DTU Veterinærinstituttet. Specialeprojekter. Veterinærstuderende

Transkript

1 DTU Veterinærinstituttet Specialeprojekter Veterinærstuderende

2 Specialekataloget kan også findes online på vet.dtu.dk Følg DTU Veterinærinstituttet på Facebook Like os på Facebook og få nyt om specialeforslag, forskningsprojekter, ledige stillinger og invitationer til arrangementer. Søg efter DTU Veterinærinstituttet på Facebook eller besøg facebook.com/dtuvet

3 Skriv speciale ved DTU Veterinærinstituttet Som veterinærstuderende har du en oplagt mulighed for at skrive speciale ved DTU Veterinærinstituttet, der ligger på Bülowsvej lige ved siden af Københavns Universitets campus på Frederiksberg samt på forskningsøen Lindholm ved det sydsjællandske. Her i kataloget kan du se nogle af de forslag til specialer, som forskerne ved DTU Veterinærinstituttet har. Ved hvert forslag står, hvem du kan kontakte, hvis du vil høre mere. Forskerne tager også meget gerne en snak, hvis du selv har forslag til specialeprojekter. International forskning og samarbejde DTU Veterinærinstituttets mere end 220 medarbejdere forsker, rådgiver myndighederne, har ansvaret for den laboratoriemæssige del af det veterinære beredskab, udfører diagnostik, underviser og samarbejder med erhvervslivet. Vi arbejder med infektionssygdomme hos for eksempel kvæg, svin, fjerkræ, mink, fisk og vildt. Og er desuden nationalt og internationalt referencelaboratorium for en række sygdomme. Vores forskningsaktiviteter koncentrerer sig inden for fire indsatsområder Virologi med fokus på alvorlige virusinfektioner og herunder smitte fra dyr til mennesker Immunologi og vaccinologi med fokus på udvikling af vacciner og andre biologiske produkter Epidemiologi med sygdomsmodellering og klimabetingede ændringer i sygdomsudbredelse Bakteriologi, patologi og parasitologi med fokus på ikke-fødevarebårne zoonoser, reduktion af antibiotikaforbruget og karakterisering af multibakterielle samfund. Veterinærinstituttet er en del af DTU - Danmarks Tekniske Universitet, som har hovedsæde i Lyngby. Universitetet har ca medarbejdere og over 7000 studerende. Og vi samarbejder selvfølgelig tæt med DTU s øvrige institutter - blandt andet inden for bioinformatik, molekylærbiologi, matematisk modellering, nantoteknologi og kemisk procesoptimering. Sammen har vi blandt andet etableret platforme til understøttelse af forskningen inden for eksempelvis proteinkemi, mikroskopi og sekventering. Vi går meget op i at have adgang til det nyeste og mest effektive udstyr, da det er vores erfaring, at det er med til at drive forskningen fremad. Instituttet har desuden opbygget et stort internationalt netværk og har indgået aftaler om fælles forsknings- og udviklingsprojekter med en række af verdens førende laboratorier og universiteter. Forskøn dit CV Der er således rig mulighed for at få fingrene i lige præcis den dyreart eller den sygdom, som du har drømt om under studierne, mens du også får indsigt i de nyeste metoder og udstyr. Og du har ikke mindst chancen for at frembringe resultater, som får praktisk betydning og bliver brugt. Så skriv speciale hos os og få endnu et universitet på eksamensbeviset - samtidig med at du får udvidet dit værdifulde netværk. Vi glæder os til at høre fra dig, Kristian Møller, institutdirektør 3

4 Specialestuderende til kamp for glade køer Kristina Fontel skrev i 2013 sit veterinærspeciale ved DTU Veterinærinstiutttet, hvor hun deltog i et forskningsprojekt om mund- og klovesyge. I 2010 var veterinærstuderende Kristina Fontel i praktik i Sydafrika, hvor hun undersøgte kvæg i en zone med mund- og klovesyge (MKS). Det var så spændende, at hun straks ringede til seniorforsker Louise Lohse fra DTU Veterinærinstituttet, da hun søgte en specialestuderende til et MKS-projekt, der foregik på forskningsøen Lindholm ved Sydsjælland. Egentligt ville jeg gerne have skrevet speciale i Sydafrika, men da jeg så opslaget fra Lindholm, tænkte jeg, at det da også var ret eksotisk at komme ud på en øde ø, fortæller Kristina. På Lindholm arbejdede Kristina blandt andet i den sikrede MKS-bygning, hvor hun udtog blodprøver fra inficerede køer. Jeg tror, at det er en kæmpe fordel, at jeg har set MKS i virkeligheden og ikke kun i en bog. Nogle dyr får for eksempel kun blærer i klovspalten - det vil nogle dyrlæger nok overse, hvis de ikke har set sygdommen før. Nedsætter risikoen for smitte Målet med Kristinas speciale var at sammenligne sensitiviteten af stabiliseret og ustabiliseret blod (serum) i forbindelse med diagnostik af MKS. I dag bruges serum til diagnostik, men vi ville gerne undersøge følsomheden af stabiliseret blodmateriale, dvs. blod som er tilsat antikoagulerende stoffer, og som kan bruges direkte i analysen uden forbehandling, fortæller Kristina. Fordelen ved det stabiliserede blod er, at det straks efter udtagelse kan blandes op med lysisbuffer, som opløser virus. Dermed er prøven ikke længere smittefarlig. Serum derimod skal først centrifugeres, før man kan tilsætte lysisbuffer. Det betyder, at man er nødt til først at transportere serumprøven til laboratoriet, før den kan inaktiveres. Ved den nye metode kan man gøre dette allerede i besætningen og derved nedsætte risikoen for smitte, forklarer Kristina og fortsætter: Jeg håber, at jeg har været med til at udvikle en metode, så man kan diagnosticere MKS lettere og hurtigere og derved undgå smitte med sygdommen. Projekttitel: The diagnostic utility of stabilized blood for detection of foot-and-mouth disease virus RNA by PCR Vejledere: Seniorforsker Louise Lohse og souschef Anette Bøtner 4

5 På international konference om parasitter Specialeprojekt om parasitter og resistens hos geder førte Camilla Sørensen og Signe Agner Holm til international konference på Grand Canaria. Camilla Sørensen og Signe Agner Holm blev vejledt af seniorforsker Heidi Enemark fra DTU Veterinærinstituttet og professor Stig Thamsborg fra KU SUND, da de skrev veterinærspeciale om geder og parasitter. Og deres studie viste, at der er en høj forekomst af ormemiddel-resistens hos geder i Danmark. Red en fattigmandsko Mens gedeproduktionen her i landet hovedsageligt er udgjort af hobby-besætninger og mindre deltidslandbrug, har gedeproduktionen anderledes stor betydning på verdensplan. En ged er jo en fattigmandsko, og mange familier i for eksempel Afrika er helt afhængige af et par geder for at få mælk, ost og kød. Derfor er det katastrofalt for dem, hvis deres geder får parasitproblemer og dør. Så forskningen kan være med til at redde mange menneskeliv, hvis man bliver klogere på problemet og på behandling, fortæller Camilla. Signe (tv.) og Camilla (th.) med en ged. Fremlagde for eksperter Som en del af projektet deltog Camilla og Signe i konferencen CAPARA Goat-parasite interactions: from knowledge to control. Konferencen var arrangeret inden for EU s COST-program (European Cooperation in Science and Technology) og foregik på Grand Canaria. Camilla og Signe fik betalt rejsen og opholdet, mod at de ville fremlægge deres foreløbige resultater om orme-resistens hos geder. Det var sjovt at fremlægge for folk, som alle sammen ved mere om emnet end os. Men vi fandt faktisk ud af, at vores forskning er af okay international standard, så det var dejligt at få bekræftet, fortæller Camilla. Projekttitel: Occurrence of Endoparasites and Anthelmintic Resistance in Danish Goat Herds Vejledere: Seniorforsker Heidi Enemark, DTU Veterinærinstituttet, og professor Stig Thamsborg, KU SUND 5

6 Specialeprojekter Sektion for Bakteriologi, Patologi og Parasitologi 8 Hvilken rolle spiller Mycoplasma hyorhinis ved forekomst af bronchopneumoni og otitis media hos gris? 8 Colitis X i danske svin? 9 Colitis hos svin er enterocytproliferation associeret til Brachyspira spp. infektion? 9 Komparativ undersøgelse af konventionelle og molekylære metoder for diagnostik af Mycoplasma hyopneumoniae 11 Karakterisering af Brachyspira spp. ved multi locus sekvens typning (MLST) 12 Brachyspira hos fugle 12 Karakterisering af Flavobacterium psychrophilum isoleret fra forskellige fiskearter 14 Tilsætning af essentielle olier til fiskefoder hvordan påvirker det overlevelsen af fiskepatogener? 14 Bakteriofag-terapi en ny metode til at bekæmpe fiskesygdomme 15 Sektion for Immunologi og Vaccinologi 16 Lav speciale i Faggruppen for Adaptiv Immunologi 16 Karakterisering af genekspression i grise med tarmbetændelse 17 Skriv speciale i Faggruppen for Innat Immunologi 18 Towards understanding the function of an important acute phase protein - Expression of SAA isotypes in Drosophila melanogaster, purification and biological characterization 20 6

