Denne vejledning gælder for Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+).

Transkript

1 Dako EnVision + Dual Link System-HRP (DAB+) Kode K4065 Tilsigtet anvendelse Anvendes til in vitro diagnostik. Denne vejledning gælder for Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+). Sættet er beregnet til anvendelse sammen med primære antistoffer fra mus og kanin, som brugeren leverer, ved kvalitativ identifikation af antigener ved hjælp af lysmikroskopi i normalt og patologisk paraffinindstøbt væv, kryostatvæv eller cellepræparater. Væv, som er behandlet i fiksativer såsom ethanol, B-5, Bouin s, zinkformalin og neutral bufferet formalin, kan anvendes. Resumé og forklaring Principper for proceduren Leverede reagenser EnVision+ Dual Link System-HRP er en IHC-farvningsteknik i to trin. Systemet er baseret på en HRP-mærket polymer, som er konjugeret med sekundære antistoffer. Den mærkede polymer indeholder hverken avidin eller biotin. Følgelig elimineres uspecifik farvning, der er et resultat af endogen avidin-biotin-aktivitet i lever, nyrer, lymfevæv og kryostatsnit, eller den reduceres betydeligt. Alle reagenser i EnVision+ Dual Link System-HRP med substrat (undtagen Liquid DAB+ Substrate-Chromogen) er klar-til-brug. Systemet udgør en yderst følsom metode, hvilket resulterer i, at optimale fortyndinger af det primære antistof kan være op til 20 gange højere end dem, der anvendes ved den traditionelle PAP-teknik og adskillige gange større end dem, der anvendes ved de traditionelle ABC- eller LSAB-metoder. Denne protokol omfatter et forbedret signalgenereringssystem til påvisning af de antigener, der findes i lave koncentrationer, eller til primære antistoffer med lav titer. Primære antistoffer, der er dyrket i mus eller kaniner, reagerer godt på den mærkede polymer. Fortolkningen af en eventuel positiv farvning eller mangel på samme skal sammenholdes med morfologiske og histologiske undersøgelser med korrekte kontroller. Enhver endogen peroxidaseaktivitet standses ved at inkubere præparatet i 5 10 minutter med Dual Endogenous Enzyme Block. Præparatet inkuberes derefter med et korrekt karakteriseret og fortyndet, primært muse- eller kaninantistof, efterfulgt af inkubation med den mærkede polymer, idet det anbefales at anvende 30 minutters inkubation af begge. Bemærk, at det ved antistoffer, som kræver enzymfordøjelse eller targetretrieval, kan være nødvendigt at øge inkubationstiden for det primære antistof og den mærkede polymer med 5 til 10 minutter. Farvningen afsluttes med inkubation i 5 10 minutter med 3,3 -diaminobenzidin (DAB+) substratkromogen, hvilket resulterer i en brunfarvet udfældning på antigenstedet. (DAB er et potentielt karcinogen, se afsnittet Forholdsregler). Kode K4065 Følgende materialer, der rækker til 150 vævssnit baseret på 100 µl pr. snit, er indeholdt i dette sæt: Mængde 1x15 ml Beskrivelse Dual Endogenous Enzyme Block 0,3% hydrogenperoxid indeholdende natriumazid og levamisol. 1x15 ml Labelled Polymer Peroxidasemærket polymer konjugeret til ged anti-mus og ged anti-kanin immunglobuliner i Tris-HCl-buffer indeholdende stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. 1x18 ml Substrate Buffer Substratbufferopløsning, ph 7,5, indeholdende hydrogenperoxid og et konserveringsmiddel. 1x1 ml DAB+ Chromogen 3,3'-diaminobenzidin kromogenopløsning. ( ) P04048DK_01/K4065/ s. 1/6

2 Nødvendige materialer, der ikke medfølger Forholdsregler Deioniseret eller destilleret vand Ethanol, absolut og 95% Xylen, toluen eller xylenerstatninger Primære antistoffer og negativt kontrolreagens Objektglas, poly-l-lysin-belagte eller Silanized Slides (kode S3003) (se Paraffinindstøbte vævssnits adhæsion) Kontrolvæv, positivt og negativt Ammoniumhydroxid, 15 mol/l fortyndet til 0,037 mol/l Kontrastfarve, vandbaseret, såsom Mayer s Hematoxylin eller Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (kode S3002 til automatiseret brug, kode S3001 til manuel brug) (se afsnittet Klargøring af reagenser) Faramount, Aqueous Mounting medium, Ready-to-use (kode S3025) anbefales til vandig montering, eller ikkevandigt permanent monteringsmedium, Ultramount (kode S1964) eller Permanent Mounting Medium (kode S3026) Dækglas Lysmikroskop (20x 800x) Absorberende servietter Farvningsglas eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 3 40 minutter) Vaskeflasker Vaskebufferopløsning såsom Automation Buffer (kode S3006), TBS (kode S3001) eller PBDS (kode S3024) 1. Må kun anvendes af uddannet personale. 