!! Test%dit%eget!DNA$med$PCR! Forsøgsvejledning0. Navn:0. Side!1!af!8!

Transkript

1 Test%dit%egetDNA$med$PCR Forsøgsvejledning0 Navn:0 0 Side1af8

2 Formålmedforsøget Formåletmeddetteforsøgeratundersøgejeresarvemateriale(DNA)forettransposonkaldetAlu.Et transposonerendnasekvens,derkan hoppe rundtivoresgenom.viskalidetteforsøgundersøgealu sekvenserpåkromosom16ivoresgenom(dethumanegenom),omderhererindsatenalusekvenspå entenetellerbeggesitesikromosom16hoshverenkeltafjer. MankanafgøreomdererindsatenAlusekvenspåkromosom16vedatamplificeredenregionAlu sekvensenindsættesi.herskaliundersøgeetbestemtlocuskaldetpv92.foratfånetopdennespecifikke regionamplificeretbrugesteknikkenpcr(polymerasechainreaction).herefterkanstørrelsenafdet amplificeredednavisualiseresmedgelelektroforese. Alusekvenserharenstørrelsepå300basepar.DetvidesdesudenatlocusPV92harenstørrelsepå415 baseparudenalusekvensen.detbetyder,athvismanharindsatenalusekvenspåbeggesinekromosom 16(manerhomozygotfordengenotype)vildervisesigétkraftigtbåndvedenafstandsvarendetilen størrelsepå =715bp.ermanderimodheterozygot(harkunensekvensindsatpådetene kromosom,menikkedetandet)vilderfremkommetobåndpågelen:etved415bpogetved715bp.har mantilgengældsletikkeindsatnogenalusekvens,vildervisesigétbåndsvarendetilstørrelsen415bp. Side2af8

3 Del1 Udtagningafmenneskeligeceller Fremgangsmåde0 Følgendeudføresafalle: 1. 10mLsaltvandtagesimundenogderblandesgrundigtrundti30sekunder. 2. Saltvand(+celler)spyttesudietpapkrusogdenne svinges rundtforatblandecellerne. 3. Automatpipettenindstillestil1000µL(1mL)ogdersugesdetteopogputtesieteppendorfrørmed talpå.talletbrugespåjeresrørrestenafdagen,såhuskdet. Nåralleharafgivetencelleprøve,passerIgodtpåjereseppendorfrørmedcellerogbegiverjeropi laboratoriet. Materialer0og0reagenser0 Papkrus 10mL0,9%NaClopløsning(isotonisksaltvand)i rør,étpr.elev Del2.1IsoleringafDNA 1x2mLeppendorfrørpr.elev 2xautomatpipetter(1000µL)m.sterilepipettespidser Fremgangsmåde0 1. JeresEppendorfrørmed1mLcellematerialecentrifugeresien centrifugei1minutvedmaxrotation(ca12.000rpm).obshuskat centrifugenskalværebalanceret.spørgundervisernehvordan. 2. Supernatanten(væsken sebillede)sugesopmedenpipetteogsmides iaffaldsbøtten paspåatpelletten(hvidklumpibundenafrøret se billede)ikkerygermedud. 3. Tilsæt30µL0,9%NaCl,ogresuspendércellerne(Brugwhirlmixerenpå jeresbord). 4. Rystrøretmedchelex,sådesmå perler blandesmedvæsken. 5. Tilsæt100µLchelexopløsningmeden10000µL0pipette. 6. Eppendorfrøretplaceresien99 Cvarmebloki10minutter. 7. MensiventerblandesMasterMix(Del2.2 KUNpunkt1). 8. Efter10minuttertagesrøretopogstillespåistildeterkøletaf(ca.1min.). 9. Rystrøretgrundigtogcentrifugerdeticentrifugenvedmaxrotation(ca rpmi1min). 10. Overfør30µLsupernatant(væske)tiletnyteppendorfrør.OBSDermåikkekommenogetaf bundfaldetellerkuglernemedover)ogmarkertydeligtmedjerestal.irøreneharijeresdna Materialerogreagenser 1xEppendorfrørmedDNA(spytprøve)pr.elev (frabiotéket) 1xEppendorfrørmed500µL0,9%NaClopløsning (isotonisksaltvand)pr.hold 1xEppendorfrørmed400µLChelexkopløsningpr. hold 1x1,5mLEppendorfrørpr.elev Side3af8

4 Del2.2 klargøringafprøvetilpcr Fremgangsmåde 1. Ietnyttomt0eppendorfrør(evt.markeretMasterMix)blandesfølgende: 66µLMilliQ 40µLPrimermix 16µLdNTP 32µLGCkbuffer(pipettérforsigtigt,dadenkanskumme) 8µLDMSO 3µLMgCl 2 2µLpfux7DNApolymerase(henthosundervisnerne) Blandingenernoktilhelegruppendvs.tilallejeres3DNAprøver. 2. Blandindholdetforsigtigtvedatsugeopognedetpargangemeden100µLpipetteindstillettil30 µl.mastermixenfordelesudi3pcrkrør.derskal39µlihvertrør. 3. Hereftertilsættes1µLafjeresDNAtiljeresegetPCRrørmedMasterMix. 4. RørenesættesnuiPCRkmaskinenved4 C.PCRkprogrammetsættesigangafunderviserne. OBSHuskatskrivejeresnummerpåPCRkrørene TildetteforsøgbrugesfølgendePCRkprogram: I. 98 C2:00Prekdenaturering(vigtigstvedanvendelseafstoretemplates eksempelvis genomiskdna) II. 94 C0:30Denaturering III C0:30Primerannealing(k1 C/cyklus) Punkt0IILIV0gentages0i0100runder0 IV. 72 C1:00DNAsyntetisering V. 94 C0:30Denaturering VI. 700 C0:30Primerannealing Punkt0VLVII0gentages0i0200runder0 VII. 72 C1:00DNAsyntetisering VIII. 72 C5:00DNAsynteseafalresterendeDNA IX. 4 C Opbevaringafreaktionenindtilafhentningimaskinen 5. EfterPCRrøreneersatiPCRmaskinen,kontaktunderviserneomstøbningafagarosegeler. Materialerogreagenser 1xEppendorfrørmed100µLMilliQH 2 0(sterilt vand)pr.hold 1xEppendorfrørmed45µLPrimermix715(Der står PM715 pårøret,indeholderbådeforward ogreverseprimer)pr.hold 1xEppendorfrørmed20µLdNTP(2mMafhver nukleotid datp,dctp,dgtpogdttp)pr.hold 1Eppendorfrørmed40µLGCkbufferpr.hold DNApolymerase Side4af8