7 Sektion for Virologi - Frederiksberg 21 Inficeres lunge epithelceller lige effektivt af influenza A virus fra fugl, svin og mennesker? 21 Inficeres lunge epithelceller lige effektivt af influenza A virus fra fugl, svin og mennesker? 22 Patogenicitet bestemmelse af aviær influenza A virus ved pyrosekventering 23 Subtypning af influenza A virus stammer fra fugle ved brug af Fluidigm teknologi 24 Subtypning af influenza A virus stammer fra svin ved brug af Fluidigm teknologi 25 Hurtig subtypning af influenza A virus stammer fra svin ved real time PCR 26 Identifikation af nye influenza A virus stammer fra fugle eller svin 27 Overfører skadedyr virus mellem pelsdyr? 28 Fylogenetiske undersøgelser af infektiøs laryngotracheitis virus (ILTV) 29 Karakterisering af Newcastle disease (ND) virus fra danske fugle 30 Etablering af real time PCR assay til påvisning af Porcin reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV) 31 Molekylær karakterisering af Porcin reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV) 32 Spyt til diagnostik af luftvejsinfektioner i svin 33 Gode ideer til andre projekter virusinfektioner hos hest mm! 34 Sektion for Virologi - Lindholm 35 Modulation of virus translation initiation efficiency 35 Characterization of bioengineered pestiviruses 36 Monitoring the determinants of pestivirus replication 37 7

8 Sektion for Bakteriologi, Patologi og Parasitologi Hvilken rolle spiller Mycoplasma hyorhinis ved forekomst af bronchopneumoni og otitis media hos gris? M. hyorhinis er en hyppig kommensal i de øvre luftveje og det eustakiske rør hos gris. Organismen er i stand til at forårsage akut serofibrinøs polyserositis og arthritis hos unge grise op til 10 ugers alderen og kan ofte isoleres fra porcine bronchopneumonier. M. hyopneumoniae har i mange år været anerkendt som primært agens ved enzootisk pneumoni, derimod har der været den opfattelse, at M. hyorhinis alene ikke kan forårsage pneumoni, men kun agere som sekundær patogen efter M. hyopneumoniae har banet vejen. I de senere år er der fundet indikationer på at M. hyorhinis også kan fungere som primært agens og forårsage bronchopneumoni samt otitis media hos gris. Formålet med dette speciale er at undersøge forekomsten af M. hyorhinis i lunger og mellemører fra grise for at belyse organismens rolle ved udvikling af bronchopneumoni og otitis media. Metodik: Mikroskopi, histopatologi og in situ detektion af organismen (fluorescens in situ hybridisering/fish ), samt isolering af M. hyorhinis (ved dyrkning). Materiale: Svaberprøver og formalinfikseret væv fra grise med bronchopneumoni og/eller otitis media, samt materiale fra kontrolgrise. Henvendelse til seniorforsker Tim K. Jensen, tije@vet.dtu.dk 8

9 Colitis X i danske svin? Lawsonia intracellularis, E. coli, PCV2 samt spirochæter er hyppige årsager til diarré og tarmbetændelse hos svin. I forbindelse med et igangværende projekt har forskere fra DTU Veterinærinstituttet for nyligt påvist en intracellulær bakterie i tyktarmensslimhindens epitel i fravænnede grise, hvori der ikke kunne påvises andre tarmpatogener. Bakteriens betydning som primær eller sekundær tarmpatogen er ikke undersøgt. Bakterien forsøges identificeret ved molekylærbiologiske metoder, og der udvikles in situ hybridiseringsmetodik til diagnostisk identifikation i vævssnit. Formålet med dette projekt er at belyse betydningen og forekomsten af X bakterien i tarmen fra grise med og uden diarré for at klargøre om den er associeret til colitis. Metodik: Mikroskopi, histopatologi og fluorescens in situ hybridisering på vævssnit af colon. Materiale: Projektindsamlet vævssnit af colon fra grise med eller uden diarré findes allerede. Point: 30 ECTS Henvendelse til seniorforsker Tim K. Jensen, tije@vet.dtu.dk Colitis hos svin er enterocytproliferation associeret til Brachyspira spp. infektion? Lawsonia intracellularis, E. coli og PCV2 er hyppige årsager til diarré og tarmbetændelse hos svin, mens betydningen af Brachyspira spp. endnu ikke er fuldt ud afklaret. I forbindelse med et igangværende projekt har forskere fra DTU Veterinærinstituttet for nyligt påvist en sammenhæng mellem forekomst af Brachyspira spp. og en øget tykkelse af colonslimhinden i fravænnede grise hvori der ikke kunne påvises andre tarmpatogener. Formålet med dette projekt er at belyse om kolonisering af tyktarmen med Brachyspira spp. er associeret med en øget proliferation og afstødning af enterocytter for derved at sandsynliggøre bakteriernes patogene betydning. Enterocytproliferationen vil blive undersøgt ved hjælp af immunohistokemiske undersøgelser på vævssnit. Metodik: Mikroskopi, histopatologi, immunohistokemi og fluorescens in situ hybridisering på vævssnit af colon. Materiale: Projektindsamlet vævssnit af colon fra grise med eller uden diarré findes allerede. Point: 30 ECTS Henvendelse til seniorforsker Tim K. Jensen, tije@vet.dtu.dk 9

10 In vivo karakterisering af det cellulære respons ved Actinobacillus pleuropneumoniae infektion hos gris Actinobacillus pleuropneumoniae kan være årsag til voldsom og tabsvoldende fibrino-nekrotiserende bronchopneumoni (ondartet lungesyge) hos gris. Der eksisterer flere patogenesestudier, der viser den sekventielle udvikling af lungelæsioner ved eksperimentel infektion med A. pleuropneumoniae, der er dog ingen in vivo studier, der ved hjælp af immunhistokemi karakteriserer hvilke celletyper, der er involveret i det inflammatoriske respons. Formålet med dette speciale er at undersøge hvilke celletyper, der er involveret i det tidlige inflammatoriske respons (6 48 timer) ved eksperimentel infektion med A. pleuropneumoniae for at opnå yderligere information vedrørende immunforsvarets rolle i udvikling af ondartet lungesyge. Dette gøres ved at anvende cellulære markører for bl.a. T-lymfocytter, B-lymfocytter, makrofager og cytokeratin, samt histokemiske farvninger til at karakterisere det inflammatoriske respons ved forskellige tider af læsionerne. Metodik: Mikroskopi, histopatologi og in vivo identifikation af inflammationsceller (ved immunhistokemi og histokemi), samt in situ detektion af organismen (ved fluorescens in situ hybridisering/ FISH). Materiale: Snit af formalinfikseret lunge og lymfeknude fra gris, udtaget ved et tidligere infektionsforsøg med A. pleuropneumoniae. ECTC: 30 Henvendelse til seniorforsker Tim K. Jensen, tije@vet.dtu.dk (hovedvejleder) eller forsker Mette Sif Hansen, mesi@vet.dtu.dk (medvejleder) 10

11 Komparativ undersøgelse af konventionelle og molekylære metoder for diagnostik af Mycoplasma hyopneumoniae Mycoplasma hyopneumoniae er det primære agens ved svinets enzootiske pneumoni, og er dermed den mykoplasma, som er af størst økonomisk betydning for svineproduktionen i verden. I Danmark søges infektionen med M. hyopneumoniae holdt ude af SPF-systemet, men reinfektionsprocenten er relativ høj. For tiden er den laboratoriemæssige bekræftelse af reinfektionen af SPF-besætningerne baseret på dyrkning som referencemetode. Men da M. hyopneumoniae er en langsomvoksende art, kan en dyrkningsbaseret identifikation tage op til 4-5 uger. Ved DTU Veterinærinstituttet blev der for nylig udviklet en ny real-time PCR for identifikation af M. hyopneumoniae. Testen viste sig at være meget sensitiv og bruges i dag for påvisning af M. hyopneumoniae direkte i lungeprøver. Testen blev dog aldrig sammenlignet med dyrkning og kunne derfor ikke bruges som erstatning til dyrkning ved mistanke om reinfektion af SPF besætningerne. Dette projekt har til formål at undersøge sensitiviteten af DTU Veterinærinstituttets standard dyrkningsprocedure og sammenligne denne med sensitiviteten af den nyudviklede real-time PCR test for diagnostikken af M. hyopneumoniae. Udførelse af projektet forudsætter indsamling af svinelunger fra slagteriet. I løbet af projektet skal den studerende opnå viden om og praktisk erfaring med de konventionelle teknikker og procedurer for påvisning og identifikation af Mycoplasma samt viden om og praktisk erfaring med mikrobiel identifikation og kvantitativ bestemmelse ved brug af real-time PCR. Resultater af undersøgelsen skal publiceres i et internationalt tidsskrift med referee. ECTS: 30 Henvendelse til seniorforsker Branko Kokotovic, bkok@vet.dtu.dk, tlf