2. Produktet indeholder natriumazid (NaN 3), et kemikalie, der er yderst giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan natriumazid reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Ved bortskaffelse skal der skylles med store mængder vand for at forhindre metalazidophobninger i rørene. 3. Udskift ikke med reagenser fra andre partier eller fra systemer fra andre producenter. 4. Enzymer og substrat-kromogener kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke sættets komponenter, og udfør ikke farvning i stærkt lys, f.eks. direkte sollys. 5. Andre inkubationstider eller temperaturer end de angivne kan give fejlbehæftede resultater. Sådanne ændringer skal bekræftes af brugeren Som med alle produkter afledt ud fra biologiske kilder bør der iagttages korrekte håndteringsprocedurer. 7. Brug egnet personligt beskyttelsesudstyr for at undgå kontakt med øjne og hud. 8. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal og national lovgivning. 9. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. Fare Dual Endogenous Enzyme Block: <0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl- 3(2H)-isothiazolone H314 Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. H317 Kan forårsage allergisk hudreaktion. P280 Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. P261 Undgå indånding af damp. P264 Vask hænder grundigt efter brug. P272 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P330 + P331 P303 + P361 + P353 + P363 + P310 P302 + P352 P333 + P313 P305 + P351 + P338 + P310 P405 P501 Tilsmudset arbejdstøj bør ikke fjernes fra arbejdspladsen. VED INDÅNDING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vedkommende hviler i en stilling, som letter vejrtrækningen. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Skyl munden. Fremkald IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl/brus huden med vand. Tilsmudset tøj skal vaskes, før det kan anvendes igen. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. VED KONTAKT MED HUDEN: Vask med rigeligt vand/ Ved hudirritation eller udslet: Søg lægehjælp. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Opbevares under lås. Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. ( ) P04048DK_01/K4065/ s. 2/6

3 Fare DAB+ Chromogen: 1 5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P202 Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P280 Brug egnede beskyttelseshandsker. Bær beskyttelse til øjne og ansigt. Brug særligt arbejdstøj. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet og beholderen bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale, nationale og internationale regler. Som hovedregel må personer under 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugerne skal instrueres grundigt i den korrekte arbejdsprocedure, produktets farlighed og de nødvendige sikkerhedsforanstaltninger. Opbevaring Reagenser til EnVision+ Dual Link System-HRP skal opbevares ved 2 8 C. Må ikke nedfryses. Må ikke anvendes efter udløbsdatoen, som er trykt på reagensglassene og etiketten på sættet. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de specificerede, skal betingelserne verificeres af brugeren. 