en 5 eller 10 ml pipette tilsættes cirka 5 ml WARNING: elueringsbuffer The DNA til pellet tragten is very small. Take care not to los Stil et tomt bægerglas under søjlen Fjerne spidsen fra søjlens munding maximum speed for 3 minutes. Lad bufferen flyde gennem søjlen i ca. 10 minutter. Matrix vil pakkes Sæt spidsen på igen Matrix er færdigt med at pakkes, når det har sat sig. Alt i alt vil der være cirka 3 ml pakket materiale. 5. Vortex or tap vigorously to resuspend the pellet. Leave on ice for 5 minutes. 8. Spin the tubes in a microcentrifuge at maximum speed for 5 m 9. Carefully transfer just the supernatant into a fresh, labeled 0. crocentrifuge tube, being careful not to disturb the pellet. (D 13. Discard the supernatant and allow the pellet to completely dr 14. Store the tubes on ice until you are ready to proceed with Mo freeze the tubes for future use. OPTIONAL STOPPING POINT Place bacterial lysate in -20 C freezer. Duplication of this document, in conjunction with use of accompanying reagents, is permitted for classroom/laboratory use only. This document, or any part, may not be reproduced or distributed for any other purpose without the written consent of EDVOTEK, Inc. Copyright 2006, 2008, 2009 EDVOTEK, Inc., all rights reserved EVT K Forsøget kan stoppes midlertidigt her. Det er vigtigt at sikre, søjlerne ikke tørrer ud. Sørg for at der er buffer i tragten og dæk søjlen medplastikfolie. Fraktionerne opsamles Mærk 6 mikrocentrifugerør med 1-6 og jeres initialer Fjern forsigtigt bufferen, der står over det pakkede materiale. Undgå at forstyrre matrix. Overfladen af det pakkede skal være tør 5

6 Work in groups of 5, ISOLATION OF BACTERIAL DNA FROM FIVE CULTURES with each group member EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk working with a different adskillelse af RNA og DNA water sample (Bacillus, E. trifuge tube from your instructor. Coli, Serratia, unknown #1, Tilsæt indholdet af and sample unknown til #2). tragten over det fuge pakkede to pellet materiale. the cells. Lad det dryppe ned langs søjlens væg Stil et bægerglas under søjlen Fjern spidsen fra søjlens munding. Materiale vil nu gå ind i det pakkede materiale. Når alt er WARNING! trængt ind sættes spidsen på igen. Use only screw-cap Tilsæt drypvis buffer tubes til tragten when incubating 0,5 in ml the water i et mikrocentrifugerør. indtil den er 5. næsten Vortex or fuld tap vigorously to resuspend the pellet. Undersøg, hvor meget Hold røret, der er mærket bath for 1, DNA under isolation. Do not use søjlen. Fjern spidsen. Lad røret fylde med 0,5 ml af det, der kommer ud af søjlen. snap-top tubes. Leave on ice for 5 minutes. Skift til rør 2 og lad dette fylde med 0,5 ml fra søjlen. Fortsæt på tilsvarende vi med rør 3-6. Efterhånden som farten deler søjlen op tilsættes mere buffer til tragten, så der hele tiden er et konstant flow. Når alle 6 rør er fyldt, sættes spidsen på igen. 1. Obtain one of the five different bacteria in a 1.5 ml screw-cap m 2. Centrifuge for 5 minutes, at maximum speed, in a balanced mic 3. Remove and discard the supernatant - use care not to disturb th 8. Spin the tubes in a microcentrifuge at maximum speed for 5 min 9. Carefully transfer just the supernatant into a fresh, labeled 0.5 m crocentrifuge tube, being careful not to disturb the pellet. (Disc After centrifugation, mark location of the pellet perature isopropanol to each tube. Use a marker to draw a circ bottoms of the tubes so you can locate the DNA pellet after cen 11. Carefully remove and discard all of the supernatant (avoid losin the tube where it was marked in the previous step. WARNING: The DNA pellet is very small. Take care not to lose i maximum speed for 3 minutes. 