12 Karakterisering af Brachyspira spp. ved multi locus sekvens typning (MLST) En række forskellige species af Brachyspira kan findes i tarmen hos svin, men fenotypisk adskillelse kan være meget besværligt. Brachyspira hyodysenteriae forsårsager svinedysenteri, og B. pilosicoli forårsager colitis, men for de øvrige species inden for slægten er den patogene betydning uafklaret. Der synes at være stor genetisk variation inden for de forskellige grupper, og for mange isolater er artsbestemmelsen behæftet med stor usikkerhed. Sekvensering af husholdningsgener har vist sig at være en god metode til at karakterisere stammer inden for denne bakterieslægt. I projektet vil MLST blive brugt til to formål: 1) At karakterisere stammer, der er genetisk tæt beslægtet med B. hyodysenteriae for at evaluere speciesidentifikation baseret på PCR og FISH. 2) At karakterisere variationen blandt danske stammer tilhørende de forskellige Brachyspira spp. ECTC: 30 Henvendelse til seniorforsker Branko Kokotovic, bkok@vet.dtu.dk, tlf Brachyspira hos fugle Bakterier inden for slægten Brachyspira kan findes inden for en række pattedyr og fugle. Flere arter er årsag til diarre hos svin. Undersøgelser fra Sverige har vist, at lignende arter også kan findes hos en række fuglearter. I projektet vil der blive indsamlet svaberprøver fra fugle i forbindelse med ringmærkning. Brachyspira vil blive dyrket på selektive medier og isolaterne karakteriseres biokemisk og genetisk. Bakterierne skal videre sammenlignes med danske isolater fra svin og fjerkræ samt isolater fundet hos svenske fugle. ECTC: 30 Henvendelse til seniorforsker Branko Kokotovic, bkok@vet.dtu.dk, tlf

13 Fodringsmæssig afhjælpning af diarré hos småkalve forårsaget af cryptosporidiose Forskningsresultater viser, at kalve fodret med store mælkemængder er mindre tilbøjelige til at udvikle diarré som følge af cryptosporidiose. I projektet afprøves i hvilken grad øget tildeling af mælk til kalve i 5-10 udvalgte besætninger med kendte diarré-problemer forårsaget af cryptosporidiose, kan bidrage til løsning af sygdomsproblemerne. Potentielle besætninger udpeges med hjælp fra praktiserende dyrlæger. Endelig udvælgelse foretages efter laboratoriemæssig verificering af cryptosporidiose som den sandsynlige årsag til diarré-problemerne. Der vil i denne projektdel være gode muligheder for at deltage i såvel praktisk arbejde i besætningerne og laboratoriearbejde. Arbejdet er en del af Videncentret for Landbrugs projekt Mere fokus på småkalve. Henvendelse til seniorforsker Heidi Enemark, tlf , enhi@vet.dtu.dk 13

14 Karakterisering af Flavobacterium psychrophilum isoleret fra forskellige fiskearter Sygdommen yngeldødelighedssyndromet forårsaget af bakterien Flavobacterium psychrophilum har siden midten af 80 erne forårsaget store tab ved produktion af regnbueørreder i dambrug i Danmark såvel som i andre europæiske lande. Bakterierne, der er isoleret fra regnbueørreder, er gennem tidligere forskningsarbejde karakteriseret ved hjælp af biokemiske, serologiske og molekylær mikrobiologiske metoder. Bakterien er i enkelte tilfælde isoleret fra aborrer, bækørreder og laks i opdræt. Projektets formål er at undersøge om bakterierne, der er isoleret fra de forskellige fiskearter, er beslægtede, og dermed kan udgøre en mulig smittekilde. Metodik: Fænotypiske (biokemi og serologi) og molekylærbiologiske metoder, f.eks. pulsed-field gel elektroforese (PFGE). ECTC: 30 Henvendelse til seniorforsker Inger Dalsgaard, inda@vet.dtu.dk, eller seniorforsker Lone Madsen, loma@vet.dtu.dk, Tilsætning af essentielle olier til fiskefoder hvordan påvirker det overlevelsen af fiskepatogener? Forskellige tilsætninger til fiskefoder, eksempelvis probiotika, menes at kunne styrke regnbueørredens immunforsvar. Essentielle olier af forskellig oprindelse kunne tænkes at have samme effekt. Det ønskes at belyse, om overlevelsen af forskellige fiskepatogener påvirkes ved tilsætning af essentielle olier. I første omgang foretages undersøgelsen i laboratoriet, da et positivt resultat her er obligatorisk før der vil blive foretaget en afprøvning i foder til fisk. Metodik: Under laboratorieforhold undersøges hvordan tilsætning af forskellige essentielle olier påvirker en bouillon kultur af et fiskepatogen, eksempelvis Flavobacterium psychrophilum (årsag til yngeldødelighedssyndromet) eller Yersinia ruckeri (årsag til rødmundsyge). ECTS: 30 Henvendelse til seniorforsker Lone Madsen, loma@vet.dtu.dk, eller seniorforsker Inger Dalsgaard, inda@vet.dtu.dk, 14

15 Bakteriofag-terapi en ny metode til at bekæmpe fiskesygdomme Virus, der inficerer bakterier, de såkaldte bakteriofager, kan potentielt udnyttes til at bekæmpe sygdomsfremkaldende bakterier, som et alternativ eller supplement til antibiotika. I samarbejde med KU, Chr. Hansen A/S, BioMar A/S og Dansk Akvakultur gennemfører vi et projekt, der undersøger potentialet i denne nye behandlingsform kaldet bakteriofag-terapi til behandling af fiskesygdomme. Projektets formål er at udvikle en ny metode til behandling af infektioner i regnbueørred med bakterien Flavobacterium psychrophilum, som er årsag til sygdommen yngeldødelighedssyndromet (YDS), der er et af de største sygdomsproblemer i dansk dambrug. I en tid med stigende problemer med antibiotikaresistens er der er stort behov for at forske i alternative behandlingsformer. Projektet vil undersøge potentialet i at udnytte bakteriofager (bakterievirus) til at dræbe F. psychrophilum i inficerede fisk samt grundlaget for en kommerciel udnyttelse af en egentlig behandlingsmetode mod sygdommen. Rent praktisk betyder det arbejde med isolering og karakterisering af bakteriofager, samt at teste for effekter af fagtilsætning på overlevelse af regnbueørreder. Henvendelse til seniorforsker Inger Dalsgaard, inda@vet.dtu.dk, eller seniorforsker, Lone Madsen, loma@vet.dtu.dk, Reference Stenholm, AR, Dalsgaard, I & Middelboe, M. (2008). Isolation and characterization of bacteriophages infecting the fish pathogen, Flavobacterium psychrophilum. Appl. Environ. Microbiol. 74:

16 Sektion for Immunologi og Vaccinologi Lav speciale i Faggruppen for Adaptiv Immunologi I Faggruppen for Adaptiv Immunologi i Sektion for Immunologi og Vaccinologi på DTU Veterinærinstituttet forsker vi i vaccineudvikling og lokalt og systemisk immunrespons på en række infektionssygdomme i køer og grise. Herunder også udvikling af nye og bedre tests til måling af såvel humoralt som cellemedieret immunrespons ved eksempelvis flow cytometri, ELISPOT, cytokinanalyser, genekspression eller dannelsen af rekombinate MHC klasse I tetramer molekyler. I de senere år har vi sat fokus mod anvendelse af den immunologiske viden til udvikling og afprøvning af nye vacciner, hvor vi har særlig opmærksomhed på at udvikle og følge relevante immunologiske korrelater for en beskyttende immunitet. Blandt de infektionssygdomme. vi har arbejdet med, er: paratuberkulose (Mycobacterium paratuber-culosis), brucellose (Brucella suis), yersiniose (Yersinia enterocolitica O:9), porcin Mycoplasma arthri tis (Mycoplasma hyosynoviae), porcin proliferativ enteropati (Lawsonia intracellularis), ascaridiose i kyllinger (Ascaridia galli), toxoplasmose (Toxoplasma gondii), og porcin ascariose (Ascaris suum). Der er næsten altid en mulighed for at gå i dybere detaljer med de projekter, vi har kørende, så hvis du er interesseret i anvendt immunologi og vaccineudvikling, er du velkommen til at kontakte professor Gregers Jungersen og høre nærmere om, hvilke muligheder der er netop nu. Eksempler på nylige bachelor- og specialeprojekter i faggruppen: Etablering af porcine T celle kloner med specificitet over for Lawsonia intracellularis Characterization of interferon-gamma producing CD8+ T cells in the porcine immune response to Lawsonia intracellularis infection Quantitative measurements of antigen-specific cell-mediated immune responses by interferongamma assay, ELISpot and intracellular flow cytometry Prediction and Identification of Virally Derived Peptides for the Binding and Complex Formation of Swine Leukocyte Antigen Molecules SLA-1*04:01, SLA-1*07:01, SLA-1*07:02 and SLA-2*04:01 Flowcytometrisk påvisning af regulatoriske T celler i kalve eksperimentelt smitte med paratuberkulose Characterization of cellular interactions during in vitro assays for cell mediated immunity in cattle vaccinated against Mycobacterium paratuberculosis Kloning og karakterisering af bovine integriner Henvendelse til Gregers Jungersen, professor, dyrlæge og faggruppeleder for adaptiv immunologi, telefon , mobil , grju@vet.dtu.dk 16

