Velkommen. Test dit eget DNA med PCR. Undervisningsdag på DTU Systembiologi. Undervisere:

Transkript

1 Velkommen Test dit eget DNA med PCR Undervisningsdag på DTU Systembiologi Undervisere:

2 Hvem er I? 2 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

3 Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil B. Adenin, Gytosin, Caranin, Thymil C. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin D. Aranin, Guamil, Catamil, Uranin 3 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

4 Hvilke baser indgår i DNA? A. Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil B. Adenin, Gytosin, Caranin, Thymil C. Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin D. Aranin, Guamil, Catamil, Uranin 4 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

5 Hvilken er den komplementære streng til denne DNA streng? 3 CTACTA 5 A. 5 CGTAAG 3 B. 5 GATGAT 3 C. 3 GATGAT 5 D. 5 TGTGCA 3 5 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

6 Hvilken er den komplementære streng til denne DNA streng? 3 CTACTA 5 A. 5 CGTAAG 3 B. 5 GATGAT 3 C. 3 GATGAT 5 D. 5 TGTGCA 3 6 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

7 Dagens program 9:00 9:30 Introduktion udtagning af celler 9:30 11:30 Vi går i lab. Start af PCR reaktion/støbning af geler 11:30 12:45 Vi går sammen til frokost og ser lidt af DTU 12:45 13:00 At studere på DTU 13:00 13:30 Loading af agarosegeler 13:30 14:30 Foredrag i Biotéket 14:30 15:00 Resultater 15:00 15:30 Evaluering og afslutning Ca. 15:30 Tak for i dag 7 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

8 Dagens øvelse Ekstrahere Amplificere Visualisere DNA 8 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

9 DNA og gener 9 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

10 Transposoner ALU transposon Cirka 300 basepar lang Findes i hver af jer gange Vi undersøger jeres kromosom 16, lokus PV DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

11 Alu transposoner hos en kvinde Grøn (probe) = Alu sekvenser Rød (TOPRO-3) = andet DNA 11 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

12 Hvorfor transposoner? Hvorfor tror I, der findes transposoner? 12 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

13 Transposoner og essentielle gener Hvad tror i der sker hvis et transposon ødelægger et essentielt gen i en celle? Brystkræft Hæmofili Alzheimer s 13 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

14 1. trin ekstraktion af cellemateriale Celler fra jer ekstraheres fra mundhulen Saltvand skylles rundt i munden (kraftigt) i 30 sek. og spyttes ud i kop 1 ml overføres til eppendorfrør med pipette og tages med i lab NaCl 14 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

15 30 sekunders nedtælling Spyt ud i koppen igen 15 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

16 Pipette indstilling 16 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

17 Ekstraktion af DNA 17 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

18 Master-Mix til 3 PCR-reaktioner 66 µl H 2 O 40 µl Primermix (PM) 16 µl dntp 32 µl GC buffer 2 µl Phusion DNA polymerase(enzym) 156 µl i alt dvs. mere end 3 gange 39 µl 18 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

19 Amplifikation af DNA 39 µl MasterMix og 1 µl DNA fra jer blandes i PCR-rør Blandingen sættes i PCR-maskinen DNA MasterMix 19 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

20 Støbning af agarosegel 0,4 g agarose 50 ml TAE-buffer Blandningen koges i microovn Flasken køles til ca. 60 ºC SYBR-Safe tilsættes (HUSK HANDSKER) Gelen hældes i kar 20 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

21 Regler i laboratoriet Brug jeres fornuft Husk at vaske hænder Bær kittel hele tiden Ingen mobil, smykker, mad og drikke Læs og forstå, hvad I skal først Spørg hvis du er i tvivl 1 Det er ikke altid bedst, at blive færdig først Ind i laboratoriet!!! 21 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

22 Hvad er DNA? DNA DeoxyRibonucleic Acid 5 Adenin - A Guanin - G Puriner Rygrad/Backbone Cytosin - C Thymin - T Pyrimidiner 3 22 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

23 Hvad er DNA? Baseparring DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

24 Hvad er DNA? Retning af DNA P i P i P i P i P i P i P i P i P i P i 24 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

25 Hvor findes DNA? Prokaryoter (Bakterier) Eukaryoter (Dyr og planter) DNA Cellekerne Cytoplasma Mitokondrion/grønkorn 25 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

