Trin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid)

Transkript

1 Trin 1: Oprensning af genomisk DNA (DeoxyriboNucleicAcid) (Denne del tager ca. 3 timer, max 14 prøver) ELEVVEJLEDNING forsøgskasse nr. 1 AAU Oprensning af DNA-prøven foregår gennem fem trin, se figur 1: 1. Udtagning af prøve fra mundhulen. 2. Lysering af cellerne, dvs. spaltning af cellemembraner og kernemembraner, så DNA frigøres fra cellerne. 3. Binding af DNA til søjlematerialet i prøvekittets mikrosøjler. 4. Skylning af filteret, så rester af cellemateriale fjernes. 5. Udvaskning af DNA, så det befinder sig i opløsning. Herefter kontrolleres kvaliteten af DNA prøven vha. gelelektroforese og koncentrationen af DNA-prøven bestemmes vha. DNA standarder. DNA prøven kan nu anvendes til PCR. Figur 1. Oprensningens hovedtrin. 1

2 Klargøring af arbejdspladsen Materialer Til oprensning af genomisk DNA anvendes QIAamp DNA Investigator Kit. På gruppens arbejdsplads skal I have: Holder med følgende rør per prøve /person: Steril bomuldsvatpind 1,5 ml mikrocentrifugerør, mærket med initialer for hver person QIAamp MinElute kolonne mærket med initialer 5 ekstra opsamlingsrør mærkede med initialer 1,5 ml mikrocentrifugerør, mærket med initialer Reagenser: ATL-buffer AL-buffer Buffer AW1 Buffer AW2 Buffer ATE 100% Ethanol Figur 2. Reagenser på arbejdspladsen Redskaber og apparater: Ren saks renses mellem hver prøve /person. Mikropipetter, der kan indstilles til , μl Pipettespidser: 2x200μL og 6x1000μL per person +lidt ekstra til fejl. Stopur Vortex-mikser Handsker Fælles udstyr: Proteinase K (da der kun skal afpipetteres meget små mængder) Varmetermostat m/blok til 1,5 ml rør indstillet på 56 C Varmetermostat m/blok til 1,5 ml rør indstillet på 70 C Bordcentrifuge (8.000 og rpm) Placer jeres udstyr, så det er let at overskue og komme til. 2

3 I flere af procedurerne har det stor betydning, at I er nøjagtige med tiden. Derfor skal I før hver procedure sikre jer, at I har materialerne klar, og have stopuret klar. DNA-prøven må ikke forurenes med andet DNA, fx fra dig selv. Derfor skal I arbejde med handsker og undgå at berøre prøverørenes åbninger, pipettespidser ol. Forurenes materialerne, må det kasseres. Pipettespidser skal skiftes mellem hver prøve, så der ikke overføres DNA. Sikkerhed Mundhuleskrab kan indeholde smitstoffer, og skal derfor håndteres med handsker. De øvrige stoffer forekommer i så små mængder at der ikke er tale om nogen sikkerhedsmæssig risiko. Affaldshåndtering Al affald indsamles på arbejdspladserne, og bortskaffes med almindeligt affald. Fremgangsmåde: 1. Udtagning af DNA-prøve Første trin i en DNA-fingerprinting er at skaffe sig en ren DNA-prøve fra den ønskede person. Det kan gøres på flere måder. Den mest simple er at tage et skrab fra mundhulen med en bomuldsvatpind. Prøven vil indeholde epitelceller. Det er den metode, der er beskrevet her. I andre tilfælde fås en prøve fra far og barn (i faderskabssager), et gerningssted (blod, sekret, sæd, cigaretskod) eller måske fra arkæologisk materiale. Disse metoder er uddybet senere. Fremgangsmåde: 1. Tag en steril bomuldspind ud af holderen. Brug den til at skrabe celler af mundhulens inderside. 2. Stik vatpinden ned i mikrocentrifugerøret. Klip den af ved bomuldskanten, se figur 3. Figur 3. Udtagning af prøve og afklipning i mikrocentrifugerør 2. Lysering af cellerne i prøven For at få DNA frigjort fra cellerne skal cellemembran og kernemembran nedbrydes (lyseres). Det gøres med buffer ATL som indeholder natriumdodecylsulfat, der er et sæbestof. Herefter skal proteinerne i prøven spaltes. Nogle proteiner er bundet til DNA (bl.a. histoner) og 3