1 Ændringer i reagensernes udseende (f.eks. bundfald) kan være tegn på ustabilitet eller nedbrydning. I så fald må reagenset/reagenserne ikke anvendes. Der er ingen synlige tegn på, at produkterne kan være ustabile. Derfor skal der inkluderes positive og negative kontroller samtidig med patientprøver. Hvis der observeres en uventet farvning, som ikke kan forklares med forskelle i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et defekt sæt, kontaktes Dakos tekniske support. Klargøring af præparater Klargøring af reagenser Inden immunfarvningen skal vævene fikseres og behandles. Fiksering forhindrer autolyse og forrådnelse af det udtagne væv, bevarer antigenicitet, forbedrer det refraktive indeks af vævsbestanddelene og øger de cellulære elementers resistens over for vævsbehandling. Vævsbehandling omfatter dehydrering, klaring af dehydreringsmidlerne, imprægnering i indstøbningsmedie, indstøbning og skæring af vævet. Ovenstående er kun ment som en vejledning. De bedste procedurer skal fastlægges og kontrolleres af brugeren. Specifikke oplysninger vedr. vævsfiksering og -behandling findes i Dakos "General Instructions for Immunohistochemical staining" (Generel vejledning i immunhistokemisk farvning). Vaskebufferopløsning Undersøgelser har vist, at 0,05 mol/l Tris-HCl, ph 7,6, indeholdende 0,15 mol/l NaCl og 0,05% Tween 20, uden natriumazid, i høj grad bidrager til at minimere baggrundsfarvning med dette system. Automation Buffer (kode S3006) anbefales som vaskebuffer. Vaskebuffere, der indeholder natriumazid, deaktiverer peberrodsperoxidase og medfører negativ farvning. Ubrugt buffer skal opbevares ved 2 8 C. Kassér buffe ren, hvis den er uklar. MANUEL FARVNING Vævssnittene skal vaskes i op til tre friske bade med Automation Buffer (kode S3006), TBST (kode S3001) eller PBS (kode S3024) i 3 5 minutter mellem hvert trin af EnVision+ Dual Link System-farvningsprotokollen. Primært antistof Klar-til-brug antistoffer for EnVision+ Dual Link System kan fås fra Dako. Koncentrerede antistoffer fås også fra Dako. Optimale fortyndinger skal imidlertid bestemmes eksperimentelt af brugeren. På grund af EnVision+ Dual Link Systems høje sensitivitet, kan fortyndingen af primære antistoffer være i området fra 5 til 20 gange større, end dem der anvendes ved traditionelle IHC-metoder. Hvis der skal anvendes koncentrerede antistoffer, skal fortyndinger klargøres med Antibody Diluent (kode S0809). En inkubationstid på 30 minutter er tilstrækkelig for de fleste primære antistoffer, der anvendes sammen med sættet. Negativt kontrolreagens Et ideelt negativt kontrolreagens skal indeholde et antistof, der ikke udviser en specifik reaktivitet over for humant væv eller normalt/ikke-immunt serum i den samme matrix/opløsning som det fortyndede primære antistof. Det negative kontrolreagens skal være af samme underklasse og dyreart som det primære antistof, fortyndet til den samme immunglobulin- eller proteinkoncentration som det fortyndede primære antistof med samme fortynder. inkubationsperioden for det negative kontrolreagens skal svare til den, der gælder for det primære antistof. For nemheds skyld kan et universelt negativt kontrolreagens for primære museantistoffer og et universelt negativt kontrolreagens for primære kaninantistoffer fås fra Dako, leveret som klar-til-brug produkter. For specifik information med hensyn til klargøring af negative kontrolreagenser, se Dakos "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Generel vejledning i immunhistokemisk farvning). ( ) P04048DK_01/K4065/ s. 3/6

4 Substratkromogenopløsning Nedenstående protokol til klargøring af 1 ml DAB+ substratkromogenopløsning er tilstrækkelig til op til 10 vævssnit eller op til 5 celle-smears. TRIN 1 TRIN 2 Afhængigt af hvor mange objektglas, der skal farves, overføres en tilstrækkelig mængde 1 ml alikvoter substratbuffer til en beholder af passende størrelse. For hver 1 ml buffer, tilsættes en dråbe (20 µl) flydende DAB+ kromogen. Blandes øjeblikkeligt. Den klargjorte DAB+ substratkromogenopløsning er stabil i ca. fem dage, hvis den opbevares ved 2 8 C. Opløsningen skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. Hvis de bruges helt op, vil de leverede 18 ml substratbuffer give en volumen, der er tilstrækkelig til 150 analyser. Der kan forekomme en restmængde. Monteringsmedium Faramount, Aqueous Mounting Medium, klar-til-brug (kode nr. S3025) anbefales til vandig montering. Anvend Ultramount (kode S1964) eller Permanent Mounting Medium (kode S3026) til permanent montering. Farvningsprocedure Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med sættets indhold inden brug. Se afsnittet Forholdsregler. Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution og EnVision+ Dual Link System-polymeren skal have stuetemperatur inden immunfarvningen. Ligeledes er alle inkubationer optimeret med hensyn til effekt ved stuetemperatur. Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige resultater. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise en øget uspecifik farvning. Tildæk objektglas, som udsættes for træk. Hvis der anvendes lange inkubationstider, skal vævet anbringes i et fugtigt miljø. Sensitiviteten for EnVision+ Dual Link System-HRP kan øges yderligere ved at forlænge inkubationstiderne i trin 2 og 3 med 5 10 minutter. MANUEL FARVNINGSPROTOKOL TRIN 1 ENDOGEN ENZYMBLOKKER Bank overskydende buffer af. Brug en fnugfri klud (f.eks. Kimwipe eller gaze), og tør forsigtigt rundt om præparatet for at fjerne eventuel overskydende væske og holde reagenset inden for det foreskrevne område. Tilsæt Dual Endogenous Enzyme Block, så præparatet er dækket. Inkubér i 5 10 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret vand eller bufferopløsning fra en vaskeflaske (undgå at vandet/opløsningen rammer vævet direkte), og anbring det i et bad med frisk buffer. TRIN 2 PRIMÆRT ANTISTOF ELLER NEGATIVT KONTROLREAGENS Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Påfør en tilstrækkelig mængde optimalt fortyndet primært antistof eller negativt kontrolreagens, så præparatet er dækket. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med bufferopløsning fra en vaskeflaske (undgå at opløsningen rammer vævet direkte), og anbring det i et bad med frisk buffer. Hvis farvningsproceduren skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i et bufferbad efter inkubation af det primære antistof (trin 2) i maks. 1 time ved stuetemperatur, uden at farvningsfunktionen påvirkes. TRIN 3 MÆRKET POLYMER-HRP Bank overskydende buffer af, og tør objektglassene som ovenfor beskrevet. Tilsæt en tilstrækkelig mængde mærket polymer, så præparatet er dækket. Inkubér i 30 (±1) minutter. Skyl objektglassene som i trin 2 og anbring dem i et bad med buffer i 5 (±1) minutter. TRIN 4 SUBSTRATKROMOGEN Tør objektglassene som oven for beskrevet. Tilsæt en tilstrækkelig mængde substratkromogenopløsning, så præparatet er dækket (se afsnittet Klargøring af reagenser). Inkubér i 5 10 (±1) minutter. Skyl forsigtigt med destilleret vand fra en vaskeflaske (undgå at vandet rammer vævet direkte). Affald fra substratkromogen opsamles i en beholder til farligt materiale og bortskaffes på korrekt vis. TRIN 5 HÆMATOXYLIN KONTRASTFARVE (valgfri) Nedsænk objektglassene i et bad med vandig hæmatoxylin. Inkubationstidens længde afhænger af styrken på den anvendte hæmatoxylin. Skyl forsigtigt i et bad med destilleret vand. Dyp objektglassene 10 gange i et bad med 0,037 mol/l ammoniak eller et lignende blånelsesmiddel. Skyl objektglassene i et bad med destilleret eller deioniseret vand i 2 5 minutter. Gå videre til montering. ( ) P04048DK_01/K4065/ s. 4/6

5 Montering Præparaterne kan monteres og forsynes med dækglas ved anvendelse af et vandbaseret monteringsmedium, såsom Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (kode S3025). Anvend Ultramount (kode S1964) eller Permanent Mounting Medium (kode S3026) til permanent montering. Bemærk: Objektglassene kan aflæses når som helst. Farven kan imidlertid falme en smule, hvis objektglassene udsættes for stærkt lys i en uge. Dette kan minimeres ved at opbevare objektglassene mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). Kvalitetskontrol Forskelle i vævsbehandlingen og de tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. I kvalitetskontrolvejledningen i American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry og reference 3 til 5 findes der yderligere oplysninger. I specifikationsarket for hvert af de anvendte primære antistoffer findes oplysninger om sensitivitet og immunoreaktivitet. Se Dakos "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Generel