Bakteriofager og produktion af gul ost

Transkript

1 Bakteriofager og produktion af gul ost Finn K Vogensen FOOD-KU Dias

2 Agenda Hvad er bakteriofager og hvordan virker de DL-starter kulturen Pode regimer Klassifikation af bakteriofager (fager) der angriber mesofile kulturer Mejeridesign Klassiske metoder til påvisning af syrningsproblem/fager MetaPhageLAB udvikling af nye metoder Eksempler på resultater fra 3 mejerier (4 cases) PhageWarn Nyt projektforslag og dets indhold Dias 2

3 Gul ost Ost lavet med ikke-defineret starter kultur DL-kultur DL-kulturen har mange (30-00) ikke-definerede stammer der tilhører Lactococcus lactis Lactococcus lactis subsp lactis Lactococcus lactis subsp cremoris Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris Leuconostoc pseudomesenteroides Dias 3

4 Alternative cultivation steps for starter cultures Mäyrä-Mäkinen & Bigret (2004), pp 7-98 in: Salminen et al Lactic acid bacteria Dias 4

5 Bakteriofager eller kort fager, hvad er de? Bakterielle virus Angriber specifikke stammer af bakterier Findes formentlig fager mod alle bakteriearter En fagstamme har normalt snævert værtsspektrum Angriber kun -2 bakteriestammer Nogle fager har bredere værtsspektrum Ingen livscyklus unden for en vært (eller indikator) Er det en organisme? Formentlig 0 x flere fager end bakterier på jordkloden 0 30 bakterier 0 3 fager 0 23 faginfektioner per sekund på verdensplan Fager kan ikke ses i normalt lysmikroskop Dias

6 The phage life cycles Virulent phages (lytic ) Can only use lytic pathway Cannot convert into temperate phage by recombination Lytic phages Lytic pathway is used Can be converted into temperate phage by recombination Temperate phages Have the lytic and lysogenic pathway Terminology adapted from: Chopin et al (200) Nucl Acids Res 29: Be aware that the term virulent in E coli phage biology has a completely different meaning from above term for LAB phages Dias 6

7 Burst-size Department of Food Science One step growth curve for phage Latent period Period from infection until first phages are released Typically 2-80 min Rise period From latent period ends until all phages are released Burst-size The number of phages released from one infection Typically <0-400 Dias 7

8 LAB phage classification (taxonomy) All LAB phages have double stranded DNA All LAB have tails Order Caudovirales Classified into phage families based on: Morphology in electron microscopy Tail morphotype A: contractile tails Tail morphotype B: long non-contractile tails Tail morphotype C: short non-contractile tails Head morphotype : isometric heads Head morphotype 2: small prolate Head morphotype 3: large prolate LAB phage belong to the order Caudovirales and then to the families: Myoviridae Siphoviridae Podoviridae Dias 8

9 Morphotypes of LAB phages Myoviridae morphotype A L helveticus phage φ4 (Séchaud et al (992) AEM 8:0-08) Siphoviridae morphotype B Lactococcus lactis phage TP90- (Vegge et al (200) J Bacteriol 87: ) Siphoviridae morphotype B2 Lactococcus lactis phage c2 (Horst Neve, MRI-Kiel) Podoviridae morphotype C2 Lactococcus lactis phage P034 (Deveau et al (2006) AEM 72: ) Podoviridae morphotype C3 Lactococcus lactis phage KSY (Deveau et al (2006) AEM 72: ) Dias 9

10 Laktokok fagerarter 0 arter i øjeblikket: 936 arten hyppigst fundet Har temperate medlemmer P33 arten næst hyppigst c2 arten 3 hyppigst 936, P33 og c2 arterne udgør mere end 9 % af alle fund af laktokokfager i forbindelse med mesofile kulturer Dias 0 Deveau et al (2006) AEM 72:

11 Leuconostoc fager fra mejerimiljøet Tilpasset fra: Ali et al (203) Appl Environ Microbiol 79, Dias

12 The ideal dairy from an anti-phage point of view High infection risk areas Cheese ripening and packaging Whey storage High phage titer area Wind direction HEPA Bulk starte r room HEPA Cheese vats HEPA Pressing and salting Whey treatment HEPA Raw milk treatment Raw milk storage Raw milk arrival Dias 2

13 Activity test % starter % starter % whey % starter % heat treated whey Constant temperature Cheese making temperature profile Incubate Measure ph ΔpH<00 ΔpH<00 ΔpH<00 Inoculation controls ΔpH<00 ΔpH>00 ΔpH<00 ΔpH>00 No phage inhibition Phage inhibition Other inhibitor ΔpH>00 Dias 3