4 cellerne indeholder DNaser, som er enzymer, der vil spalte og dermed nedbryde DNA. Proteinase K, er et proteinspaltende enzym, der spalter proteiner som histoner, så DNA frigives. Endvidere nedbryder Protinase K også DNaser, så de ikke kan nedbrude DNA. Buffer AL indeholder desuden guanidinhydrochlorid, der er et salt, der ødelægger proteinerne, og herved beskytter DNA et imod at blive nedbrudt af DNaserne. AL-bufferen stopper altså også Proteinase K s virkning. Fremgangsmåde: 1. Tilsæt 400 µl Buffer ATL til hver prøve. 2. Tilsæt 20 µl proteinase K til hver prøve. 3. Vortex prøven i max. 10 sekunder. 4. Inkuber prøven ved 56 C i 60 min. Vortex prøven i 10 sekunder hvert 10. min. 5. Placer rørene i centrifugen, så der er balance, og centrifuger prøven kort. 6. Tilsæt 400 µl Buffer AL, vortex prøven i 15 sekunder og centrifuger prøven kort. 7. Inkuber prøven ved 70 C i 10 min. Vortex prøven i 10 sekunder hvert 3. min. 8. Efter endt inkubering centrifuges prøven kort. 9. Tilsæt 200 µl 100 % ethanol og vortex prøven i 15 sekunder. Centrifuger kort. Figur 4. Mikrocentrifugerør placeres så centrifugen er i balance. Husk mærkning! 3. Binding af DNA i mikrosøjler og udvaskning af DNA Væsken omkring vatpinden vil nu indeholde prøvens DNA. Næste trin er at rense væsken for cellerester. Det gøres ved at binde DNA i et filtermateriale i en mikrokolonne, og vaske den for de øvrige stoffer i prøven. Fremgangsmåde: 1. Sug lysatet (væsken med DNA) op med en pipette. Før pipettespidsen ned ved siden af vattet, og sug så meget op som muligt (7-800 μl). 2. Overfør lysatet til en QIAamp MinElute kolonne. 3. Centrifuger kolonnen ved rpm i 1 min. 4. Overfør kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gamle opsamlingsrør smides ud. 4

5 4. Skylning af søjlen Skylningen sker med to bufferopløsninger, AW1 og AW2. Buffer AW1 indeholder bl.a. et guadinium-salt, ligesom buffer AL, samt ethanol. Fremgangsmåde: 5. Tilsæt 500 µl Buffer AW1 til kolonnen. 6. Centrifuger ved rpm i 1 min. 7. Overfør kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 8. Tilsæt 700 µl Buffer AW2. Centrifuger ved rpm i 1 min. Herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 9. Tilsæt 700 µl 100 % ethanol. Centrifuger ved rpm i 1 min. Herefter overføres kolonnen til et rent opsamlingsrør. Det gl. opsamlingsrør smides ud. 10. Centrifuger ved rpm i 3 min. 11. Overfør kolonnen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Det gamle opsamlingsrør smides ud. 12. Inkuber minimum 10 min. ved stuetemperatur eller 3 min. ved 56 C. Figur 5. Mikrosøjle og opsamlingsrør 5. Udvaskning af DNA Kolonnematerialet indeholder nu prøvens DNA, oprenset. DNA skylles ud af filtermaterialet med ATE-buffer. Det gøres af to omgange. Fremgangsmåde: 13. Tilsæt 30 µl Buffer ATE til kolonnen. 14. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur. 15. Centrifuger ved rpm i 1 min. 16. Gentag trin Mikrocentrifugerøret indeholder nu DNA-prøven. Kolonnen smides ud. Læreren indsamler gruppernes bakker med mærkede mikrocentrifugerør. En tilfældig prøve udvælges som gerningsmand. Læreren tilsætter 30 µl Buffer ATE til gerningsmandens 5

6 mikrocentrifugerør, og prøven blandes med pipetten. 30 μl udtages igen og overføres til et nyt rør mærket X. En af grupperne arbejder videre med X-prøven. DNA-prøverne kan nu benyttes til agarose-gelelektroforese og koncentrationsbestemmelse efterfulgt af PCR forsøget. STOP-PUNKT! Hvis I arbejder videre næste dag kan i opbevare DNA prøverne ved 4⁰C ellers skal I fryse prøverne ned ved -20⁰C. Trin 2: Gelelektroforese af oprenset genomisk DNA. (Denne del tager ca. 2 timer) I øvelsesvejledningens trin 4 (PCR med Core Loci primere) skal der bruges en bestemt mængde genomisk DNA for hver PCR reaktion man skal lave. Derfor er det nødvendigt, at man koncentrationsbestemmer mængden af genomisk DNA i hver af de DNA prøver, man har taget. Koncentrationsbestemmelsen laves vha. UV-spektrofotometri eller en Dot-blot (se evt. øvelsesvejledning punkt 3). Første skridt i koncentrationsbestemmelsen er at lave en agarosegel og køre en gelelektroforese af det oprensede genomiske DNA. Dette gøres for at vise, at der er DNA i prøven, og at den ikke er forurenet af proteiner. Klargøring af arbejdspladsen Materialer: 1 elektroforeseapparat inkl. støbekar og kam. Der er 2 til rådighed. 1 strømforsyning til elektroforeseapparatet 70% ethanol Tape Agarose 250 ml Bluecap flaske 1xTAE buffer (fælles for alle hold). Microbølgeovn TAE stain (indeholder lav konc. af ethidiumbromid) Handsker blå nitrilhandsker DNA loading buffer DNA markør (1kb) 6