5 Del3 Støbningafgeltilgelelektroforese Da#der#kun#er#10#brønde#i#hver#gel#skal#der#som#udgangspunkt#støbes#4#geler.#Underviserne#udpeger#de# grupper#der#står#for#dette.# Fremgangsmåde 1. Tilsætde50mLTAEbuffertilglassenemed0,4gagaroseogopløsagarosenimikrobølgeovnenved 620W(dettagerca.1k2minutter).Alagaroseeropløstnårblandingenerheltklar# #Husk#at#løsne#låget#på#flasken#og#at#flasken#bliver#meget#varm#Brug# grydelapperne,##som#i# finder#ved#siden#af#mikroovnen,#til#at#holde#på#flasken.# 2. Nårdetheleersmeltetafkølesvæskentilca.60 C(tilmankanholdepåflaskenudenatbrænde sig) 3. Tilsæt5µLSYBRksafe,somhentesoppevedfællesbordet Husk#handsker 4. Nuhældesblandingenopienafstøbeformene,hvorkammenersati,såderkandannesbrøndei gelen. 5. Gelernestillestilafkølingimindst20minutter. Dagens(program(fortsætter(i(Bioteket,(mens(vi(venter(på(PCR9reaktionerne.(( Materialerogreagenser 0,4gAgarose(erafmåltogfindespåfællesbordeti 250mLflaskemedblåtlåg) 50mL1XTAEbuffer(buffermedTrisEddikeog EDTA) 5µLSYBRksafe(harlæreren,dadeterlysfølsomt ogderforikkeskalståfremme) #SYBRGsafe#er#potentielt#kræftfremkaldende,#og# der#skal#derfor#bæres#handsker#i#forbindelse#med# støbning#og#håndtering#af#gelen.# Side5af8

6 Del4 Gelelektroforese Fremgangsmåde 1. FraPCRrøretoverføres15µLtiletnytPCRrør.0OBSHuskatskrivejeresnummerpåPCRkrørene 2. Dertilsættes15µLloadingbuffertildetnyePCRrør.Loadingbufferenvilfaldetilbunds,såsøgfor atblande. 3. Gelendækkesmed1XTAEbuffer(elektroforesebuffer) 4. Enundervisertilsætter6µLDNAkladdersomdemonstrationaffremgangsmådenoghjælper derefterhvergruppemedatpåsætte20µlafderesprøverm.loadingbuffertilhversinbrønd. #Når#I#afsætter#prøven,#så#stik#ikke#pipettespidsen#helt#ned#i#gelen,#men#lad#den# svæve #i#brønden# (der#er#tilsat#loadingbuffer#for#at#dna et#falder#til#bunds#i#brønden).#husk#også#at#trække#pipetten# op#af#brønden#igen#inden#stemplet#slippes,#så#prøven#ikke#suges#op#igen.# 5. Gelenkøresnuved100Vog400mAi45minutter. HerkanInotereihvilkebrøndeIharpåsatdeforskelligeprøver: Brønd010 Brønd020 Brønd030 Brønd040 Brønd050 Brønd060 Brønd070 Brønd080 Brønd090 Brønd0100 Elektroforesekarnr: Materialerogreagenser Støbtgel JeresrørmedPCRkprodukt(étpr.elev) 1nytPCRrørpr.elev 30µL2XLoadingbufferpr.hold Pipette+spidser Side6af8

7 Del5 Resultatbehandling Grupperne#hørende#til#de#forskellige#geler,#kommer#til#at#tage#billede#af#gelen#på#skift#med#en#underviser.# Billedet#sammen#med# DNA#ladder #nedenfor#bruges#til#at#svare#på#følgende#spørgsmål:# 1. Hvilkengenotypetyderjeresprøverpå?Notérresultatetnedenståendeskema(1forhverthold): Navn Antalbåndogstørrelse Genotype(++,+kellerkk) 2. Erderandrebåndpågelenendveddeforventedestørrelser?Hvisja,kanIsåkommepånogengrunde tildette?(underviserevilgårundtoghørejeressvar). 100bpDNALadder(NewEnglandBiolabs) Side7af8

8 Brønde Del6 Evaluering Dumåmegetgerneevaluereøvelsennårdukommerhjempålinketwww.kortlink.dk/dtu/a4wbellergåind påvoresfacebooksidefremtidens0bioingeniører,hvorevalueringslinketliggerøverstpåsiden. Side8af8