13. Discard the supernatant and allow the pellet to completely dry. 14. Store the tubes on ice until you are ready to proceed with Modu freeze the tubes for future use. OPTIONAL STOPPING POINT Place bacterial lysate in -20 C freezer. Forsøget kan stoppes her og de 6 fraktioner fryses indtil elektroforesen køres. Duplication of this document, in conjunction with use of accompanying reagents, is permitted for classroom/laboratory use only. This document, or any part, may not be reproduced or distributed for any other purpose without the written consent of EDVOTEK, Inc. Copyright 2006, 2008, 2009 EDVOTEK, Inc., all rights reserved EVT K Der gøres klar til elektroforesen Mulighed I: Alle fraktioner analyseres i elektroforesen Mærk 6 mikrocentrifugerør 1-6. Overfør 50µL fra hver fraktion til det tilsvarende mærkede mikrocentrifugerør Husk at skifte pipettespids mellem fraktionerne Tilsæt 5µL 10x Gel loading solution til hver prøve. Bland godt ved at knipse på rørene De 6 fraktioner er nu klar til elektroforesen 6

7 bath for DNA isolation. Do not use snap-top tubes. EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA Mulighed II: After centrifugation, Kun peak- fraktionerne mark location of analyseres i elektroforesen Mærk 2 mikrocentrifugerør the pellet med hhv. X og Y Find den fraktion der er mest blå ved at holde rørene med fraktionerne op mod en lys hvid baggrund Overfør 50µL af den mest blå fraktion til rør X WARNING: The DNA pellet is very small. Take care not to los Find den fraktion der er mest orange ved at holde rørene med fraktionerne op mod en lys hvid baggrund Skift pipettespids og overfør 50µL af den mest blå fraktion til rør Y Tilsæt 5µL 10x Gel loading solution til hver prøve. Bland godt ved at knipse på rørene Prøverne er nu klar til elektroforesen Leave on ice for 5 minutes. 8. Spin the tubes in a microcentrifuge at maximum speed for 5 m 9. Carefully transfer just the supernatant into a fresh, labeled 0. crocentrifuge tube, being careful not to disturb the pellet. (D perature isopropanol to each tube. Use a marker to draw a ci bottoms of the tubes so you can locate the DNA pellet after c 11. Carefully remove and discard all of the supernatant (avoid los the tube where it was marked in the previous step. maximum speed for 3 minutes. 13. Discard the supernatant and allow the pellet to completely dr 14. Store the tubes on ice until you are ready to proceed with Mo freeze the tubes for future use. OPTIONAL STOPPING POINT Place bacterial lysate in -20 C freezer. Forsøget kan stoppes her og de klargjorte prøver fryses indtil elektroforesen køres. Husk at sikre at alle grupoper har mærket deres rør tydeligt. Duplication of this document, in conjunction with use of accompanying reagents, is permitted for classroom/laboratory use only. This document, or any part, may not be reproduced or distributed for any other purpose without the written consent of EDVOTEK, Inc. Copyright 2006, 2008, 2009 EDVOTEK, Inc., all rights reserved EVT K Elektroforese og tolkning Støbning af geler: Forsegl enderne af gel- holderen enten med de tilhørende dele eller med malertape. Vær sikker på at tapen er tæt og glat. Sørg for at gel- holderen står vandret. Sæt kammen i ca. 2cm fra den ene ende. Beregn hvor meget agaroseopløsning der skal bruges - bemærk gelen skal være så tyk, at kammen når ca. 1 mm ned i gelen. Fremstil en 