17 Karakterisering af genekspression i grise med tarmbetændelse - High throughput gene expression analysis of host response during Lawsonia intracellularis infection in pigs Bakterien Lawsonia intracellularis er den hyppigst diagnosticerede årsag til diarré hos slagtesvin i Danmark og er dermed en af de vigtigste årsager til det store antibiotikaforbrug i svineproduktionen. Bakterien lever inde i celler i tarmen, hvilket fører til fortykkelse af tarmen, nedsat fødeoptag, utrivelighed og nedsat dyrevelfærd. På DTU Veterinærinstituttet er der udført eksperimentelle infektionsforsøg, som viser, at en primær infektion kan beskytte mod gentagen infektion. Disse og andre forsøg viser, at det celle-medierede immunforsvar har stor betydning for bekæmpelse af L. intracellularis infektion. Men lokalt i tarmen kan innate (medfødte) forsvarsmekanismer være af stor betydning for om bakterien får mulighed for at etablere sig (dvs. kolonisere tarmepitelceller) og udvikle infektion. Lawsonia intracellularis er ud fra en cellebiologisk betragtning en meget interessant bakterie. Den er obligat intracellulær, dvs. fuldstændig afhængig af en værtscelle. Men samtidig er bakterien i stand til at modstå cellens forsvarsmekanisme - måske ved at flygte ud i cellecytoplasmaet og derved modstå diverse drabsmekanismer. Projekt Eksisterende vævsprøver fra tarm og lever udtaget fra eksperimentelt L. intracellularis inficerede grise og ikke inficerede kontrolgrise danner grundlag for dette projekt. Den studerende skal måle ekspressionen (det niveau, hvor et bestemt gen er udtrykt) af udvalgte immunologiske gener som bla. defensiner, cytokiner, og kemokiner vha. RT-qPCR. Disse resultater skal korreleres med allerede eksisterende data, som beskriver infektionsgraden og immunsvaret i disse grise. Den studerende skal selv designe og indkøre nogle enkelte primere til RT-qPCR men fortrinsvis benytte sig af indkørte og validerende primer assays. Spørgsmål der ønskes belyst Hvordan påvirker L. intracellularis genekpression lokalt i tarmen samt i leveren hos svin inficeret med L. intracellularis? Kan der påvises en sammenhæng imellem ekspression af immunfaktorer og infektionsgrad/sygdom? Andet Projektet vil give den studerende kendskab til og erfaring med ekstraktion og kvalitetsmåling af RNA, real time PCR (high throughput systemet Fluidigm), primer design og validering samt ekspressionsdataanalyse. Herudover vil det give den studerende indblik i anvendelse af forskellige analysemetoder til at karakterisere immunsvaret ved infektion/og vaccineudvikling. Arbejdet vil blive udført i faggrupperne for Innat og Adaptiv Immunologi på DTU Veterinærinstituttet, hvor der bl.a. forskes i immunrespons, vaccineudvikling, og udvikling af ny diagnostik. Hvis det er muligt skal resultater af undersøgelsen publiceres i et internationalt tidsskrift med referee. Henvendelse til seniorforsker Ulla Riber, urib@vet.dtu.dk, eller Kerstin Skovgaard, tlf , kesk@vet.dtu.dk, 17

18 Skriv speciale i Faggruppen for Innat Immunologi Faggruppen for Innat Immunologi forsker i de basale, ikke-specifikke immunreaktioner, der optræder i det tidlige værtsrespons på infektion og/eller vævsskade og som omfatter inflammation, akut-fase protein responset, feber osv. Dette er vigtigt for at forstå sådanne innate (medfødte) responsers rolle i infektionsbiologi, infektionspatogenese, modtagelighed kontra modstandsdygtighed mod infektion osv., hvilket kan bidrage til udviklingen af biomarkører for disse tilstande (diagnostik baseret på værtsreaktioner) og til at identificere nye targets for intervention. Dette arbejde danner også baggrunden for at arbejde med dyremodeller for specifikke infektioner og for ernæringsinduceret fedme-relateret sygdom (metabolic syndrome), samt for etablering af nye objektive metoder til at måling af dyrevelfærd, baseret på biomarkører for stress og sygdom. Endvidere danner det baggrund for forsøg med udvikling af nye typer af molekylære adjuvanser, baseret på en forståelse af hvordan specifik (adaptiv) immunitet styrkes af den rette dosering og kombination af innate immunfaktorer. Vores basis er proteinkemi, immunologi, high-throughput molekylærbiologiske metoder og organisk kemi, specielt peptid- og dendrimerkemi. Vi er metodeorienterede og udvikler ofte nye metoder og koncepter fra bunden, men har samtidigt et stærkt biologisk, biokemisk og immunologisk fundament. Vi er ikke permanent bemandet med dyrlæger i vores faggruppe, men rigtigt mange af vores projekter er baseret på tværdisciplinært samarbejde med dyrlægerpå universiteter og i industrien, foruden naturligvis på vores eget institut, herunder især med vores søsterfaggruppe Adaptiv Immunologi. Vores projekter giver dig derfor som dyrlægestuderende lejlighed til at arbejde tværfagligt og med et stort selvstændigt ansvar for evt. dyrlægefaglige dele af projektet. Eksempler på områder med dyrlægefaglig relevans i Faggruppen for Innat Immunologi Akut-fase responset ved infektion hos svin, kvæg, heste og andre husdyr Diagnostikudvikling baseret på kemisk fremstillede ligander eller antigener Fibrilleringsprocessen hos prionproteinet Inflammationsmarkører ved overvægt i svinemodeller for fedme Transkriptionsanalyser af værtsrespons på infektion i diverse infektionsmodeller (herunder modeller for humane infektioner) Funktionel karakterisering af proteiner og andre faktorer i cellekultursystemer mhp. belysning af pro- eller præbiotiske effekter Storskala oprensning og derivatisering af immunglobuliner til passiv immunisering af produktionsdyr. 18

19 Eksempler på nylige bachelor- og specialeprojekter i Faggruppen for Innat Immunologi Development of a Laser capture Microdissection protocol targeting adipose tissue macrophages for mrna extraction and analysis High-throughput gene expression analysis of host and pathogen in porcine lung infection Characterization of microrna in human in vitro stimulated blood samples Effekt af kolostrum på porcine tarmepithelceller som model for nekrotiserende enterocolitis The effect of functionalized dendrimers on fibrillated alpha-synclein Expression in Drosophila S2 cells, purification and biological characterization of recombinant bovine serum amyloid A (SAA) isoforms Karakterisering af immunrelateret genekspression i slagtesvin med akut ledbetændelse forårsaget af infektion med Mycoplasma hyosynoviae Forslag til specialeprojekter i Faggruppen for Innat Immunologi Herunder er stikord til nye specialeprojekter, som står åbne for interesserede og dygtige veterinære studerende med lyst og mod på tværdisciplinært arbejde i et dynamisk miljø med spændende og relevante forskningsområder Optimering af metoder til konjugering af antistoffer med fluorophorer Undersøgelse af fluktuationer i cirkulerende mikrorna i blod under infektion Porcint alpha-1-acid glycoprotein: karakterisering af gen ekspression og serumproteinniveauer under infektion of i fedmemodelelr Stabilisering af immunglobulin til oral dosering og aftestning i svin (besætninger) og kyllinger (eksp. campylobacterinfektion) Udvikling af turbidimetrisk, dendrimer-basreet metode til koncentrationsbestemmelse af C-reaktivt protein Fremstilling af antistoffer mod dendrimerer Udvikling af selected reaction monitoring mass spektrometri til analyse af proteiner i blod og væv Undersøgelse af det murine lunge SAA respons på nanopartikeleksponering Etablering af spyt-baserede assays til måling af stress-relaterede faktorer hos svin Karakterisering af proteiner og/eller microrna i exosomer hos husdyr Porcine alpha-1-acid glycoprotein; characterization of glycosylation and functional investigations Stabilizing porcine immunoglobulin to preserve ETEC inhibitory activity after pepsin and low ph treatment Nogle af disse emner er brede og kan rumme flere specialprojekter med forskelligt sigte, og vi er desuden åbne over for andre projektforslag, som ligger inden for vores generelle områder. Henvendelse til Peter Heegaard, professor, biokemiker, studieleder (Farmateknologi), faggruppeleder for Innat Immunologi, , pmhh@vet.dtu.dk 19