7 Oprensede DNA prøver Mikropipetter Pipettespidser UV kilde Beskyttelsesbriller Kamera Affaldshåndtering: Der er ingen restriktioner m.h.t. affaldshåndteringen i dette trin af øvelsen. Alt affald kan bortkastes i vasken og efterskylles. Sikkerhed: Ethidiumbromid er stærkt mutagen, men bruges i denne øvelse i så lav koncentration, at der ikke er nogen sikkerhedsforanstaltninger ud over brug af nitrilhandsker. UV-lys er skadeligt for øjnene. Derfor skal man bruge beskyttelsesbriller, når man ser på gelen over UV-kilden. Fremgangsmåde: A) Hvis læreren har støbt gelen, så gå til punkt C. B) Støbning af en 1 % agarose gel. Afkøl og hæld opløsningen i gelkarret Kam til brønde Færdig gel Brønde Placer flasken i mikroovnen Bland agarose og gelstøbningsbuffer i bluecap flaske Tape Figur 6: Procedure ved støbning af agarosegel. 1. Rengør et gelkar og en kam i 70 % ethanol. 2. Luk enderne af gelkaret med tape. 7

8 3. Tag en bluecap flaske og vej 1 g agarose af i flasken. 4. Tilsæt 95 ml 1xTAE buffer til bluecap flasken. 5. Kom flasken med løstsiddende låg i en microbølgeovn. Tænd for microbølgeovnen og hold øje med, hvornår opløsningen kommer i kog. 6. Når væsken er i kog tages flasken ud og tjek om agarosen er gået i opløsning. Er den ikke i opløsning varmes lidt videre. Opløsningen skal være klar. Pas på flasken er MEGET varm! 7. Tag nitrilhandsker på. 8. Tilsæt 5 ml 1xTAE+EtBr opløsning til de 95 ml opløst agarose, og bland. EtBr (Ethidium bromid) anvendes til farvning af DNA og fluorescerer i UV lys. Husk at bruge handsker (nitrilhandsker, de er blå) ved håndteringen af EtBr, da det er mutagen! 9. Lad gelopløsningen køle af i 5 min. 10. Hæld blandingen op i gelkaret (ca. 50 ml per gel). Undgå luftbobler. Kom kammen i toppen af gelen. Lad gelen størke. (20-30 min) STOP-PUNKT! Gelerne kan gemmes i en plastikpose og opbevares ved 4⁰C til næste dag eller i ca. 5 dage. C) Gelelektroforese 1. Fjern tapen og kammen og kom gelkaret over i et elektroforesekar. Brøndene fra kammen skal vende mod den negative pol (sort) i elektroforesekaret, og bunden af gelen skal vende mod den positive pol (rød) i elektroforesekaret. DNAet er negativladet og vil derfor vandre mod den positive pol. 2. Hæld 1xTAE Buffer i elektroforesekaret, så brøndene og gelen er dækket med bufferen. 3. Tilsæt 2 µl DNA loading buffer til 10 µl af hver oprenset DNA prøve. 4. Tilsæt 2 µl 1 kb DNA markør til den første brønd. 5. Tilsæt 10 µl prøve til den næste brønd osv. 6. Når DNA markøren og alle prøverne er tilsat gelen sættes gelelektroforesekarlåget på. 8