1 % agaroseopløsningen ved at afvejen fx 0,5g agarose i 50 ml elektroforesebuffer*. Opvarm i mikrobølgeovnen - ca. 1/2 minut ad gangen indtil væsken er helt klar (og koger) Lad væsken afkøle til ca. 60 C dvs. så det er muligt at holde på flasken Hæld den varme gel op og lad den størkne i ca. 20 minutter. Fjern forsigtigt kammen fra gelen ved at vippe den frem og tilbage, mens den løftes lodret op. Fjern støbeenderne/tapen. Sæt gel- holderen med gelen i elektroforesekarret. Elektroforesen startes Fyld elektroforesebuffer i karret Load prøverne sørg for at brøndene fyldes helt op - dvs. load ca. 30 µl Noter hvad der er i hvilken brønd! Start elektroforesen og kør fx 55 minutter ved 125V 7

8 D 16 EDVO-Kit # 204: Separation of RNA and DNA by Gel Filtration Chromatography EdvoKit nr. 204: Søjlekromatografisk adskillelse af RNA og DNA EDVOTEK The Biotechnology Når elektroforesen Education er færdig Company slukkes strømforsyningen og ledningerne tages ud. Flyt gelen fra elektroforesekarret til et lille kar til farvning (evt 14x14 cm vejebåd). Gelen dækkes med ca. 75 ml 1xFLashBlue farve. Hæld mere farve i, hvis Staining gelen ikke & er Visualization helt dækket of DNA EDVOTEK Series 100 electrophoresis experiments no proprietary staining method for staining DNA separ gels. Based on state-of-the-art technology, DNA Blu safe, quick, and minimizes the mess of conventional DN Brug handsker WEAR og sikkerhedsbriller SAFETY GOGGLES ved farvningen blue stains. AND GLOVES Staining with DNA Blue InstaStain Farvning med FlashBlue og tolkning: Lad gelen stå i 5 minutter i FlashBlue farven. Advantages of DNA Blue InstaStain buffer. Flyt gelen til et nyt lille kar (evt. 14x14 cm vejebåd) og fyld vs. godt op med destilleret/demineraliseret vand. Bevæg karret Liquid Staining jævnligt brug eventuelt vippebord. Safe and Simple to Use EXPERIMENTAL PROCEDU DNA BLUE INSTASTAIN 1. After electrophoresis is completed, place the gel on a flat surface. Moisten the gel with several drops of electrophoresis 2. Wearing gloves, place the blue side of the DNA Blue InstaStain sheet on the well-moistened gel. NE Stain DN DNA Blue In Patents P Quick 15-minute staining Lad gelen stå i 20 minutter. Mørkeblå DNA- bånd vil langsomt dukke frem i takt Uniformity med, at farven of Staining vaskes ud af gelen. 3. Firmly Skift run your fingers over the entire eventuelt skyllevand et par gange undervejs. surface of the DNA InstaStain. Minimal liquid waste Do this several times. Placer gelen på et lysbord. Analyser resultatet. Tag et billede af gelen 4. Place the gel and DNA Blue InstaStain on a piece of plastic wrap. Then put the gel casting tray and a small empty beaker on top. This will ensure that the InstaStain sheet maintains good contact with the gel surface. * Der kan benyttes TAE- buffer eller TBE- buffer. Man skal sikre sig, at der benyttes den samme buffer til gelstøbningen som til selve elektroforesen. Allow I the dette DNA kit Blue fra InstaStain to sit Edvotek benyttes TAE- buffer. for 15 minutes. Arbejdsspørgsmål: Hvorfor elueres det meste af det blå farvestof sammen med plasmiddna? Hvorfor elueres RNA efter DNA? Kom med forslag til metoder, der kan forbedre separationen af RNA og DNA Duplication of this document, in conjunction with use of accompanying reagents, is permitted for classroom/labora document, or any part, may not be reproduced or distributed for any other purpose without the written consent of EDV Copyright 1987,1988,1993,1994,1995,1997, 1998, 1999, 2000, EDVOTEK, Inc., all rights reserved. 8