20 Towards understanding the function of an important acute phase protein - Expression of SAA isotypes in Drosophila melanogaster, purification and biological characterization Serum amyloid A (SAA) proteins are a family of small apolipoproteins, which are able to bind highdensity lipoproteins. Their expression is dramatically up-regulated during the acute phase response, which is the systemic part of an inflammatory reaction. The best known isoforms are the SAA1, SAA2, and SAA3. SAA1 and SAA2 are induced during the acute phase response in the liver, whereas SAA3 is predominantly expressed locally. Although the importance of SAA proteins is stressed by its high degree of evolutionary conservation amongst a large number of different organisms, it is very tight regulation of expression during the acute phase response and the presence of isoforms with different tissue tropisms, their exact physiological role is yet to be discovered. It may play a beneficial role during inflammation and tissue injury and in cholesterol transport. Project In this master thesis, our focus is on bovine SAA1 and SAA3 as well as porcine SAA1. In bovine, SAA3 can be readily measured in milk samples, for which reason it can be used as a biochemical marker for different diseases. Porcine SAA1 has not been rigorously defined yet on the protein level so this part of the project will provide completely new data on this. The final objective of this project is to characterize SAA isoforms biologically with regards to innate immune functions. Prior to the biological characterization, we need to produce high yields of recombinant SAA isoforms, which is done by expression systems with Drosophila melanogaster in collaboration with Danish company Expres(2)ion. Furthermore, a purification step has to be carried out to obtain clean products for the biological characterization. Biological characterization will be done in collaboration with a Belgian collaborator (2-3 months stay). There is also a possibility to pursue mass spectrometry development based on the defined isoforms produced in the project. Contact Professor Peter Heegaard, phone and pmhh@vet.dtu.dk Section for Immunology og Vaccinology, DTU Vet, Bülowsvej 27, Frederiksberg C Note - We need you as soon as possible! This project has already been initiated and the three SAA isoforms have been expressed in the D. melanogaster system, however the student had to leave the project (for health reasons). There is plenty of room for 1-2 new students in the project. 20

21 Sektion for Virologi - Frederiksberg Inficeres lunge epithelceller lige effektivt af influenza A virus fra fugl, svin og mennesker? Det har vist sig, at fugleinfluenza virus foretrækker at inficere bestemte celler i lungerne hos grise og mennesker, de såkaldte alveolær type II epithelceller. Årsagen hertil er ukendt, og vil blive forsøgt belyst i projektet ved at anvende cellekultur systemer. Baggrund Lungevævet er beklædt med to typer af epithelceller: type I og II alveolære epithelceller. Almindelige svineinfluenza virusser inficerer både type I og II alveolære epithelceller. Et interessant fund på DTU Veterinærinstituttet har vist, at fugleinfluenza infektion hos grise, ligesom hos mennesker, foretrækker type II cellerne. Årsagen til, at fugleinfluenza foretrækker at inficere type II epithelcellerne, er ukendt. Men da infektion med fugleinfluenza hos mennesker har vist sig at give svære infektioner med høj dødelighed, kan denne forkærlighed for type II celler være en vigtig faktor for den aggressive sygdomsudbredelse. En af grundene kan være, at type II celler producerer vigtige stoffer som f.eks. surfactant proteiner, der medvirker til at forsvare lungerne mod infektion. Projekt For at undersøge mekanismerne, der ligger bag prædilektionen af fugleinfluenza for alveolære type II epithelceller, vil vi benytte en kommerciel tilgængelig human lunge epitelcellelinie samt MDCK celler og primære trachea (luftrør)epitelceller fra grise. Den humane alveolære epitelcellelinie A549 er kendt for at være yderst modtagelig overfor influenza A virus infektion af alle typer. Forskelle ved infektion med influenza A virus fra forskellige kilder vil blive beskrevet ved at kigge på den cytopathogene effekt, TCID/50 bestemmelser og viral ekspressions analyse til forskellige tidspunkter efter infektion. De virale ekspressionsanalyser vil bestå af strand-specific RT-PCR, hvorved man vil kunne skelne mellem, viralt RNA, copy RNA og messenger RNA. Der vil blive anvendt udvalgte influenza A virus fra fugle, svin og mennesker til forsøgene. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 21

22 Inficeres lunge epithelceller lige effektivt af influenza A virus fra fugl, svin og mennesker? Det har vist sig, at fugleinfluenza virus foretrækker at inficere bestemte celler i lungerne hos grise og mennesker, de såkaldte alveolær type II epithelceller. Årsagen hertil er ukendt, og vil blive forsøgt belyst i projektet ved at anvende cellekultursystemer. Baggrund Lungevævet er beklædt med to typer af epithelceller: type I og II alveolære epithelceller. Almindelige svineinfluenza virusser inficerer både type I og II alveolære epithelceller. Et interessant fund på DTU Veterinærinstituttet har vist at fugleinfluenza infektion hos grise, ligesom hos mennesker, foretrækker type II cellerne. Årsagen til at fugleinfluenza foretrækker at inficere type II epithelcellerne er ukendt. Men da infektion med fugleinfluenza hos mennesker har vist sig at give svære infektioner med høj dødelighed, kan denne forkærlighed for type II celler være en vigtig faktor for den aggressive sygdomsudbredelse. En af grundene kan være, at type II celler producerer vigtige stoffer som f.eks. surfactant proteiner, der medvirker til at forsvare lungerne mod infektion. Projekt For at undersøge mekanismerne, der ligger bag prædilektionen af fugleinfluenza for alveolære type II epithelceller, vil vi benytte kommercielt tilgænglige humane lunge epithelcellelinier. Den humane alveolær epithelcellelinie A549 er kendt for at være yderst modtagelig overfor influenza A virus infection af alle typer. Andre humane epithelcelleliner som SW-1573, NCI-H358 og NCI-H1404, hvoraf de to sidste udtrykker surfactant proteiner, er så vidt vides ikke undersøgt ved influenza A virus infektion. Forskelle ved infektion med influenza A virus fra forskellige kilder vil blive beskrevet ved at kigge på den cytopathogen effekt og TCID/50 bestemmelser til forskellige tidspunkter efter infektion. Infektionsforskelle vil blive yderlig belyst ved forskellige behandlinger af cellerne som f.eks. tilsættelse eller fjernelse af surfactant proteiner, tilsætning af et enzym, der fjerner receptorer mv. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 22

23 Patogenicitet bestemmelse af aviær influenza A virus ved pyrosekventering Aviær influenzavirus kan klassificeres som lavpatogen eller højpatogen afhængigt af i hvilken grad den fremkalder sygdom og dødsfald i fugle. Indtil nu har det kun været influenzavirus subtyperne H5 og H7, som har forårsaget udbrud af fugleinfluenza. Klassificering foregår ved bestemmelse af aminosyre sekvensen i kløvningsstedet for protease i HA proteinet. I dag bestemmes den sekvens ved almindelig sanger sekventering, men ved at benytte metoden pyrosekventering kan dette arbejde udføres betydelig hurtigere og billigere, da både opsætning, udførelse og databehandling vil være nemmere. Baggrund Influenza A virus er en gruppe af virus, der kan inficere en lang række dyr, herunder svin, fugle og mennesker. Generelt set er de influenzatyper, der cirkulerer inden for en population, arts-specifikke, hvilket betyder, at de virus, der cirkulerer i f.eks. svin og fugle normalt bliver i deres vært. Influenza A virus subtypes ud fra generne HA og NA, og svømmefugle, der anses for at være reservoir for influenza A virus, indeholder alle subtyper af de to gener (H1 til H16 og N1 til N9), men dog ikke alle kombinationer. Der findes mange forskellige stammer af aviær influenzavirus (AI), og generelt set klassificeres de i to kategorier: lavpatogene (LP) og højpatogene (HP) afhængigt af i hvilken grad de fremkalder sygdom og dødsfald i fugle. Selvom der findes 16 H-typer af influenza A virus, har det indtil nu kun været subtyperne H5 og H7, som har forårsaget udbrud af fugleinfluenza. Derfor vækker især forekomsten af disse subtyper i vilde fugle opmærksomhed og nogen bekymring. Når influenzavirus trænger ind i en celle sker det ved binding af det virale hemagglutinin (HA) protein til cellens receptor, men før dette kan ske, skal HA proteinet først kløves af en protease inde i værten. Klassifikationen af aviær influenza som enten HPAI eller LPAI er blandt andet baseret på kløvningsstedet i det umodne HA protein og dermed hvilken type af protease der kan kløve HA. Sammensætningen af aminosyrer i kløvningsstedet af HA proteinet kan bestemmes ved nukleotid sekventering af det specifikke område i HA genet. Projekt I projektet skal der designes og valideres et assay til pyrosekventering af det område i HA genet, der koder for protease kløvningsstedet. I dag bestemmes denne sekvens ved almindelig sanger sekventering, men ved brug af pyrosekventering kan dette gøres betydelig hurtigere og billigere. Assay til pyrosekventering designes ud fra kendte aviærinfluenza HA sekvenser samt ved brug af et specielt pyrosekventering design software. Projektarbejdet vil indebære oprensning af RNA, opsætning og udførelse af PCR samt pyrosekventering, og efterfølgende databehandling af sekvensresultater. For fuld klassificering af høj- og lavpatogene aviær influenza stammer af både H5 og H7, vil der sikkert blive tale om mindst to assays. Et projekt kan derfor tilpasses i størrelse ved at udvælge hvilke(n) influenzavirus, der skal kunne klassificeres. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 23