9 Figur 7: Her ses gelkarret nedsænket i elektroforesekarret indeholdende 1xTAE buffer. Der er tilsat en markør længst til højre og 2 DNA prøver og en tredje er ved at blive loaded i en brønd. 7. Strømforsyningen indstilles på 80 V og 45 min, se figur 8. Der kan evt. køres længere tid for at trække båndene ned i gelen. Figur 8: Strømforsyningspanel. 8. Tilslut strømforsyningen til gelelektroforesekaret og tryk start. 9. Efter endt elektroforese, læg gelen på en UV-kilde og tag et billede (BRUG NITRIL- HANDSKER). Husk at UV-lys er skadeligt for øjne, så brug beskyttelsesbriller eller beskyttelsesskærm. D) Tolkning af agarosegelen Ethidiumbromid binder sig til DNA. Når gelen belyses med uv-lys, vil DNA derfor vise sig som lysende bånd. Båndenes placering på gelen fortæller, hvor store DNA-fragmenterne er. Lange molekyler vandrer langsommere gennem gelmaterialet fordi de tilbageholdes af gelens 9

10 struktur, mens små molekyler vandrer længere. Derfor vil mindre DNA-fragmenter vise sig som en hale. Hvis oprensningen er lykkedes, vil man derfor kunne se et tydeligt bånd øverst, evt. med en hale. Nu skal DNA-koncentrationen bestemmes for at kunne beregne, hvor meget af ens prøve der skal bruges til PCR. Forholdet mellem DNA og proteinrester i prøven kan også bestemmes vha. absorbansmåling. Det fortæller om prøvens renhed. Figur 9: 1% agarosegel hvor der er loaded 7 oprensede genomiske DNA prøver på. I brønd 1 og 9 er der loaded 2 µl 1 kb DNA markør (Fermentas). Øverst i de 7 brønde med prøver ses et tydelig bånd, der indikerer, at der er intakt genomisk DNA i prøven. Det ses også at koncentrationerne i prøve 1-4 er betydelig højere i prøve 5-7. Hvis båndene ikke viser noget DNA overhovedet, vil man vælge ikke at lave PCR reaktioner med disse DNA prøver, da de ikke er oprenset tilstrækkeligt til, at der er nok rent genomisk DNA. STOP-PUNKT! 10

11 Trin 3: Koncentrations- og renhedsbestemmelse af DNA (Denne del tager ca. 1 time) DNA-koncentrationer kan bestemmes på to måder, vha absorbansmålinger på et UVspektrofotometer, eller, hvis dette ikke haves, vha. dot-blot. Her følger en vejledning til hver af de to metoder. Koncentrations- og renhedsbestemmelse af DNA vha. absorbansmålinger DNA koncentrationer kan meget nemt bestemmes med absorbans-målinger. Alt man har brug for er et spektrofotometer udstyret med en UV-lampe, en kvarts kuvette og en opløsning med oprenset DNA. Spektrofotometeret sender lys igennem prøven, og måler hvor meget lyset svækkes eller absorberes af prøven. Absorbansen vil være afhængig af prøvens koncentration. Spektrofotometeret kan indstilles til at måle ved forskellige bølgelængder af lys. Absorbansmålingerne foretages ved 260nm, da DNA absorberer lys kraftigst her 1 absorbansenhed (1 AU) = 50 μg/ml ren DNA. Udstyr Spektrofotometer med UV-lampe 100μl kvarts kuvette Affaldshåndtering: Der er ingen restriktioner m.h.t. affaldshåndteringen i dette trin af øvelsen. Alt affald indsamles til dagrenovation. VIGTIGT: Smid IKKE din DNA prøve ud! Sikkerhed: Ingen sikkerhedsforanstaltning ved brugen af et spektrofotometer. Fremgangsmåde 1. Tænd spektrofotmeteret og kontroller at UV-lampen er tændt 2. Indstil bølgelængden til 260nm 3. En kvartskuvette fyldes med vand og sættes i kuvetteholderen 4. Nulstil spektrofotmeteret (så absorbansen er lig nul!) 5. Kvartskuvetten fyldes med DNA prøven 6. Prøvens absorbans ved 260nm (A260) aflæses og koncentrationen udregnes efter flg. formel: 11