14 DL-kulturen og fagfølsomhed Undersøgelser har vist: Ikke-definerede starterkulturer kan være rubuste over for bakteriofag (fag) angreb i lang tid på mejerier Hvis hygiejne og design er i orden opleves der længe ikke ikke syrningsproblemer, selv om de fleste bakterieisolater fra anvendt ikke-definerede kultur er følsomme over for fager, men pludselig går det galt! E Wagner Nielsen (998) Int Dairy J 8: Kleppen et al (20) Int Dairy J 2: Syrningstest giver sjældent advarsel om problemer i tide Syrningstesten er ikke kvantitativ Selv om syrningen ikke påvirkes af fagangreb kan produktkvalitet påvirkes Ændret hulsætning i ost Ændringer i smagsudvikling i ost og fermenterede produkter Dias 4

15 Eksempel på fagfølsomhed af 96 isolater fra DLkultur, hvor hele kulturen ikke viser fagfølsomhed High-throughput syrningsaktivitet på feks 96 bakterieisolater fra ikke-definerede kultur Department of Food Science Dias

16 Receptor Bindings Proteiner (RBP) RBP sidder i enden af fagens hale RBP binder til overfladen af bakterien RBP sekvens varierer mellem fagstammer og bestemmer hvilken bakteriestamme der angribes Sammenhold RBP sekvens med Host-range Hvis vi kender RBP sekvens ved vi også hvilke bakterie stammer der angribes Generne der koder for RBP er identificeret i 936, P33, c2 og leuconostoc fager (IFV-KU og Chr Hansen) Dias 6 Model af TP90- (P33 fag) Figur fra: Bebeacua et al (203) J Virol 87,

17 Receptor bindingsprotein (RBP) fra fagstammer tilhørende 936 fagarten: Host-range vs gensekvens Department of Food Science Dupont et al (200) J Appl Microbiol 98, Dias 7

18 RBP status Pt identificeret forskellige RBP typer blandt 936 fager Korreleret til host-range Forventer at finde -0 yderligere RBP typer c2 fager behov for yderligere analyser og sekvenser P33 fager behov for yderligere analyser og sekvenser Pt identificeret 6 forskellige RBP typer blandt Leuconostoc fager Dias 8

19 Case Middelstor osteproduktion Samme kultur hver dag i uger (med undtagelse af 2 dage) Bulkstarter fra frossen koncentreret kultur hver dag Ingen beskyttelse af bulkproduktion Ostekar lige ved siden af bulkstarter tanke Lukkede ostekar med store ikke beskyttede ventilationsåbninger Vallesi og presserum ikke adskilt fra osteri Prøver fra (næsten) hver dag i uger Dias 9

20 Average log 936 genomes Department of Food Science 2, phages in bulk starter and whey from Dairy D qpcr kvantificering af 936 fager på mejeri D Starter C 0,00 8,00 6,00 Bulk starter Whey, first tank Whey, last tank 4,00 2,00 0,00 Dias 20

21 fold propagation (log) Department of Food Science Fold opformering i ostetanken af 936 fager på mejeri D,00E+06,00E+0 Fold propagation first tank fold propagation last tank,00e+04,00e+03,00e+02,00e+0,00e+00,00e-0,00e-02 Dias 2

22 Department of Food Science 936 fag RBP diversiteten studeret med PCR-DGGE Valle uge 2-3 Brugssyre Valle uge 4 og Uge Dice (Tol 0%-0%) (H>00% S>00%) [00%-000%] whey samples dgge whey samples dgge V8 V9 V0 V V6 V V3 V4 V2 B B2 V26 V37 V38 V27 V39 V42 B24 V V2 V29 Markør a V43 V3 V4 V6 V V6 V49 V0 V3 V36 V44 V46 V4 V48 V47 B7 B8 B4 B B2 B3 B9 B0 V9 V60 V7 B8 B9 B20 B2 B22 B23 V8 B2 B27 B29 B26 B7 B3 B B6 B3 B4 B B28 B30 V8 V20 V9 V4 V V6 V4 V7 V24 V2 V2 V7 V3 V3 V34 V28 V30 V32 V33 b6 V2 V 6009 uge 7009 uge 7009 uge 009 uge 009 uge 3009 uge 4009 uge 4009 uge 3009 uge 3009 uge 4009 uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge 3009 uge uge 0609 uge uge uge uge uge uge uge uge 0609 uge 0609 uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge 0609 uge uge uge uge uge uge uge uge 7009 uge uge uge 0609 uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge 2009 uge uge uge uge uge uge uge uge uge uge FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN FDN CO FDN FDN CO Whey Week 2, 3, 4 Whey Uge 2, 3 Starter Week 3, 4, Whey Week, Whey Week, Dias 22