24 Subtypning af influenza A virus stammer fra fugle ved brug af Fluidigm teknologi Subtypning af influenza A virus er normalt en meget krævende proces. I dette projekt udvikles derfor en PCR array chip Fluidigm chip der kan subtype alle kombinationer af H og N for aviær influenzavirus på en gang. Baggrund Influenza A virus er en gruppe af virus, der kan inficere en lang række dyr, herunder svin, fugle og mennesker. Influenzavirus subtypes ud fra generne HA og NA og svømmefugle der anses for at være reservoir for influenza A virus indeholder alle subtyper af de to gener (H1 til H16 og N1 til N9), men dog ikke alle kombinationer. Normalt types aviær influenzavirus ved HI-test (hemagglutinin inhibition test), hvor virus isolatet testes imod alle 16 HA antisera for HA subtype bestemmelse. NA subtypes efterfølgende i et assay imod alle 9 NA antisera. En anden metode til subtypning er partiel eller fuldlængde sanger sekventering af HA og NA generne. Fælles for alle disse metoder er, at de er tidskrævende. Projekt I dette projekt vil en PCR array chip, baseret på Fluidigm teknologien, blive udviklet. En Fluidigm chip kan analysere 48 prøver (virus isolater) overfor 48 PCR assays i en analyse, eller 96 prøver overfor 96 PCR assays ved at bruge en større chip. Projektarbejdet vil omhandle litteratursøgning efter PCR assays til detektion af alle 16 HA gener og alle 9 NA gener. Det er vigtigt for alle udvalgte PCR assays: i) at de virker under de samme PCR betingelser; ii) at de enkelte assay er gene specifikke; iii) at hver gene bliver testet i mere end et assay. Arbejdet vil derfor involvere; oprensning af influenzavirus RNA genom, optimering af adskillige PCR assays, test af specificitet af udvalgte PCR assays samt opsætning og udførelse af Fluidigm analyser. Projektet vil kunne opdeles i projekter af forskellig størrelse, ved kun at udvælge specifikke HA og NA gener til Fluidigm chippen. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 24

25 Subtypning af influenza A virus stammer fra svin ved brug af Fluidigm teknologi Subtypning af influenza A virus er normalt en meget krævende proces. I dette projekt udvikles derfor en PCR array chip Fluidigm chip der kan subtype alle relevante kombinationer af H og N for svine influenzavirus på en gang, samt genets fylogenetiske tilhørsforhold. Baggrund Influenza A virus er en gruppe af virus, der kan inficere en lang række dyr, herunder svin, fugle og mennesker. Influenzavirus subtypes ud fra generne HA og NA og svømmefugle der anses for at være reservoir for influenza A virus indeholder alle subtyper af de to gener (H1 til H16 og N1 til N9), men dog ikke alle kombinationer. Hos mennesker og svin er det hovedsagligt subtyperne H1N1, H1N2 og H3N2 der er isoleret. Ud over subtype bestemmelse er der også fokus på hvilken vært genet oprindeligt kommer fra, hvilket kan belyses ved fylogenetiske analyser. I svin opdeles H1 genet f.eks. i tre varianter kaldet; klassisk, aviær-lignende samt human-lignende. Normalt types influenzavirus ved HI-test (hemagglutinin inhibition test), hvor virus isolatet testes imod relevante HA antisera for HA subtype bestemmelse. NA subtypes efterfølgende i et assay imod alle relevante NA antisera. En anden metode til subtypning er partiel eller fuldlængde sanger sekventering af HA og NA generne. Fælles for alle disse metoder er, at de er tidskrævende. Projekt I dette projekt vil en PCR array chip, baseret på Fluidigm teknologien, blive udviklet. En Fluidigm chip kan analysere 48 forskellige prøver (virus isolater) overfor 48 forskellige PCR assays i en analyse, eller 96 prøver overfor 96 PCR assays ved at bruge en større chip. Projektarbejdet vil omhandle litteratursøgning efter PCR assays til detektion af alle relevante HA og NA gener. Endvidere ville det være interessant, at påsætte PCR assays der kunne detektere genets fylogenetiske tilhørsforhold. For at Fluidigm chippen kan virke, er det vigtigt at alle udvalgte PCR assays: i) virker under de samme PCR betingelser; ii) de enkelte assays er gen specifikke; iii) at der er flere assay for hvert gen. Arbejdet vil derfor involvere; oprensning af influenzavirus RNA genom, optimering af adskillige PCR assays, test af specificitet for udvalgte PCR assays samt opsætning og udførelse af Fluidigm analyser. Omfanget af projektet kan tilpasses ved at udvælge, hvilke specifikke HA og NA gener Fluidigm chippen skulle indeholde. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 25

26 Hurtig subtypning af influenza A virus stammer fra svin ved real time PCR Subtypning af influenza A virus er normalt en meget krævende proces. I dette projekt udvikles real time PCR assays baseret på PriProET kemien til hurtigt subtypning af positive influenzavirus prøver fra svin. Baggrund Influenza A virus er en gruppe af virus, der kan inficere en lang række dyr, herunder svin, fugle og mennesker. Influenzavirus subtypes ud fra generne HA og NA og svømmefugle der anses for at være reservoir for influenza A virus indeholder alle subtyper af de to gener (H1 til H16 og N1 til N9), men dog ikke alle kombinationer. Hos mennesker og svin er det hovedsagligt subtyperne H1N1, H1N2 og H3N2 der er isoleret. Hos svin er der således reelt tale om fire gener, der skal kunne detekteres, nemlig H1, H3, N1 og N2, men da influenzavirus er et RNA virus findes der stor sekvensvariation for de enkelte gener, hvilket gør det vanskeligt at detektere alle f.eks. H1 varianter i et real time PCR assay. Normalt types influenzavirus ved HI-test (hemagglutinin inhibition test), hvor virusisolatet testes imod relevante HA antisera for HA subtype bestemmelse. NA subtypes efterfølgende i et assay imod alle relevante NA antisera. En anden metode til subtypning er partiel eller fuldlængde sanger sekventering af HA og NA generne. Fælles for alle disse metoder er, at de er tidskrævende. Projekt I dette projekt skal der designes og valideres et eller flere real time PCR assays til detektion af alle varianter af H1 gen, der forekommer i svin. Nye real time PCR assays skal designes ved sammenligning (alignment) af kendte svine influenzavirus H1 sekvenser samt ved brug af et real time PCR design software. Det er vigtigt, at de nye H1 real time PCR assays virker under samme PCR betingelser som de øvrige svine influenzavirus subtypningsassays. Projektarbejdet vil indebære oprensning af influenzavirus RNA genom, opsætning og udførelse af real time PCR, test af sensitivitet og specifitet overfor kendte svine influenzavirus subtyper. Omfanget af projektet kan tilpasses ved at udvælge hvor mange H1 varianter der skal kunne subtypes. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 26

27 Identifikation af nye influenza A virus stammer fra fugle eller svin Influenza A virus isolater fra fugle eller svin vil blive genetisk karakteriseret ved sekventering af hele virus genomet. Efterfølgende bioinformatiske analyser vil vise den fylogenetiske relation til øvrige virusstammer samt kunne identificere nye opstået influenza A virus stammer. Baggrund Influenza A virus er en gruppe af virus, der kan inficere en lang række dyr, herunder svin, fugle og mennesker. Generelt set er de influenzatyper, der cirkulerer inden for en population, arts-specifikke, hvilket betyder, at de virus, der cirkulerer i f.eks. svin og fugle normalt bliver i deres vært. Det har dog længe været kendt, at influenza A virus kan springe fra en dyreart til en anden, enten som overførsel af hele virus eller ved at lave nye virus ved at blande gener med andre virusstammer (såkaldte reassortments). Influenza A virus er en RNA virus, der består af i alt 8 gensegmenter (HA, NA, PB2, PB1, PA, NP, M, og NS) som tilsammen udgør hele virusgenomet på ca. 13,5 kb. Influenza A virus subtypes ud fra generne HA og NA, og svømmefugle, der anses for at være reservoir for influenza A virus, indeholder alle subtyper af de to gener (H1 til H16 og N1 til N9), men dog ikke alle kombinationer. Hos mennesker og svin er det hovedsagligt subtyperne H1N1, H1N2 og H3N2, der er isoleret. For at kunne opdage nye influenza A virus stammer, er det udover subtype bestemmelse også vigtigt at foretage kortlægning af hele virusgenomer, da nye virus fra tid til anden opstår ved reassortment eller genetisk skift, som f.eks. den nye pandemiske H1N1 (vh1n1) virus, der netop menes at være opstået som en blanding af minimum 2 forskellige svine influenzavirus. Projekt Projektarbejdet vil tage udgangspunkt i dyrkning af influenza A virus i cellekultur eller æg, for at opnå en høj koncentration af virus. For at kunne kortlægge influenzavirus genomet skal det sekventeres enten ved normal sanger sekventering eller high through put sequencing, der er en ny sekventeringsmetode. Inden sekventeringsarbejdet kan påbegyndes skal influenzavirus RNA genomet oprenses og forskellige PCR assay s anvendes dels til detektion af virus samt til sekventering. Efter endt sekventering skal de opnåede resultater databehandles ved forskellige bioinformatiske analyser som samling af sekvensdata (contigs), sammenligning (alignment) med andre virus sekvenser samt beregning af relation til andre virus (fylogenetisk træ). Det er alt sammen informationer, der kan belyse den molekylære epidemiologi af influenza A virus. Projektet vil koncentrere sig om udvalgte influenza A virus stammer, der kan stamme enten fra fugle eller svin, hvor der i svin kan være tale om almindelig cirkulerende virus subtyper eller den pandemiske H1N1 virus. Et projekt vil altså kun omhandle en udvalgt gruppe af influenza A virus, hvilket betyder, at projekter af forskellige størrelser kan opsættes. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 27