12 7. Ud fra koncentrationen kan man nu beregne hvor stort volumen af DNA-prøven, der skal anvendes til PCR. NB! Hvis absorbansmålingerne overstiger 1 skal prøven fortyndes med DNA vand og målingen gentages Renheden af DNA opløsningen kan også estimeres ved hjælp af absorbansmålinger ved at kigge på forholdet A260/A280. Der foretages derfor en yderligere absorbansmåling ved 280nm (A280). Ved denne bølgelængde måles nemlig mængden af proteiner. 1. Indstil bølgelængden til 280 nm 2. Nulstil absorbansen med DNA vand i kuvette 3. Fyld nu kvartskuvetten med DNA prøven 4. Prøvens absorbans ved 280nm (A260) aflæses og forholdet udregnes efter flg. formel: Et forhold mellem 1,7 og 2,0 betyder generelt at man har en prøve af høj renhed/kvalitet. Figur 10. UV-spektrum fra DNA-prøve. Spektret viser DNA-toppen ved 260 nm og en svag protein-skulder ved 280 nm. Koncentrationsbestemmelse af DNA vha. Dot-blot Et dot blot kan benyttes til at estimere koncentrationer af DNA, hvis ikke man har et UVspektrofotometer til rådighed. Her fremstilles der en standard opløsning med kendt DNA koncentration. Standardopløsningen fortyndes et antal gange, så fortyndingerne kan bruges som en koncentrationsskala. DNA-prøver og standarder blandes derefter med en farveopløsning som indeholder ethidiumbromid. Lige store dråber placeres nu under UV-lys, 12

13 så man kan se farveintensiteten. Standardfortyndingerne vil nu fungere som en koncentrationsskala og koncentrationen af prøven kan estimeres ved at finde den standard, der ligner prøven bedst. Det er nødvendigt at lave en række fortyndinger af prøven også, og derefter finde den prøve, der minder mest om tilsvarende standardopløsninger. Udstyr UV-lyskilde Farveopløsning (1μl ethidiumbromid + 10 μl DNA vand) DNA standard opløsning (20 ng DNA) Husholdningsfilm 1 μl DNA prøve Fremgangsmåde 1. Fremstil flg. fortyndinger af DNA prøven 1:5, 1:25, 1:125 i 1,5 ml rør Fortynding I (1:5): 1μl DNA prøve + 4μl DNA vand Fortynding II (1:25): 1μl fortynding I + 4μl DNA vand Fortynding III (1:125): 1ul fortynding II + 4μl DNA vand 2. Fremstil flg. fortyndinger af DNA standard opløsningen (20ng DNA) i 1,5 ml rør Fortynding A (10 ng DNA): 2μl DNA std. opl. (20 ng DNA) + 2μl DNA vand Fortynding B (5 ng DNA): 2μl fortynding A + 2μl DNA vand Fortynding A (2,5 ng DNA): 2μl fortynding B + 2μl DNA vand NB: færdige fortyndinger af standarder følger med! 3. Tilsæt 1μl farveopløsning til 4µl af hver prøveopløsning og standardopløsning 4. Pipetter 5 µl dråber på husholdningsfilm, visualiser under UV-lys og sammenlign prøver og standarder 5. Ud fra fortyndingsgraden i de to dråber regnes koncentrationen ud i den oprindelige prøve. 6. Ud fra koncentrationen i den oprindelige prøve beregnes hvor stort volumen af prøven der skal bruges til PCR. 13

14 Figur 11. Dot-blot forsøg. Det ses at intensiteten af prøve fortynding 1/25 svarer til standarden 20 ng. Det betyder at den ufortyndede prøve har følgende koncentration: 20 ng/µl * 25 = 500 ng/µl. Det betyder at prøven skal fortyndes: 5000 gange (500 ng/µl * 1 µl = 0,1 ng * V). Dvs. at 1 µl blandes med 4999 µl DNA vand. Således bliver den endelige koncentration 0,1 ng/µl. Trin 4: Opformering af DNA-molekyler ved Polymerase Chain Reaction (PCR) (Denne del varer ca. 3+3 timer) Før celler deler sig ved mitose kopieres deres kromosomer, så der er et kopi til hver dattercelle. Polymerase Chain Reaction (PCR)-metoden går i korte træk ud på at udnytte DNApolymerase, som er det enzym der kopierer DNA, til at opformere DNA-molekyler i prøven. For at DNA-polymerasen virker skal DNAet være enkelt strenget (DNA er normalt dobbeltstrenget), og der skal tilsættes nogle små stykker enkelt strenget DNA (30-40 nukleotider i størrelse også kaldet en primer) i par, som kan genkende det lange enkelt strengede DNA molekyle. DNA polymerasen kan nu kopier det DNA, der ligger i mellem de to små stykker DNA (primer sættet). Det gøres gennem en række cyklusser, hvor prøvens DNA-molekyler kopieres for hver cyklus. Antallet af DNA-molekyler fordobles altså for hver cyklus, og i løbet af relativt kort tid har vi et stort antal kopier af den ønskede DNA-sekvens. Når vi skal lave et genetisk fingeraftryk på baggrund af genomisk DNA, som jo er en meget omfattende blanding af al DNA i cellen, skal vi kun lave kopier af de bestemte sekvenser på genomet, som varierer i længde mellem forskellige mennesker og befolkningsgrupper, de korte tandemrepeats (STR). De er fordelt på de forskellige kromosomer. DNA-polymerase sætter nukleotider på DNA-strengen ud fra baseparringsprincippet, men sætter dem kun på i forlængelse af nukleotider som allerede sidder på strengen, se figur 12. Derfor tilsætter man primere. En primer er en enkeltstrenget DNA-sekvens, som man ved 14