23 Case 2 Samme mejeri Forsøg med DVS i stedet for bulk starter 3 uger bulkstarter 3 uger DVS 3 uger bulkstarter 2 uger follow up med delvis beskyttelse af bulkstarter tank Prøver fra 3 dage om ugen i uger Dias 23

24 Whey samples from Dairy D (204) Clorine protection of airvent Dias 24

25 Distribution of RBP genes of 936 phages Clorine protection of airvent Dias 2

26 Relative distrubution of phage species on Dairy D wheys (204) Bulk starter DVS starter Bulk starter Clorine protection of airvent Dias 26

27 Whey samples from Dairy D (204) Clorine protection of airvent Dias 27

28 Procentvise fordeling af RBP Department of Food Science Relativ RBP gen fordeling for Le pseudomesenteroides og Le mesenteroides bakteriofager 00% bulk kultur DVS kultur bulk kultur 90% 80% 70% 60% 0% 40% 30% 20% philn6b_rbp philn23_rbp P793_rbp philn34_rbp philn32_rbp philn2_rbp 0% 0% Dias 28 Dato

29 Case 3 Mellemstort ostemejeri Rotation mellem 2 starterkulturer hver 3 uge Bulkstarter fra frossen koncentreret kultur hver dag Bulkstarter tank i separat rum, men sammen med vallebehandling (støjrum) Bulkstarter tank luftindtag beskyttet med HNO 3 filter Prøver 3 dage om ugen i 6 uger gange 2 perioder med 6 ugers interval mellem perioder Dias 29

30 Department of Food Science Case 3: Mejeri E,0E+ 936 Mean/mL Starter,0E+0,0E+09,0E+08,0E+07 Dias 30

31 Mejeri E 936 fager i vallen,0e Mean/mL Whey,0E+08,0E+07,0E+06 Dias 3

32 Mejeri E Tilvækst af 936 fager i ostekar,0e+02 Propagation in cheese vat,0e+0,0e+00,0e-0,0e-02 Dias 32

33 Relativ fordeling af 936 RBP gener i valle Dias 33

34 Case 4 Stort ostemejeri Bruger modersyre brugssyre system Skifter kultur hver uge Ompoder modersyre hver dag og derfra til brugssyre Produktionsapparatet har designfejl der gør at valle og syremælk kommer i kontakt Prøver fra hver dag i uger Dias 34

35 936 phages in bulk starter cultures from Dairy B From R Denis (2009) Master thesis, FOOD_KU Dias 3

36 936 phages in corresponding whey samples From R Denis (2009) Master thesis, FOOD_KU Dias 36

37 Propagation of 936 in cheese vat (dairy B) From R Denis (2009) Master thesis, FOOD_KU Dias 37

38 DGGE profiles of RBP gene in whey samples From R Denis (2009) Master thesis, IFV-LIFE_KU Dias 38

39 PhageWarn projektforslaget Udvikling af et advarselssystem for fremtidige bakteriofagproblemer for mejerier der anvender ikkedefinerede DL-starterkulturer MetaPhageLAB projektet har genereret viden og metoder der kan udvikles til et egentlig advarselssystem Baseres på molekylærbiologiske hurtigmetoder, der vil kunne give svar inden for 24 timer efter prøven er modtaget High-Troughput qpcr baseret Matematisk modellering af risiko for bakteriofagproblemer inden for, 2, 3, 4 eller døgn Automatisk svar til mejerierne der deltager Dias 39 Gør noget nu! Gør noget inden for de næste 3 dage!

40 Arbejdspakkerne Dias 40

41 WP Opbygning af automatiseret High-troughput qpcr Automatisering af DNA oprensning fra valle High troughput qpcr Automatiseret loading af Fluidigm chips 96 qpcr assays 96 prøver Dias 4

42 WP2: Fastsættelse af fagdiversitets treshold Dias 42

43 WP3-WP WP3: Udvikling af matematisk risikomodel for udvikling af fagproblemer baseret på kendskab til anvendt starterkultur WP4: Afprøvning i praksis på udvalgte mejerier WP: Implementering af modellen i industrien Dias 43

44 Udbytte af advarselsystemet Bedre kontrol med syrning Optimeret udnyttelse af starterkultur Vandprocent % vand i 0000 ton ost => ca Mill DKK Konsistens Hulsætning Forbedret kontrol af modning Dias 44