vejledning i immunhistokemisk farvning) for yderligere oplysninger om positive og negative kontroller. Fortolkning af farvningen Generelle begrænsninger Produktspecifikke begrænsninger I Dakos "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Generel vejledning i immunhistokemisk farvning) findes retningslinjer for fortolkning. I Dakos "General Instructions for Immunohistochemical Staining" (Generel vejledning i immunhistokemisk farvning) findes generelle begrænsninger. Anvendelse af gamle eller ikke-bufferede fiksativer eller udsættelse af væv for høj varme (højere end 60 C) under behandlingen kan medføre en reduceret farvningssensitivitet. Fejlfinding MANUEL Endogen peroxidase- eller pseudoperoxidase-aktivitet kan ses i hæmoproteiner, såsom hæmoglobin, myoglobin, cytokrom og catalase samt i eosinofiler. 2,3 Denne aktivitet kan hæmmes ved inkubation af præparater med Dual Endogenous Enzyme Block fra EnVision+ Dual Link System-HRP i 5 10 minutter inden tilsættelse af det primære antistof. Blod- og knoglemarv-smear samt frosne vævsprøver kan ligeledes behandles med dette reagens. Alternativt kan en opløsning af methanol-hydrogenperoxid anvendes. Visse antigener kan blive denatureret med denne procedure. Vævsprøver fra personer, som er inficerede med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg), kan udvise uspecifik farvning med peberrodperoxidase. 4 Normalt/ikke-immunt serum fra de samme dyrekilder som det sekundære antiserum, der anvendes i blokeringen, kan medføre fejlagtigt negative eller fejlagtigt positive resultater, der skyldes autoantistoffer eller naturlige antistoffer. Reagenserne i dette sæt leveres i den optimale fortynding. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigendetektion. Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen farvning af objektglas. 1a. Reagenserne anvendes ikke i den korrekte rækkefølge. 1a. Gennemgå tilsættelsen af reagenser. 2. Svag farvning af alle objektglas. 3. For høj baggrundsfarvning af alle objektglas. 1b. Natriumazid i bufferbadet. 1b. Brug frisk buffer uden azid. 2a. Der er for meget opløsning tilbage i snittene efter vaskebadet. 2b. Objektglassene er ikke inkuberet længe nok med antistoffer eller substrat. 3a. Prøverne indeholder en høj peroxidaseaktivitet. 3b. Paraffinen er ikke helt fjernet. 3c. Objektglassene er ikke skyllet ordentligt. 3d. Hurtigere substratreaktion end normalt, f.eks. på grund af for høj stuetemperatur. 3e. Snittene er tørret ud under farvningen. 2a. Bank forsigtigt overskydende opløsning af, inden der tørres rundt omkring snittet. 2b. Gennemgå de anbefalede inkubationstider. 3a. Anvend længere inkubationstid med Dual Endogenous Enzyme Block. 3b. Anvend friske xylen- eller toluenbade. Hvis flere objektglas farves samtidigt, skal det andet xylenbad indeholde frisk xylen. 3c. Anvend friske opløsninger i bufferbade og vaskeflasker. Anvend Automation Buffer som vaskebuffer (se afsnittet Klargøring af reagenser). 3d. Anvend kortere inkubationstider med substratkromogenopløsning. 3e. Anvend fugtkammer. Tør kun tre til fire objektglas af ad gangen, inden der tilsættes reagens. ( ) P04048DK_01/K4065/ s. 5/6

6 3f. Uspecifik reagensbinding til vævssnittet. 3f. Tilsæt en blokeringsopløsning, der indeholder et irrelevant protein (se afsnittet Fortolkning af farvning). 3g. Antistoffet er for 3g. Anvend en større fortynding af det primære koncentreret. antistof. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. Yderligere oplysninger om farvningsteknikker og klargøring af prøvepræparater kan ses i Handbook Immunochemical Staining Methods 5 (kan fås hos Dako), Atlas of Immunohistology 6 og Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 Referencer 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Code C24-A:4 2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook-immunochemical staining methods. Carpinteria 3rd Edition. Dako Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Yderligere referencer Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 07/15 ( ) P04048DK_01/K4065/ s. 6/6