28 Overfører skadedyr virus mellem pelsdyr? Formålet med projektet er at undersøge om skadedyr og ektoparasitter kan spille en rolle for overførsel af virus i minkbesætninger. Lopper, flæskeklanner, fluer o.a. er almindeligt forekommende på danske mink farme og giver mange steder problemer i forbindelse med driften. Lopperne er også under mistanke for at bidrage til smittespredning af sygdomme herunder plasmacytose. Ved DTU Veterinærinstituttet er det ved PCR påvist, at lopper er inficeret med hvalpesygevirus lopper som er fundet på mink, der er smittet under epidemien Der saneres årligt mange pelsdyrhold i Nordjylland for plasmacytose, og for en del af dem lykkes det at blive fri for smitten på farmen. Men i enkelte farme ses der et persisterende forløb af sygdommen og en massiv smittespredning indenfor farmen mellem de enkelte dyr. Således kan 100% af de undersøgte dyr være smittet med plasmacytose allerede i august, selvom farmen er rengjort og desinficeret før indsætning af nye avlsdyr i ultimo februar. Formålet Vi ønsker at kortlægge skadedyrsproblemerne ved indsamling af konkrete og opdaterede oplysninger om forekomsten af skadedyr på farmene og undersøge skadedyrenes potentiale for overførsel af plasmacytose til mink. Endvidere skal denne undersøgelse vurdere loppers betydning for smittespredning af f.eks. plasmacytosevirus i en farm. Projektet Overførsel af plasmacytose fra skadedyr til mink undersøges ved at indsamle lopper fra udvalgte minkfarme, der har problemer med lopper. Farmene udvælges fra områder uden plasmacytose og fra farme, der har saneret for sygdommen. De indsamlede lopper fra plasmacytose-frie områder anvendes i et eksperimentelt forsøg, hvor overførsel af plasmacytosevirus afprøves ved hjælp af en allerede afprøvet smittemodel for plasmacytose. Der skal anvendes ca. 100 lopper pr. dyr, da nogle dør, og minkene piller ca. 50% af. De samles ind efter kontakt med dyrlæger, der har set problemet. I alt 8 mink smittes med plasmacytosevirus, og der overføres 100 lopper fra plasmacytose-frie farme til redekassen i dyrenes viræmiske fase. Efter ca. 14 dage aflives de eksperimentelt inficerede mink, og lopperne fjernes og føres over på 8 raske mink. Disse aflives efter ca. 3 uger med henblik på at detektere eventuel overførsel af virus. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 28

29 Fylogenetiske undersøgelser af infektiøs laryngotracheitis virus (ILTV) ILT virus (et herpesvirus) kan give anledning til voldsomme luftvejslidelser og er et problem i fjerkræ globalt. Det foreslåede projekt vil lave en molekylær biologisk karakterisering af ILTV virus diagnostificeret i Danmark med henblik på, at kortlægge epidemiologien af ILTV i Danmark. Denne viden er essentiel i bestræbelserne for at holde dette virus ude af de kommercielle besætninger. Baggrund I Danmark er sygdommen anmeldepligtig. Siden 1. juni 2010 har DTU Veterinærinstituttet modtaget i alt 20 indsendelser fra besætninger i forbindelse med klinisk mistanke om ILTV og 13 (65%) af indsendelserne var ILTV positive. Årsagen til de konstaterede udbrud i Danmark er ikke kendt. Hovedparten af de stammer, der isoleres fra udbrud i Europa og USA, stammer fra vaccinestammer, der har reverteret til virulens, men da de danske virus ikke er blevet karakteriseret nærmere, ved vi ikke, om de af kliniske udbrud af ILTV i Danmark skyldes vaccinevirus. Formålet med projektet er at implementere en metode til detaljeret karakterisering af ILTV virus isolater. Denne molekylærbiologisk karakterisering vil kunne anvendes som et molekylært fingeraftryk, som er unikt for et givent virusisolat og kan dels anvendes til at udrede om et givent udbrud skyldes vildtstammer eller reverterede vaccinestammer og dels til at spore oprindelsen af et udbrud. Projekt På baggrund af publicerede assays og alignments af gener fra gen-databaser vil et PCR assay blive designet som ideelt amplificerer et område af genet på baser idet dette område direkte kan sekventeres med PCR primerne. Hvis 500 baser ikke er nok til at give en valid karakterisering vil et større område af viruset blive inkluderet. Metoden vil i første omgang blive etableret ved analyse af det kendte isolat der pt. anvendes som positiv kontrol i laboratoriet. Metoder til DNA ekstraktion og PCR af ILTV er i etablerede rutiner i laboratoriet. Når metoden er etableret og valideret på et kendt positiv isolat vil vaccinestammen blive sekventeret direkte fra vaccinepreparationen. Endvidere vil arkiveret virus fra de 13 indsendelser, der har været positive siden vaccination blev indført i 2009, blive sekvenseret, Endelig vil ældre positive ILTV fra tiden før vaccination blive sekvenseret. Sekvenserne vil blive analyseret med standard bioinformatiske metoder (alignments og fylogenetiske træer), der er etableret og anvendes rutinemæssigt i laboratoriet. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 29

30 Karakterisering af Newcastle disease (ND) virus fra danske fugle Formålet med projektet er at klarlægge hvilke varianter af Newcastle disease (ND) virus, der cirkulerer i vilde fugle i Danmark. ND virus er årsag til alvorlige, tabsvoldende virusinfektioner i fugle og fjerkræ. Der kendes forskellige varianter af virus, som giver varierende grader af sygdom, og nye varianter opstår som følge af dette RNA virus høje mutationsfrekvens. Der pågår karakterisering af virus i mange af vores omkringliggende lande, mens der kun er sparsom viden om de ND virus, der nu cirkulerer i Danmark. I dette projekt skal nyere danske ND virus karakteriseres ved hjælp af PCR, sekvensanalyse og fylogenetiske analyser. Baggrund Newcastle disease (ND) er en alvorlig, tabsvoldende virusinfektion hos fjerkræ, der skyldes infektion med avian paramyxovirus type 1 (apmv-1). De kliniske symptomer er influenzalignende sygdom. Virus findes i forskellige varianter og giver forskellig grad af sygdom, fra helt asymptomatiske infektioner til udbrud med akut dødelighed. Vilde fugle kan være asymptomatiske bærere af virus, der imidlertid kan give anledning til alvorlig sygdom, hvis de kommer ind i en fjerkræbesætning. apmv-1 virus betegnes ofte som Newcastle disease virus (NDV), hvis de giver anledning til sygdommen Newcastle disease (ND) i fjerkræ. Diversiteten af virus er stor, og virus inddeles i typer og undertyper på baggrund af deres genomsekvenser. På verdensplan er der stor bevågenhed overfor opdukken af nye varianter af virus, idet kendskabet til cirkulerende virus er afgørende for korrekt diagnostik og kontrol af virus. Formålet med projektet er at klarlægge hvilke varianter af apmv-1, der cirkulerer i vilde fugle i Danmark, ved genetisk karakterisering af nutidige virus isoleret fra fugle i den danske fauna. Projekt 1. Etablering af metode til karakterisering af Newcastle disease (ND) virus. På baggrund af publicerede assays og alignments af sekvenser fra sekvensdatabaser udvælges eller designes et eller flere PCR assays, der kan amplificere områder af virusgenomet, der er anvendelige til fylogenetiske studier. Metoden implementeres i første omgang på ND virus strain La Sota. 2. Karakterisering af danske Newcastle disease (ND) virus. Virusisolater, der er isoleret fra danske fugle i de senere år, sekventeres med den etablerede metode. Epidemiologien af ND virus undersøges ved at sammenholde sekvenserne med tilsvarende virussekvenser fra andre lande og ældre danske isolater. Hertil anvendes fylogenetiske analyser. Undersøgelserne kan udvides med screening for ND virus af prøver fra fugle indsamlet i Hertil anvendes de diagnostiske real-time RT-PCR assays, der anvendes rutinemæssigt i laboratoriet. Nye virus karakteriseres ved sekventering og fylogenetisk analyse. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 30