26 Hvad er rækkefølgen i det centrale dogme? 1 DNA RNA 2 3 PROTEIN A. 1. Translation 2. Replikation 3. Transkription B. 1. Replikation 2. Translation 3. Transkription C. 1. Transkription 2. Replikation 3. Translation D. 1. Replikation 2. Transkription 3. Translation 26 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

27 Hvad er rækkefølgen i det centrale dogme? 1 DNA RNA 2 3 PROTEIN A. 1. Translation 2. Replikation 3. Transkription B. 1. Replikation 2. Translation 3. Transkription C. 1. Transkription 2. Replikation 3. Translation D. 1. Replikation 2. Transkription 3. Translation 27 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

28 Hvad er et gen? Et gen er den basale enhed af arvelighed i en levende organisme 28 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

29 Hvad er DNA replikation? DNA replikation er kopiering af DNA før celledeling 29 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

30 Den genetiske kode DNA 5 A T G A A A C T C T A T C C G A G T T A A 3 Transkription RNA 5 A U G A A A C U C U A U C C G A G U U A A 3 Peptid sekvens Methionin O N Lysin Leucin Tyrosin Prolin Serin N O Stop Translation (Start codon) O N N O 30 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

31 Hvad er PCR? Polymerase Chain Reaction PCR er en metode til opformering af DNA ved brug af en termostabil DNA polymerase Thermus aquaticus PCR blev opfundet af Kary Banks Mullis i 1983 Han blev tildelt Nobelprisen i kemi for sin opfindelse i DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

32 Hvad skal der bruges i en PCR? Primere DNA polymerase dntp - Nukleotider T G C T 5 G C 3 5 DNA template PCR fragment - produkt 32 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

33 Hvad laver PCR maskinen? Tid 33 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

34 Området der ønskes ampliciceret

35 Eksponentiel stigning i antal kopier 35 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

36 PCR Polymerase Chain Reaction 36 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

37 Det humane genom 23 kromosom-par Hele det haploide humane genom fylder over 3 milliarder basepar med ca gener 1.5% af DNA et koder for proteiner E. colis genom er på ca. 4.6 mio. basepar og med ca gener 37 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

38 Hvad kræver en PCR af et nyt gen? Kendte sekvenser til primere Template DNA Over organismers totale DNA (genom) findes på nettet! Find DNA et på en netdatabase, fx GenBank og bestil passende primers 40 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

39 PCR i den virkelige verden Amplicering af DNA er meget anvendt: Faderskabstest Retsmedicin Artsbestemme bakterier Gensplejsning 41 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

40 Gelelektroferese Brønde til PCR produkter DNA-ladder Størrelse i bp Agarose gel Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 42 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

41 PCR-produkter Kromosom bp Transposon 715 bp Genotype: + +, - -, DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

42 Diskuter med din sidemand Tegn på det udleverede billede hvordan båndet for de tre genotyper vil se ud. Husk: Regel 1: DNA løber fra - + Regel 2: Store DNA fragmenter løber langsommer end små DNA fragmenter Fragmentlængder: Transposon: 300bp Gen: 415bp 45 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

43 Gelelektroferese Brønde til PCR produkter DNA-ladder Størrelse i bp Agarose gel Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 46 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

44 Resultater - diskussion PCR produkter DNA-ladder Størrelse i bp Genotype bp Genotype bp Agarose gel Genotype bp bp Store DNA fragmenter bevæger sig langsommere end små fragmenter 47 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

45 Resultater M Homozygot Homozygot Heterozygot 48 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

46 Resultater og evaluering 49 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

47 Fejlkilder Ekstraktion af DNA Ingen eller for få celler intet eller for lidt template DNA Ineffektiv lysering af celler Amplifikation af gen Manglende komponenter i PCR mix - intet kan undværes Denatureret DNA polymerase ingen opformering Gelelektroforese Viskositet af gel Loading af brønde hvis ladder er fin Hvis der ses primer skyldes det formentlig mislykket PCR reaktion Manglende SybrSafe ingen visualisering 50 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

48 Hvem er morderen? 51 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet

49 Hvem er faderen? 52 DTU Systembiologi, Danmarks Tekniske Universitet