15 passer med en sekvens før et kendt STR. Dvs. at primeren bindes til DNA lige før STR en, og DNA-polymerase kopierer netop den ønskede STR. For at måle længden af STR en tilsættes der også en anden primer, som passer med DNAsekvensen på den anden side af STR en, men i den modsatte retning. Resultatet er at vi får kopieret kopien, så det netop er STR en der er med. En cyklus består grundlæggende af tre processer: Først opvarmes prøven til 90 C, så DNAmolekylerne adskilles i hydrogenbindingerne (denaturering). Resultatet er enkeltstrenget DNA. Herefter sænkes temperaturen til 60 C så primerne kan bindes til modsvarende sekvenser på de enkeltstrengede DNA-molekyler (annealing). Cyklen færdiggøres ved at hæve temperaturen til 70 C og DNA-polymerase sætter modsvarende nukleotider (dntp er) på enkeltstrengene i forlængelse af primerne (extension eller elongation). Cyklussen gentages, alt afhængigt af hvor mange kopier der ønskes. Figur 12. Polymerase Chain Reaction (PCR). Klargøring af arbejdspladsen Materialer: Genomisk DNA fra oprensningen. Primer Mix der er 10 forskellige Primer Mix. Der laves en prøveserie med hvert mix. 15

16 Reaktionsmix som indeholder (tallene i parentes er mængderne der blandes til 12 grupper): o DNA H2O o DreamTaq Buffer o dntp mix (25 mm) o MgCl2 (25 mm) o Dream Taq Polymerase Apparatur PCR-maskine /Termocykler Mikropipetter 6 PCR-rør per person 12 PCR-rør til positive og negative kontroller Affaldshåndtering: Der er ingen restriktioner m.h.t. affaldshåndteringen i dette trin af øvelsen. Alt affald kan bortkastes på almindelig vis. Sikkerhed: Undgå at få reagenserne i øjne. Hvis reagenser fås i øjnene skyldes med rigeligt vand. Brug handsker så prøver og reagenser ikke forurenes.. Fremgangsmåde: 1. Start med at tænde PCR maskinen (MyCycler), ved at holde standby knappen nede, se figur Vælg Protocol Library (F1). 3. Vælg følgende program: DNA Fingerprint. Temperatur Tid Cyklusser 95 C 11 min 1 96 C 2 min 94 C 1 min 60 C 1 min C 1,5 min 90 C 1 min 60 C 1 min 22 16

17 70 C 1,5 min 60 C 30 min 1 4 C Pause 1. Tryk enter. 2. Tryk enter igen. 3. Brug pile-tasterne: a. Mode = Algorithmic Measurement b. Sample volume = 25 µl c. Hot Start = NO 4. Tryk begin run (F5). 5. Tryk Pause run (F1) og gør dine PCR prøver klar. Figur 13. MyCycler PCR-maskine og display. Der skal bruges 0,5-1 ng genomisk DNA per reaktion. For at beregne, hvor meget prøve du skal tilsætte, skal du derfor bruge koncentrationsberegningen. Fortynd prøven med DNA H2O således at 10 µl fortyndet prøve indeholder 0,5-1 ng genomisk DNA. Figur 14. Klargøring af prøver. 17