31 Etablering af real time PCR assay til påvisning af Porcin reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV) Porcint reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV) er en udbredt årsag til sygdom i svin verden over, og en af de mest tabsvoldende infektioner i den danske svineproduktion. PRRSV er et 15 kb RNA virus med en høj mutationsrate, hvilket betyder, at der nemt opstår genetisk forskellige varianter af virus. Dette stiller store krav til design af diagnostsike PCR assay til PRRSV. I projektet etableres og valideres et i litteraturen beskrevet assay mod PRRSV Baggrund Infektion med PRRSV kontrolleres med vaccination eller besætningsdriftsstrategier, baseret på korrekt diagnostik og information om virus genetiske arvemateriale. PRRSV er et RNA virus, som er meget tilbøjeligt til at ændre sig ved mutationer, så der opstår varianter af virus, der er genetisk forskellige. Virusvarianterne kan have forskellige sygdomsfremkaldende egenskaber. Nye fatale varianter af PRRSV er for nyligt kædet sammen med udbrud af high fever disease i Kina, hvor mere end 2 milliarder svin blev angrebet af virus, og hvoraf døde. Situationen er endnu ikke helt under kontrol. Nye virusvarianter er også fundet i Østeuropa, og det er uvist om disse har bredt sig til danske svin. I forbindelse med en ringtest blev det dokumenteret, at valg af assay har stor betydning for hvilke stammer af virus, der kan påvises, og det anbefales pt at anvende flere end et assay. Formålet med dette projekt er at validere et allerede beskrevet real time PCR assays til detektion af PRRSV Projekt Det nye real time PCR assays skal først testes in silico ved sammenligning (alignment) af kendte PRRSV sekvenser samt ved brug af et real time PCR design software. Projektarbejdet vil indebære oprensning af PRRSV RNA genom, opsætning og udførelse af real time PCR, test af sensitivitet og specifitet overfor en række forskellige PRRSV stammer og genotyper ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 31

32 Molekylær karakterisering af Porcin reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV) Porcint reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV) er en udbredt årsag til sygdom i svin verden over, og en af de mest tabs-voldende infektioner i den danske svineproduktion. PRRSV er et 15 kb RNA virus med en høj mutationsrate, hvilket betyder at der nemt opstår genetisk forskellige varianter af virus, som kan have forskellige egenskaber. I projektet bestemmes fuldlængde sekvensen af virus og denne analyseres fylogenetisk. Baggrund Infektion med PRRSV kontrolleres med vaccination eller besætningsdriftsstrategier, baseret på korrekt diagnostik og information om virus genetiske arvemateriale. PRRSV er et RNA virus, som er meget tilbøjeligt til at ændre sig ved mutationer, så der opstår varianter af virus, der er genetisk forskellige. Virusvarianterne kan have forskellige sygdomsfremkaldende egenskaber. Nye fatale varianter af PRRSV er for nyligt kædet sammen med udbrud af high fever disease i Kina, hvor mere end 2 milliarder svin blev angrebet af virus, og hvoraf døde. Situationen er endnu ikke helt under kontrol. Nye virusvarianter er også fundet i Østeuropa, og det er uvist om disse har bredt sig til danske svin. Valg af en effektiv vaccinationsstrategi og metoder til påvisning af virusinfektion afhænger af et nøje kendskab til virus arvemateriale. Der er imidlertid kun sparsomt kendskab til den genetiske diversitet af virus i danske svin. Projektets formål er at opnå et bedre kendskab til den genetiske diversitet af PRRSV i Danmark. Resultaterne skal benyttes til at opnå bedre kontrol med sygdommen og danne basis for udvikling af nye og bedre diagnostiske tests og vacciner. Projekt Projektet går ud på at fuldlængde sekventere PRRSV et eller flere danske virus ved hjælp af publicerede/etablerede assays. Sekvensen sammenlignes med publicerede fuldlængde sekvenser og analyseres fylogenetisk. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 32

33 Spyt til diagnostik af luftvejsinfektioner i svin Formålet med projektet er at validere anvendelsen af oral fluid ( spyt ) til diagnostik af patogener med real-time PCR i svinebesætninger. Spyttet indsamles ved at ophænge bomuldsreb i stier i svinebesætninger og lade grise tygge på dette i 30 min. Spyttet vrides herefter ud af rebet og testes for tilstedeværelsen af svinepatogener som svineinfluenzavirus (SIV) og Porcint reproduktions og respiratorisk syndrom virus (PRRSV), som er udbredte årsager til sygdom hos svin i Danmark. I dette projekt skal spyt indsamles i danske svinebesætninger og analyseres ved hjælp af real-time PCR. Resultaterne sammenholdes med testresultater på klassiske prøvematerialer som næsesvabere, blod og væv. Oral fluid er den væske der findes i mundhulen. Den består af en blanding af spyt og mukosalt transsudat og indeholder både patogener og antistoffer. I mennesker anvendes den udbredt til test for en række infektioner, f.eks. HIV og mæslinger. Forskning har vist, at oral fluid også kan anvendes til detektion af PRRSV, PCV2, SIV og M.hyopneumoniae infektioner i svin. Oral fluid ( spyt ) har den fordel, at det er nemt og hurtigt at indsamle og repræsenterer en større gruppe af dyr. Projekt 1. Indsamling af prøver Spytprøver indsamles i danske svinebesætninger i samarbejde med besætningsdyrlægen. 2. Test af prøver. Til test af spytprøverne anvendes real-time PCR metoder som er valideret til analyse af spyt. 3. Dataanalyse. Resultaterne på spytprøverne sammenholdes med resultaterne på klassiske materialetyper. ECTS: Fleksibelt Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 33

34 Gode ideer til andre projekter virusinfektioner hos hest mm! Har du selv en god ide eller en problemstilling, du synes kunne være interessant at kigge nærmere på, er du mere end velkommen til at kontakte os vi er altid rede til at kaste os over noget nyt, hvis vi finder, at der er substans i ideen/hypotesen. Vi har endvidere etableret en række assays for hestevirus (EAV, influenza m.m.), så hestevirus projekter kan også gennemføres dog er der ikke interne midler til rådighed, så projekter der kræver store ressourcer skal finansieres via legater eller direkte støtte fra medicinalfirmaer eller lign. Henvendelse til professor Lars Erik Larsen lael@vet.dtu.dk, postdoc Solvej Østergaard Breum sbre@vet.dtu.dk, Sektion for Virologi, og forsker Charlotte Hjulsager ckhj@vet.dtu.dk, Sektion for Myndighedsbetjening, Beredskab og Kommerciel diagnostik 34

35 Sektion for Virologi - Lindholm Modulation of virus translation initiation efficiency The aim of this project will be to modulate translation initiation efficiency in classical swine fever virus Modulation of translation initiation efficiency on classical swine fever virus (CSFV) RNA can be achieved by targeted mutations within the internal ribosome entry site (IRES). To analyze the effect of IRES modifications on translation our laborarory have employed a di-cistronic reporter system, which allows us to estimate the IRES activity through the expression of the reporter protein Renilla luciferase and at the same time correct for differences in transfection efficiency through the expression of the second reporter protein, Firefly luciferase (figure 1). Modifications in the IRES sequence are generated by PCR and inserted into the reporter vector by standard digestion/ligation procedures. To facilitate the production of reporter mrna, both reporter genes are under the transcriptional control of a T7 promoter. This allows us to generate mrna, encoding the two reporter proteins, in BHK cells infected with T7 polymerase expressing vaccinia-virus. Utilizing the translation machinery of the BHK cells, cap-dependent Fluc expression is obtained, whereas the expression of Rluc depends on the IRES initiation efficiency. This strategy allows for a fast and efficient way to characterize the translational importance of the different domains within the IRES. Significance: Reporter plasmids can be used to easily and efficiently characterize the translation efficiency of modified IRES elements, which can used to identify critical elements of virus translation and broaden our understanding of the viral lifecycle. Techniques: Standard molecular biology techniques Transient expression Luciferase luminescence Western blotting. ECTS points: Contact: Senior scientist Thomas Bruun Rasmussen, tbrur@vet.dtu.dk, phone Place: DTU Vet, Lindholm, Kalvehave Figure 1: The dicistronic reporter construct 35

36 Characterization of bioengineered pestiviruses The aim of this project will be to develop new bioengineered pestiviruses and characterize these in terms of genetic stability, replication kinetics, virus growth etc. Infectious cdna clones are a prerequisite for directed genetic manipulation of pestivirus RNA genomes. At DTU Vet Lindholm, we have developed a novel strategy to facilitate manipulation and rescue of modified pestiviruses from infectious cdna clones based on bacterial artificial chromosomes (BACs). The strategy involves targeted modification of viral cdna genomes, cloned within BACs, by Red/ET recombination-mediated mutagenesis in E. coli DH10B cells. Using recombination-mediated mutagenesis for the targeted design, the work can be expedited and focused in principal on any sequence within the viral genome and hence is not limited to the use of internal restriction sites. Rescue of modified pestiviruses can be obtained by electroporation of cell cultures with full-length RNA transcripts in vitro transcribed from the recombined BAC clones. We have used this approach to generate a series of new pestivirus BACs modified within different genomic regions and infectious pestiviruses have been rescued from several of these new constructs, demonstrating that recombination-mediated mutagenesis of pestivirus BACs provides a useful tool for expediting the construction of recombinant pestiviruses. Significance: Bioengineered pestiviruses can be utilized for a variety of applications such as vaccine development, screening for antiviral drugs and for identification of essential components in the pestivirus lifecycle. Techniques: Standard molecular biology techniques including nucleotide sequencing Recombination-mediated mutagenesis Rescue of modified viruses by electroporation Characterization of virus replication by quantitative PCR and fluorescence microscopy ECTS: Contact: Senior scientist Thomas Bruun Rasmussen, tbrur@vet.dtu.dk, phone Place: DTU Vet, Lindholm, Kalvehave Fluorescence microscopy of bioengineered pestivirus 36