18 Prøverne kan forberedes i rør eller i en PCR plade som vist på figur 14, se Lærevejledning for placering af prøver i en PCR plade. En PCR plade er nemmere at håndtere. Men med PCRrørene kan forsøget nemmere opdeles i grupper. Hvis PCR pladen anvendes er det en fordel at 10 µl prøve tilsættes hver brønd, og at læren laver et fælles standard mix (6 i alt med de forskellige primersæt). Se PCR pladeskema i lærervejledningen. Klargøring af prøver Gør 6 PCR rør/person klar eller 1 PCR plade/klasse (se PCR plade skema). Skriv på låget så du kan kende forskel på dine prøver eller brug PCR plade skemaet. Der anvendes 1 rør til en negativ kontrol prøve (10 µl DNA H2O anvendes som template) og et rør til en positiv kontrol prøve (10 µl Positiv kontrol anvendes som template). Person A navngiver sine rør: A1, A2, A3 A6 Person B navngiver sine rør: B1, B2, B3 B6 Der kan i alt laves 6 positive (Pos) og 6 negativ prøver (Neg). Fordel disse på grupperne. Den positive prøve er en test for at ens PCR reaktions mix virker, den negative prøve er en test for at ens PCR reaktions mix ikke er forurenet. Brug et af de 6 primer mix til disse prøver. 1. Sæt PCR rørerne eller PCR pladen på is. 2. Tilsæt 10 µl genomisk DNA (samlet DNA koncentration 0,5-1 ng) til hvert rør Max 6 rør per person (Max 14 personer) 3. Tilsæt 2,5 µl primer mix (20 µm) Der er i alt 6 forskellige primer sæt (fx FGA, TH01, D2, D3, D16 og AMEL, det kan variere). 1 primer sæt per rør. Husk at noter hvilket primer sæt, der kommes i hvilket rør! MEGET VIGTIGT: Skift pipette spids HVER GANG, så primer og prøver ikke forurenes eller bliver blandet med hinanden!!! 4. Bland følgende PCR reaktionsmix på is og i den givne rækkefølge: Per reaktion x10 reaktioner 6,2 µl DNA H2O 62 µl 2,5 µl DreamTaq Buffer (5x) 25 µl 1 µl dntp mix (25 mm) 10 µl 2 µl MgCl2 (25 mm) 20 µl 0,8 µl Dream Taq Polymerase 8 µl 5. Tilsæt 12,5 µl PCR reaktionsmix til hvert rør/pcr plade brønd. O.B.S. Det er vigtigt at følge denne procedure. Man kunne være fristet til at at blande alle reagenser i reaktionsmixet UNDTAGEN Dream Taq Polymerasen og efterfølgende putte 18

19 enzymet i hvert PCR rør, men da enzymet er meget viskøst vil der herved være for lidt enzym til rådighed. Bland derfor enzymet med i reaktionsmixet Når ALLE prøver er klar: Tag din isbakke med prøver hen til PCR maskinen. 8. Sæt hurtigt dine prøver i og luk PCR maskinen. a. Hvis I har blandet i individuelle PCR-rør, så organiser rørerne i den grønne PCRrør-holder. Denne kan sættes direkte i PCR-maskine. Det er vigtig at prøverne ikke står og lumrer i PCR-maskinen, fordi alle prøverne ikke er klar! 9. Tryk Resume Run (F1). 10. Tjek at PCR programmet kører ved at tiden på 11 min tæller ned. PCR programmet varer ca. 3 timer. Kan efterlades til næste dag. Herefter kan PCR-prøverne opbevares ved 4 C. Hvis prøverne ikke skal bruges indenfor 2 dage kan de fryses ned ved -20 C. STOP-PUNKT! Trin 5: Fremstilling af genetisk fingeraftryk ved Polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE). (Denne del varer ca. 3 timer) Med polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) kan man adskille DNA-strenge af forskellig størrelse og ladning. Afhængigt af kombinationen af spænding og tid, kan man adskille dem, selvom der kun er ganske små forskelle. Prøverne fra de forskellige personer tilsættes gelens brønde. Herefter tilsluttes spændingen, og de negative DNA-molekyler vandrer mod +polen. Små segmenter vandrer længere end store. Resultatet er at prøverne fra de forskellige personer kan sammenlignes. Har de et bånd, vil de være homozygote. Dvs. at de har fået samme STR fra begge forældre. Er der to bånd er de heterozygote. Vandringsafstanden vil også vise om det er de samme STR er der går igen hos personerne. Dette uddybes i trin 6. I brønd 1 (og evt. i sidste brønd) tilsættes en markør. Markøren er en blanding af DNAmolekyler hvor man kender længderne. I dette tilfælde er der 50 bp s forskel mellem dem. De vil derfor kunne fungere som en slags lineal, som man kan sammenligne med prøverne. På den måde kan DNA molekylernes længde bestemmes og sammenlignes med de kendte STR er. Dette uddybes i Trin 7. 19

20 Der laves en gel for hver primersæt. På den måde kan man med større sikkerhed identificere, hvilke prøver der er identiske. Klargøring af arbejdspladsen Materialer: 6 stk. Færdigstøbte Criterion 10% TBE geler 6x DNA loadingbuffer 25 bp DNA markør Pipettespidser Gelloading-spidser PCR plade (Anvendes til at blande ens prøve med loading buffer) Handsker (Nitril) 1x TBE stain (TBE buffer med ethidium bromid) Apparatur: 3 Criterion elektroforeseapparater inkl. 1 strømforsyning til elektroforeseapparateterne Mikropipetter UV kilde Beskyttelsesbriller Kamera Affaldshåndtering: Der er ingen restriktioner m.h.t. affaldshåndteringen i dette trin af øvelsen. Alt affald kan bortkastes i vasken og efterskylles. Sikkerhed: Ethidiumbromid er stærkt mutagen, men bruges i denne øvelse i så lav koncentration, at der ikke er nogen sikkerhedsforanstaltninger ud over brug af nitrilhandsker. UV-lys er skadeligt for øjnene. Derfor skal man bruge beskyttelsesbriller, når man ser på gelen over UV-kilden. Fremgangsmåde: A) Hvis ikke færdigstøbte geler anvendes, se lærervejledningen. B) Påsætning af prøve 20

21 Alle PCR prøverne (se gelloadingsforslag i lærervejledningen) amplificeret med den samme primer skal tilsættes på den samme gel. Noter på et papir, hvilke prøver der fyldes på hvilke geler og brønde! 1. Pak gelerne ud og fjern den grønne kam i toppen og tapen i bunden af gelen. Gem emballagen som gelen ligger i. 2. Skyl gelerne i 1xTBE buffer. Hæld evt. bufferen ud af emballagen og skyl med 1xTBE buffer en enkelt gang. Kom 1xTBE buffer i emballagen og skyl gelen heri. 3. Kom gelerne (1-2 stk) i hvert Criterion elektroforesekar, se figur 15. Figur 15. Indsættelse af geler i Criterion gelkar. 4. Hæld 1xTBE Buffer i det øverste bufferkar. Der bruges ca. 60 ml. 5. Hæld 1xTBE Buffer i det nederste bufferkar optil FILL. 6. Tag 10 µl PCR prøve og tilsæt 4 µl DNA loading buffer, se figur 16. Brug låget på et eppendorf rør eller en PCR plade til at blande prøverne i. Et rør/pcr plade brønd per prøve. 21

22 Figur 16. Tilsætning af 6x DNA loadingbuffer og tilsætning af prøver til gel. Prøverne er blandet i en PCR-plade og gelloadingsspidser anvendes. 7. Tilsæt 4 µl 50 bp DNA markør til den første brønd, se forslag til gelloading. 8. Tilsæt 13 µl prøve til den næste brønd osv. Brug gelloadingsspidser, se figur 16. Alle PCR prøverne (max 14 prøver) amplificeret med den samme primer skal tilsættes på den samme gel, se forslag til gelloading. C) Gelelektroforese 1. Når DNA markøren og alle prøverne er tilsat gelen sættes gelelektroforese-låget på, se figur 15. VIGTIGT: Det røde han-stik skal sættes ind i det røde hun-stik! 2. Tilslut strømforsyningen til gelelektroforesekaret. VIGTIGT: Det røde han-stik skal sættes ind i det røde hun-stik! 3. Strømforsyningen indstilles på 100 V i 10 min, brug Display mode key, se figur 17. Tjek at volt (V) er konstant, se figur 2 (Constant parameter key skal lyse over V). Figur 17: Strømforsyningspanel. 4. Herefter indstilles strømforsyningen på 200 V i 60 min, brug Display mode key, se figur

23 5. Efter endt elektroforese fjernes gelen fra gelkassetten. Brug gelelektroforese-låget og tryk gelkassetten nedover som vist i figur 18. Figur 18: Gelelektroforese-låget anvendes til at åbne gelkassetten med. Tryk gelkassetten nedover låget for at frigøre gelen efter endt elektroforese. D) Farvning af gel med ethidiumbromid 1. Gelerne farves i en opløsning bestående af 50 ml 1xTBE Buffer og 5 µl EtBr (TBE Stain). Blandingen kan bruges til farvning af flere geler! Husk at bruge handsker (nitrilhandsker) ved håndteringen af EtBr, da det er mutagen! 2. Kom gelen i emballagen eller plastikkar og hæld opløsningen over den, se figur 19. Lad gelen trække i 3 min. 3. Læg gelen på en UV-kilde og tag et billede. Husk at UV-lys er skadeligt for øjne, så brug beskyttelsesbriller eller beskyttelsesskærm. Figur 19. Aftagning af gel og overførsel til farvning i plastikkar. 23

24 Trin 6. Hvem var gerningsmanden: tolkning af PAGE-gel Sammenlign båndene på gelen. Hvem matcher gerningsmanden? 24